本发明涉及药物筛选领域，尤其涉及一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法。
背景技术：
bcr-abl酪氨酸激酶是蛋白激酶的一种，它是由bcr-abl致癌基因所表达。bcr-abl致癌基因是由染色体9上的abelson(abl)基因和染色体22上的breakpointcluster(bcr)基因相互重排而形成。bcr-abl酪氨酸激酶的持续活性是导致慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukaemia，cml)的原因。增强的激酶活性承担细胞内的磷酸化和多种信号分子的激活，这些功能加速了细胞的增殖同时抑制了细胞的凋亡。因此，对bcr-abl酪氨酸激酶活性的抑制是靶向治疗cml的有效途径。
伊马替尼是2001年fda首次批准治疗cml的药物，也是第一个激酶抑制剂。bcr-abl酪氨酸激酶是典型的会对cml病人产生耐药性的激酶。超过100个位点突变被发现对一代药物伊马替尼(imatinib)的治疗具有耐药性。由于耐药性的产生，使得针对bcr-abl酪氨酸激酶药物开发进入后伊马替尼时代(post-imatinibera)以对抗耐药性。在后伊马替尼时代，两种第二代药物尼罗替尼(nilotinib)和达沙替尼(dasatinib)具有更强的药效，更重要的是，这两种药物能够对bcr-abl耐药性突变体保持抑制作用。然而，这两种药物都不能抑制耐药t315i激酶突变体。这使得第三代药物普纳替尼(ponatinib)的开发与产生，并在2012年12月获得美国fda批准上市。普纳替尼是第一种泛bcr-abl激酶抑制剂(pan-bcr-ablkinaseinhibitor)，它能抑制所有已知的抗伊马替尼的突变体，包括t315i突变体。然而，近些年研究表明，普纳替尼具有严重的副作用，因此，临床上急需比普纳替尼具有更好药效和更高特异性的药物。
尽管针对abl-bcr酪氨酸激酶的药物开发取得了很大的进展，例如第三代药物普纳替尼的开发，但新的耐药性位点突变的可能性依然存在。这促使必须持续地开发更加有效的抑制剂。同时，每一种抑制剂会产生它自身的耐药性突变谱，cml病人同时使用多个抑制剂能够获得更好的疗效。另外，目前治疗cml的靶向药物价格昂贵，这就需要我们能够设计出比普纳替尼具有更好的药效和抗耐药性并且价格较低的替代药物。因此，开发全新的抑制剂以改善和提高现有的疗效对于cml的治疗依然非常紧迫，尤其是开发能够抑制t315i突变体的第三代泛abl-bcr激酶抑制剂。
发现能够与靶蛋白有潜在识别能力和相互作用的先导化合物(leadcompound)是前期药物开发(drugdiscovery)的关键，研究和理解蛋白质与小分子的识别和相互作用机制对新药开发与设计有着直接的应用。小分子高效且特异地结合其靶蛋白取决于两个方面，一是结合亲和力(affinity)，二是结合特异性(specificity)。亲和力是指蛋白质-小分子结合复合物的稳定性，特异性是指小分子偏好于与靶蛋白结合而不与其他蛋白结合。高的亲和力并不能保证高的特异性，而特异性是避免药物分子副作用的关键。在筛选和设计一个新药时，预期的效果是新药能有效地与靶蛋白结合，同时又尽量少地与其它蛋白发生作用，从而避免副作用的产生。因此量化蛋白质与小分子结合的特异性对新药的开发与设计至关重要。目前，对蛋白质-小分子相互作用的理论计算与实验测定主要是量化其亲和力的大小，而忽略了对特异性的考虑。这是因为特异性的量化非常困难。特异性包括热力学特异性(thermodynamicspecificity)和动力学特异性(kineticspecificity)。热力学特异性的量化需要比较一个小分子与所有蛋白之间的结合亲和力，这在现有的数据信息和实验条件下，是难以实现的。动力学特异性是指小分子在蛋白质上的停留时间(residencetime，rt)。虽然实验技术可以批量测定小分子停留时间以量化动力学特异性，但在资金和小分子测定数量上还是有限。在理论计算上，利用分子动力学模拟计算大量的蛋白质-小分子复合物的动力学停留时间仍然非常具有挑战性。因此，提供更为有效的筛选abl-bcr激酶抑制剂的方法以期节约成本，且得到活性较高的药物是目前需要解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法，本发明提供的筛选方法不仅筛选效率高，而且得到的抑制剂的活性高。
本发明提供了一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法，包括：
1)将通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子和对接靶标进行对接，然后采用打分函数spa对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，得到靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性值e；
2)利用步骤1)得到的亲和性值e，结合热力学特异性公式和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值，
其中，所述热力学特性公式为：
δe为最低能量与平均能量差，即δe＝en-<e>，
δe为能量涨落，即(<e2>-<e>2)1/2；
所述动力学特性公式为：
f(r)为不同结合位置r上的亲和性值，
kb，t以及d(r)设为常数；
3)对得到的小分子的亲和性值e、热力学特异性isr值和动力学特异性rt值进行归一化处理得到小分子的pe，pisr，prt，然后对三者加和得到小分子多维参数s，将得到的小分子多维参数s与普纳替尼的多维参数进行比较，得到具有式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂，
其中，r1为式(r1-1)、式(r1-2)或式(r1-3)，
r2为c5～c8的含氮芳香基。
优选的，所述通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子的方法具体为：
利用谷本相似性搜索对pubchem数据库里大约40,000,000个小分子进行初步筛选，选出与伊马替尼，尼罗替尼，达沙替尼和普纳替尼中的任意一个结构相似度大于谷本系数90％库中小分子，即为与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子。
优选的，所述对接靶标为活化野生型蛋白激酶，活化t315i突变体蛋白激酶，非活化野生型蛋白激酶和非活化t315i突变体蛋白激酶。
优选的，所述对接采用的软件为autodock4.2。
优选的，所述r2为式(r2-1)、或式(r2-2)，
优选的，所述bcr-abl蛋白激酶抑制剂为式(i-1)、式(i-2)或式(i-3)，
与现有技术相比，本发明提供了一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法，首先将通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子和对接靶标进行对接，然后采用打分函数spa对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，得到靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性值e；并将得到的亲和性值e，结合热力学特异性和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值，并对上述值进行归一化处理得到小分子的pe，pisr，prt，然后对三者加和得到小分子多维参数s，将得到的小分子多维参数与普纳替尼的多维参数进行比较，得到具有式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂；实验结果表明，本发明提供的筛选方法得到的抑制剂对cml细胞有很好的抑制作用，在很大浓度范围内对正常细胞无毒性，而且具有跟普纳替尼相媲美的抑制cml变异体肿瘤的作用。
附图说明
图1为非活化态和活化态两种构象的bcr-abl蛋白的结构示意图；
图2为不同浓度的pa对三种白血病细胞和两种正常细胞的增殖抑制作用结果；
图3为不同浓度的pa诱导三种白血病细胞凋亡结果；
图4为不同浓度的pa对三种白血病细胞周期的影响；
图5为pa对细胞线粒体膜电位的影响；
图6为检测不同浓度pa处理24h后三种白血病细胞内活性氧(ros)水平结果；
图7为不同浓度的pa对三种白血病细胞中融合蛋白bcr-abl以及其磷酸化蛋白表达水平的影响；
图8为pa有效抑制动物体内移植肿瘤细胞的生长的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法，包括：
1)将通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子与对接靶标进行对接，然后采用打分函数spa对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，得到靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性值e；
2)利用步骤1)得到的亲和性值e，结合热力学特异性和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值，
其中，所述热力学特性公式为：
δe为最低能量与平均能量差，即δe＝en-<e>，
δe为能量涨落，即(<e2>-<e>2)1/2；
所述动力学特性公式为：
f(r)为不同结合位置r上的亲和性值，
kb，t以及d(r)设为常数；
3)对得到的小分子的亲和性值e、热力学特异性isr值和动力学特异性rt值进行归一化处理得到小分子的pe，pisr，prt，然后对三者加和得到小分子多维参数s，将得到的小分子多维参数与普纳替尼的多维参数进行比较，得到具有式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂，
其中，r1为式(r1-1)、式(r1-2)或式(r1-3)，
r2为c5～c8的含氮芳香基。
按照本发明，本发明将通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子与对接靶标进行对接，然后采用打分函数spa对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，得到靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性值e；其中，所述对接靶标优选为活化野生型蛋白激酶(pdbid2gqg)，活化t315i突变体蛋白激酶(pdbid2v7a)，非活化野生型蛋白激酶(pdbid1e1p)和非活化t315i突变体蛋白激酶(pdbid3ik3)；所述述对接采用的软件优选为autodock4.2；本发明对对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分的打分函数没有特殊要求，本领域公知的打分函数均可，如可以按照“yan，z.andwang，j.(2012)specificityquantificationofbiomolecularrecognitionanditsimplicationfordrugdiscovery.sci.rep.，2，1--7”的文章中公开的打分函数spa进行打分。
本发明中，所述通过谷本相似性搜索得到的与现有药物分子具有高相似度的小分子的方法优选为：
利用谷本相似性搜索对pubchem数据库里大约40,000,000个小分子进行初步筛选，选出与伊马替尼，尼罗替尼，达沙替尼和普纳替尼中的任意一个结构相似度大于谷本系数90％库中小分子，即为与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子。
按照本发明，利用步骤1)得到的亲和性值e，结合热力学特异性和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值，
其中，所述热力学特性公式为：
δe为最低能量与平均能量差，即δe＝en-<e>，
δe为能量涨落，即(<e2>-<e>2)1/2；
所述动力学特性公式为：
f(r)为不同结合位置r上的亲和性值，也即结合能量值。
在计算时，rt公式采用离散化计算求和，kb，t以及d(r)设为常数。
按照本发明，本发明对得到的小分子的亲和性值e、热力学特异性isr值和动力学特异性rt值进行归一化处理得到小分子的pe，pisr，prt，然后对三者加和得到小分子多维参数s，将得到的小分子多维参数与普纳替尼的多维参数进行比较，得到具有式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂；其中，本发明对归一化处理的方法没有特殊要求，本领域公知的归一化处理方法均可；所述式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂中，所述r2优选为式(r2-1)、或式(r2-2)，
更具体的，所述bcr-abl蛋白激酶抑制剂为式(i-1)、式(i-2)或式(i-3)，
本发明提供了一种bcr-abl蛋白激酶抑制剂的筛选方法，首先将通过谷本相似性搜索得到的与已知bcr-abl蛋白激酶抑制剂具有高相似度的小分子与对接靶标进行对接，然后采用打分函数spa对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，得到靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性值e；并将得到的亲和性值e，结合热力学特异性和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值，并对上述值进行归一化处理得到小分子的pe，pisr，prt，然后对三者加和得到小分子多维参数s，将得到的小分子多维参数与普纳替尼的多维参数进行比较，得到具有式(i)结构的bcr-abl蛋白激酶抑制剂；使得本发明得到的抑制剂对cml细胞有很好的抑制作用，而且在很大浓度范围内对正常细胞无毒性，具有跟普纳替尼相媲美的抑制cml变异体肿瘤的作用。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1)相似度筛选
通过利用谷本相似性搜索(tanimotosimilaritysearch)对pubchem数据库里大约40,000,000个小分子进行初步筛选。库中小分子与伊马替尼，尼罗替尼，达沙替尼和普纳替尼中任何一个的结构相似度大于谷本系数90％的被保留进入下一步的分子对接。通过这步筛选，得到数量相对较少但结构与药物分子非常相似的一组小分子化合物，结果见表1，另外，选取美国/国家癌症机构(nationalcancerinstitute，nci)多样性小分子组(diversityset)作为对比组。
表1.pubchem数据库中与现有药物分子具有高相似度的小分子化合物的个数
2)对接与能量计算
以上得到的小分子分别与四个对接靶标(活化野生型(pdbid2gqg)，活化t315i突变体(pdbid2v7a)，非活化野生型(pdbid1e1p)和非活化t315i突变体(pdbid3ik3))进行分子对接，采用的对接软件是autodock4.2。对接完成后，利用yan，z.andwang，j.(2012)specificityquantificationofbiomolecularrecognitionanditsimplicationfordrugdiscovery.sci.rep.，2，1-7文章中报道的打分函数spa重新对蛋白质-小分子对接构象进行分子间相互作用打分，所得到的能量值用于热力学特异性和动力学特异性的计算。spa是一套原子间相互作用能量值，利用spa的值可计算靶蛋白与小分子间的总能量，即亲和性。其中，所述非活化态和活化态两种构象的bcr-abl蛋白的结构示意图见图1，图1为非活化态和活化态两种构象的bcr-abl蛋白的结构示意图。
3)特异性计算
利用得到的对接分子构象和spa打分所得到的亲和性值e，结合热力学特异性和动力学特异性公式，计算出每个小分子与对接靶标的热力学特异性isr值和动力学特异性rt值。isr计算公式由漏斗能量地貌理论推导所得。rt计算公式由扩散方程推导所得。两者公式分别如下：
δe为最低能量与平均能量差，即δe＝en-<e>。δe为能量涨落，即(<e2>-<e>2)1/2。f(r)为不同结合位置r上的亲和性值，也即结合能量值。在计算时，rt公式采用离散化计算求和，kb，t以及d(r)设为常数。
4)多维筛选
通过以上步骤，得到每个分子与对接靶标的亲和性值e，热力学特异性isr值和动力学特异性rt值。由于每个参数的量纲以及所代表的意义不一样，分别对每个量纲进行归一化处理得到pe，pisr，prt，然后对三者加和得到参数s，即多维参数。利用多维参数s的值，对所有小分子进行排序。通过比较，得到具有式(i-1)、式(i-2)或式(i-3)的bcr-abl蛋白激酶抑制剂。这三个小分子化合物可作为先导化合物用于前期实验测试和可能的临床测试。以具有式(i-3)的小分子化合物(命名为pa，cid24826974)，其多维参数值明显优于现有药物普纳替尼，结果见表2，此小分子化合物作为先导化合物用于一系列的实验测试。
表2先导化合物(pa)与药物普纳替尼的比较。
5)实验验证
针对筛选出的具有式(i-3)结构的先导小分子化合物普纳替尼衍生物pa，我们科研组通过一系列体外和体内实验对这些小分子化合物进行生化测试，包括增殖实验(proliferationassay)即mts方法测定先导化合物对癌细胞系以及正常细胞系的增殖影响；利用dapi细胞染色、流式细胞实验测定先导化合物对三种cml细胞凋亡的影响；进一步测定细胞内线粒体膜电位、活性氧ros以及蛋白表达确定先导化合物pa引起细胞凋亡的机制；通过肿瘤移植动物实验观测先导化合物对肿瘤的抑制作用。
具体的，通过对三种cml细胞以及正常细胞的毒性实验，且所有实验都是利用mts方法酶标仪测试；结果见图2，图2为不同浓度的pa对三种白血病细胞和两种正常细胞的增殖抑制作用结果(n＝3)；其中，图中a为pa化合物的结构和对三种白血病细胞的毒性实验；b为pa对小鼠成纤维细胞(l929)和人正常结肠上皮细胞(ncm460)的毒性。从图中可以看出，pa化合物对野生型bcr-abl和变异体t315i表达的cml细胞都具有纳摩级(nm)的ic50值，而且抑制作用随着浓度的增加呈浓度依赖关系，且和普纳替尼相比pa对正常细胞没有毒性；
采用不同浓度的pa诱导三种白血病细胞凋亡，通过dapi染色对结果进行处理，结果见图3，图3为不同浓度的pa诱导三种白血病细胞凋亡结果，其中，(a)pa处理24h后荧光显微镜下细胞形态变化(比例尺：50μm)；(b)annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测细胞凋亡率。从图中可以看出，对照组细胞的细胞核为圆形，染色质密度均匀一致。用药组细胞的细胞核边缘不规则，染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩。因此，从形态学上说明pa能够诱导细胞发生凋亡。
通过流式细胞术检测，结果见图4，图4为不同浓度的pa对三种白血病细胞周期的影响；从图中可以看出，流式细胞实验检测结构显示与对照组相比，随着浓度的增加，细胞凋亡率显著提高。
凋亡机制可能与线粒体膜电位和活性氧有关，线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，通过检测jc-1单体和jc-1聚合物，使用荧光显微镜观察jc-1从红色荧光到绿色荧光的转变来判断细胞是否发生凋亡。结果见图5，图5为pa对细胞线粒体膜电位的影响；其中，jc-1是一种用于检测线粒体膜电位δψm的荧光探针。(a)jc-1单体(绿色荧光)；(b)jc-1二聚体(红色荧光)；(c)混合；从图5可以看出，随着pa的加入，细胞中红色荧光减弱，绿色荧光增强，说明线粒体膜电位下降，细胞发生凋亡。
通过流式细胞仪测定dcfh-da荧光染料的荧光强度变化定量检测细胞内ros水平，结果见图6，图6为检测不同浓度pa处理24h后三种白血病细胞内活性氧(ros)水平结果。
通过蛋白印迹法研究细胞凋亡和融合蛋白bcr-abl的表达水平之间的关系，结果见图7，图7为不同浓度的pa对三种白血病细胞中融合蛋白bcr-abl以及其磷酸化蛋白表达水平的影响，从图中可以看出，随着pa浓度的增加，蛋白表达降低。同时移植的动物(小鼠)肿瘤随着给药时间的增加，肿瘤大小明显减小，说明此先导化合物对变异体肿瘤的治疗效果良好。
h&e免疫组织染色结果见图8，图8为pa有效抑制动物体内移植肿瘤细胞的生长的结果，其中，(a-b)pa对变异体肿瘤生长的抑制作用；(c)用药后肿瘤体积的变化；(d)用药后老鼠体重的变化；(e)h&e对五脏组织免疫染色和抗体肿瘤组织染色。从图中可以看出，pa对五脏没有毒性，而对c-abl蛋白具有很好的抑制作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。