解淀粉芽孢杆菌和微生物制剂及其制备方法

专利名称：：解淀粉芽孢杆菌和微生物制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种新的解淀粉芽孢杆菌以及使用该芽孢杆菌制备的微生物制剂和方法。
背景技术：
：众所周知，由于微生物农药的技术特征和发展方向与人类未来的生产方式、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性都具有良好的相融性，加上以现代发酵工程和生物技术为基础的微生物工业化生产技术体系日趋完善，微生物农药的研究开发已引起了研究人员广泛的关注和重视。利用植株上附生的或根际土壤中的拮抗细菌或其代谢产物调控有害微生物的平衡可达到控病保产的目的，也是植物病害生物防治的重要而有效的途径，而筛选高效和活性稳定的拮抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。芽孢杆菌(Ba"7/"s^p.)是自然界广泛存在的一类细菌，其中的一些菌株可以产生杆菌肽、大环脂、环脂和类噬菌体颗粒等十几种抗菌物质，在植物病害生物防治中有着广泛的应用前景。同时，芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无毒，因此具有很强的环境适应性和环境友好性。微生物农药与化学农药市场相比是个新兴的产业，发展微生物农药在我国具有巨大的潜在市场，新型微生物农药的研究成果转让市场潜力相当可观，并将推进传统农药产业结构调整和技术提升，获得巨大的规模效益，为现代农业生产和生态环境的可持续发展，为农业等相关产业结构的调整提供重要的技术保障。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种新的抑菌谱广、抑菌效果好的芽孢杆菌菌种(30"7/10附>^0//^^/^^";0，还提供了一种高效、无毒、安全的防治植物病害的微生物制剂及其低成本的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种解淀粉芽孢杆菌(5acz7/wsawy/o/z々we/ac/era)YN-l，其保藏编号为CGMCCNO.2328。一种以上述解淀粉芽孢杆菌制备的微生物制剂，以重量份计，该微生物制剂含有解淀粉芽孢杆菌YN-lCGMCCNO.2328发酵液8295份，表面活性剂28份，防腐剂14份。所述微生物制剂还含有抗冻剂26份。所述解淀粉芽孢杆菌发酵液是通过如下方法制得将所述解淀粉芽孢杆菌YN-1接种于培养液，发酵培养至少36小时，将发酵液过滤，灭菌，再将其浓縮至原来体积的4060%后即成；所述培养液中含有葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黄豆饼粉1016g/L。上述生物制剂可以通过常规的灌根、浸种、喷雾等方法施用。可单独使用，也可以与对本生防菌株无副作用的其它杀菌剂、植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用，方法是播种前，采用发酵制剂与种子拌种；或在病害始发期，通过灌根施入作物根际或喷雾施用。一种微生物制剂的制备方法，包括以下步骤(1)试管菌种制备将解淀粉芽孢杆菌YN-lCGMCCNO.2328接种到试管NYDA斜面培养基上，263(TC下培养2448小时获得试管菌种；(2)种子液制备将上述试管菌种接入NYD培养液内，在2630。C下培养1216小时制成一级种子液，然后以l:100150的体积比将一级种子液接入NYD培养液内，在263(TC下进行发酵培养1214小时，获得二级种子液；(3)发酵培养基制备取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉加水配制成含葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黄豆饼粉1016g/L的培养基；(4)液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将二级种子液按1:2030的体积比接种于培养液，在263(TC下发酵培养至少36小时后，将发酵液过滤，灭菌，再将其浓縮至原来体积的4060%即得YN-1菌株发酵液；(5)制剂制备取上步所得YN-1菌株发酵液8295份、表面活性剂28份、防腐剂14份，充分混匀即成。在上述步骤(5)中，还可进一步混入抗冻剂26份。上述抗冻剂为乙二醇、尿素、氯化钙、氯化钠中的至少一种。上述表面活性剂0204、SilwetL-77、Mon0818、0P-10中的至少一种。上述防腐剂为水杨酸钠、氯化钠中的至少一种。本发明具有积极有益的效果1.所筛选出的及"附;^//^^/^&^，-1抑菌谱广、抑菌效果好，其对苹果轮纹病菌(尸/2ysa/asp0rap/r/co/aNose.)、苹果树腐j;兰病菌(f^Zs"附g//MiyabeetYamada)、苹果褐斑病菌(Marasom'"ama//(RHenn.)Tto.)、黄瓜灰霉病菌(Bo^y他c/"e阳")禾口辣椒枯萎病菌(Fw5W7'w/wo:9^ponwf.sp.ca;w/cw附)有较强的抑审lj作用，室内YN-1菌株对褐斑病菌的抑菌效果达90%(参见实施例3)，说明该菌及其代谢产物可用于制备广谱、高效生物制剂，具有极为广阔的工业化生产前景。2.本发明的微生物制剂主要防治对象为苹果褐斑病、苹果腐烂病等。除此之外，以该菌株制备的生物制剂对黄瓜、辣椒、西瓜、棉花、小麦等农作物以及地黄、山药等药用植物的轮纹病菌、腐烂病菌、褐斑病菌、灰霉病菌、枯萎病菌、炭疽病等真菌病害也有较好的防治效果；在济源市王屋山林场、温县等地的田间小区进行的防效试验表明该生防制剂效果显著、稳定性好，能够有效的防治苹果褐斑病、小麦纹枯病等真菌病害，对苹果轮斑病、褐斑病等病害的防治效果可高达81.4%(见实施例IO)。3.本发明生物制剂的制备方法简单、合理，筛选出了成本低廉的工业用培养基，大大降低了工业化生产成本，有利该生物制剂的应用普及。本发明所述解淀粉芽孢杆菌(&cz7/wsam_y/o/zXac/ms)YN-1,已于2008年1月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC,保藏编号为CGMCCNO.2328。具体实施例方式实施例l菌种筛选指示菌以苹果轮纹病菌(尸/2;wz/o^orapWco/aNose.)、苹果腐烂病菌(Fa/s"附a//MiyabeetYamada)、苹果褐孩王病菌(Aforaso"/"aw"//(P.Henn.)Tto.)、西瓜枯菱病菌(i^s"Ww附ax^s/on/附(Schl.)f.sp.w/ve"m(Smith)Snyder)、黄瓜枯菱病菌CFwsan'ww2ax^s/orww(Schl.)f.sp.C^/cw/wen'wwwOwen.)、辣椒枯妻病(Fusan'w附ojjQ^porwmf.sp.cajM7'cM/w)、棉花枯菱病(T^wsan'wwo;^^spon'wmSchl.f.sp.vos7一"謂入小麦纹枯病Wz"o"iacerealsvanderHoevenapud.Boerema&Verhoeven)作为指示菌。培养基NYDA培养基(牛肉膏8g，蛋白胨8g，葡萄糖10g，琼脂15g，补水至1000ml)、NYD培养基(牛肉膏8g，蛋白胨8g，葡萄糖10g，补水至1000ml)及PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂粉15g，补水至1000ml)、两用培养基(去皮马铃薯200g、牛肉膏5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，琼脂粉15g，补水至1000ml)。筛选方法郑州市惠济区毛庄生菜地，采用五点取样法，铲去表层10cm土层，将所得土样充分混匀后，取500g晾干备用。菌种分离将风干的土样过40目筛，每个土样取15g，加入盛有250ml无菌水和若干玻璃珠的三角瓶中，置摇床上120r/min震荡20min，静置后取上清液为母液。采用梯度稀释法将母液依次稀释浓度至10—3、10—4、10—5待用；平板涂布吸取100ul菌液至NYDA平板上进行涂布后，28t:培养箱中培养24h;挑单菌落划线挑选具有不同菌落特征的单菌落在NYDA平板上划线，28'C培养箱中继代培养四次，将生长特性不发生显著变化者斜面保存备用。然后采用以下通用的纸碟法、含毒介质法进行拮抗菌筛选。纸碟法(1)将培养2天(温度28X:)的斜面拮抗菌种用无菌水制成菌悬液，待用；滤纸用打孔器打成。=6mm的双层圆形纸片，灭菌待用。PDA平板培养基培养病原菌(90mm培养皿)，用打孔器(直径6mm)沿菌落边缘打成菌饼，待用；(2)将两用培养基倒入培养皿(120mm)，每皿中接3种病原菌菌饼，每种菌两个菌饼，在菌饼之间接入已浸过菌悬液的纸碟，每皿1种拮抗菌。同时用不接拮抗菌的病原菌作对照，待对照长满后，目测抑菌效果；(3)将两用培养基倒入培养皿(120mra)，每皿中接l种病原菌菌饼，每皿3个菌饼，在菌饼之间接入已浸过菌悬液的纸碟，每皿接1种初筛的拮抗菌。同时用不接拮抗菌的病原菌作对照，待对照长满后，测量抑菌圈直径。含毒介质法将在纸碟法中筛选出的比较好的拮抗菌种接入NYD培养液，摇床培养(28。C、120r/min)72h，灭菌(121。C，20min)后待用。在培养皿(90mm)中先加入lmL原液，再加19mL冷却至45"C左右的PDA培养基，混匀，待培养基凝固后，接入同类的病原菌菌饼，重复6次，同时用不含原液的平板做对照，待对照长满后测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率计算公式抑菌率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)X100/(对照菌落直径—6)本实施例共获得22个初步筛选的菌株，其中有13个菌株对参试病原菌具有不同程度的抑制作用，对这些效果较好的拮抗菌株以苹果褐斑病菌等为指示菌进一步做拮抗试验，筛选出对其具有很好防治效果的YN-1菌株。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以上结果表明，由菜园土壤中分离得到的菌株YN-1不但对苹果褐斑病菌具有显著的拮抗作用，而且对其它植物真菌病害病原菌也具有较好的拮抗作用，表明YN-1菌株具有广谱、高效的抑菌作用。实施例2菌株鉴定对实施例1中所分离的菌株YN-1,通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定，方法如下(1)染色按常规的染色方法进行染色。(2)形态和培养特征在NYDA和NYD培养基上28。C培养48h，观察其菌落特征和颜色等，用光学显微镜观察菌体特征。(3)生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》方法进行。(4)菌株的稳定性将该菌株置于-7(TC冰箱中保存，在3、6、12、24月不同时间取出，传代培养测定其抑菌率。(5)16SrDNA和分析菌株采用LB液体培养基在28。C振荡培养至对数生长期，以9000r/min离心，收集菌体，按常规方法提取细菌基因组DNA，合成用于扩增细菌16SrDNA和ITS序列的通用PCR引物进行扩增，目的片段利用分子生物学常规的方法进行克隆和测序。通过BLAST(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)对测序结果进行分析，与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，确定该菌株的分类地位。以上实验结果记录如下1.形态特征该菌于28'C培养，在显微镜下，菌体形状为直杆状，菌体平均大小为21.5X2.82Mm，革兰氏染色为阳性。具有荚膜和芽孢，芽孢形状为椭圆形，在中心，稍膨大。鞭毛端生，单鞭毛。具有运动性。2.培养特征该菌于28X:在NYDA平板培养基上培养24h，产生圆形菌落，边缘不规则，菌落质地湿润，白色，无光泽，用接种针挑取菌落，菌体粘连，具有粘度，培养基颜色没有变化，无特殊气味，继续培养48小时后，菌落变得干燥。3.生理生化特征表3菌株YN-1的生理生化特征生理生化特征YN-1菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注"+"表示阳性反应，"-"表示阴性反应。4.菌株的稳定性将该菌株置于-7(TC冰箱中保存，传代6次仍具菌种的活性，该菌的生长温度范围很广，在1055'C之间，最适宜的温度为28'C。其生长酸碱度在58之间，最适pH值为7。5.16SrDNA和ITS序列分析根据16SrDNA序列分析YN-1菌株为芽孢杆菌属(i^w77"s)，从菌株的各项形态特征、培养特征和生理生化特征也表明该菌株属芽孢杆菌属，与对照组丑az^7o7&"e/acie/^菌种的特征相同。而进一步的ITS序列分析也表明YN-1菌株ITS序列与已报道的A朋y^oh》"e/acj'朋sITS序列有99%的同源性。所以将YN-1菌株鉴定为丑a/z7"7勿"e/acie"s。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>CGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC321bpTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC321bpAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACT264bpCGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC322bpCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC438bpTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCAC实施例3YN-l菌株在不同发酵阶段对苹果褐斑病菌、苹果轮纹病菌的抑菌活性测定以苹果褐斑病菌、苹果轮纹病菌为指示菌。抑菌活性测定用含毒介质法。将苹果褐斑病菌、苹果轮纹病菌平板培养待用。接入种子液后6小时开始，一直到84小时不同时间段取样，取出的样品灭菌后，取lmL加入19mLPDA培养基内倒入90mra培养皿内制成平板，然后分别接入苹果褐斑病菌、苹果轮纹病菌菌饼，重复6次，用不含发酵液的PDA苹果褐斑病菌、苹果轮纹病菌平板做对照，待对照长满后测量菌落直径，计算抑菌率，取平均值，抑菌结果如下表所示表4YN-1菌株发酵液对苹果轮纹病菌和苹果褐斑病菌抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表4可以看出本实施例所用生防菌株YN-1发酵液所含抑菌活性物质，从12小时开始对指示菌起到明显的抑制作用，随着发酵时间延长抑菌率逐渐增加，直到48小时抑菌率达到高峰，对苹果轮纹病菌抑菌率达92.4%，苹果褐斑病菌抑菌率达90.3%，此后仍保持较高抑菌活性。由此可见该菌株所产生的拮抗物质，从发酵后逐渐产生直到48小时达到高峰。室内试验结果表明，YN-1所产活性物质对苹果轮纹病菌和苹果褐斑病菌具有较高的抑菌作用。实施例4一种微生物制剂的制备方法，步骤如下1.试管菌种制备将上述菌株及狐^oh'^7e/"acie;7sYN-1CGMCCNO.2328接种到试管NYDA斜面培养基上，28。C下活化培养24小时获得试管菌种；2.种子液制备将上述试管菌种接入NYD培养液内，摇床培养16小时(28°C，130转/分)制成一级种子液，然后将一级种子液以1:100接种于100mLNYD培养液内进行发酵培养(28°C，130转/分)12小时，获二级种子液；3.发酵培养基制备以葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉为原料，加水配制成含葡萄糖10g/L、玉米粉13g/L、黄豆饼粉13g/L的培养液；4.液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将二级种子液按1:25的体积比接种于培养液，在28。C下培养发酵48小时，将发酵液过滤，灭菌，再将其真空浓縮至原来体积的50X即得YN-1菌株发酵液；灭菌管道、空气过滤器、发酵罐、培养基的灭菌按生产工艺标准进行。发酵条件温度28'C，以自来水冷却方法进行温度调节；罐压0.06MPa;通气量6slpm;搅拌速度120rpm;每2小时取样1次，测定pH值，结晶紫染色镜检菌体形态，观察有无杂菌等。以培养基平板方法进行活菌检测。发酵48小时，抑菌效果基本稳定时停止培养。5.制剂制备将上述YN-1菌株发酵液90kg与02042kg、OP-103kg、水杨酸钠0.5kg、氯化钠1.5kg、氯化钙3kg充分混匀即成。以含毒介质法对上述生物制剂进行室内活性测定，并在苹果园进行田间试验，其保质期试验表明，该生物制剂在室温下可以保存2年。实施例5—种微生物制剂的制备方法，与实施例4基本相同，不同之处在于①以葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉为原料，加水配制成含葡萄糖8g/L、玉米粉15g/L、黄豆饼粉15g/L的培养液；②对发酵设备及培养液灭菌后，将二级种子液按l:22的体积比接种于上述培养液，在28土rC下培养发酵36小时，将发酵液过滤，灭菌，再将其真空浓縮至原来体积的40%即得YN-1菌株发酵液；③制剂制备YN-l菌株发酵液85kg、SilwetL-772kg、水杨酸钠2kg、尿素6kg，充分混匀。实施例6—种微生物制剂的制备方法，与实施例4基本相同，不同之处在于①以培养液中含葡萄糖llg/L、玉米粉10g/L、黄豆饼粉16g/L;②对发酵设备及培养液灭菌后，将二级发酵种子液按l:30的体积比接种于上述培养液，在28士rC下培养发酵48小时，过滤发酵后的培养液，并灭菌，再将其真空浓縮至原来体积的60X即得YN-1菌株发酵液；③制剂制备，向82kgYN-l菌株发酵液中加入OP-107kg、水杨酸钠0.9kg、乙二醇2kg,充分混匀。实施例7—种微生物制剂的制备方法，与实施例4基本相同，不同之处在于①以培养液中含葡萄糖9g/L、玉米粉16g/L、黄豆饼粉11g/L;②对发酵设备及培养基灭菌后，将二级发酵种子液按l:30的体积比接种于上述培养液，在28士2。C下培养发酵48小时，过滤发酵后的培养液，并灭菌，再将其真空浓縮至原来体积的55X即得YN-1菌株发酵液；(D制剂制备，向95kgYN-l菌株发酵液中加入Mon08186kg、氯化钠1kg、乙二醇2kg、氯化钙4kg，充分混匀。实施例8—种微生物制剂的制备方法，与实施例4基本相同，不同之处在于①以培养液中含葡萄糖12g/L、玉米粉12g/L、黄豆饼粉13g/L;②制剂制备，将YN-1菌株发酵液94kg与0P-108kg、水杨酸钠1kg、氯化钠1kg、尿素2kg、氯化钙2kg充分混匀即成。实施例9一种微生物制剂的制备方法，与实施例4基本相同，不同之处在于①以葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉为原料，加水配制成含葡萄糖12g/L、玉米粉15g/L、黄豆饼粉15g/L的培养液；②对发酵设备及培养基灭菌后，将二级种子液按1:28的体积比接种于上述培养液，在28士rC下培养发酵36小时，将发酵液过滤，灭菌，再将其浓縮至原来体积的40%即得YN-1菌株发酵液；③制剂制备YN-l菌株发酵液88kg、SilwetL-774kg、水杨酸钠0.3kg、氯化钠3kg，充分混匀。实施例IO微生物杀菌剂防治苹果褐斑病的田间试验(1)试验地情况及时间试验地情况试验设在济源市王屋山林场，褐斑病发生较严重。果园面积5亩，栽培品种富士，树龄10年，密度65株/亩。试验时间2006年7月8至2006年8月26日。(2)试验药剂YN-1菌株发酵液制剂和活菌制剂，另以80%新大生可湿性粉剂(美国固信公司)作对照。(3)试验处理将YN-1菌株发酵液过滤、灭菌、浓縮后，加工成水剂，其基本组成活性物质(有效成份)、溶剂(水或其他有机物)、助剂(表面活性剂、抗冻剂、防腐剂等)。以实施例4和实施例5中所述微生物制剂YN-1为母液为例，分别设25倍、50倍、100倍稀释液；活菌的含活菌以活菌数/ml计算；80%新大生800倍；清水对照作对照；以叶面喷雾施用，试验设9个处理，每处理5株，共50株；三次用药，间隔期为15天。(4)调査时间及方法时间第一次用药前进行病害基数调查，第二次调查为最后一次用药后第10天；方法每处理调查3棵，每棵树从东、西、南、北、内膛5个方位取样，每方位调查50片叶，调査病叶数，病级，并计算病情指数、防效。褐斑病分级标准0级无病；l级病斑面积占叶总面积小于10%;3级病斑面积11%25%;5级病斑面积26%40%;7级病斑面积41%65%;9级病斑面积大于65%。计算公式病情指数=E(病情级别X该级的病叶数)防治效果(%)=(5)试验结果总叶片数x最高级别病情指数对照区病情指数一处理区病情指数X100对照区病情指数X100拮抗菌YN-1的发酵液加入不同助剂或活菌在苹果上应用，对苹果褐斑病具有较好的防治效果。调査结果表明(表5)实施例4的防治效果分别为67.2%、81.4%、73.2%;活菌50倍(含活菌数/ml)、100倍(含活菌数/ml)的防效分别为79.2%和53.2%。与施水对照相比病情指数均有明显的降低；对照组化学农药新大生的防治效果76.3%，农户自管的防治效果为68.1%。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN-1，其保藏编号为CGMCCNO.2328。2.—种以权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌制备的微生物制剂，其特征在于，以重量份计，该微生物制剂含有解淀粉芽孢杆菌YN-1CGMCCNO.2328发酵液8295份，表面活性剂28份，防腐剂14份。3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还含有抗冻剂26份。4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述抗冻剂为乙二醇、尿素、氯化钙、氯化钠中的至少一种。5.根据权利要求2至4任一项权利要求所述的微生物制剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌发酵液是通过如下方法制得将所述解淀粉芽孢杆菌YN-1接种于培养液，发酵培养至少36小时，将发酵液过滤，灭菌，再将其浓縮至原来体积的4060%后即成；所述培养液中含有葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黄豆饼粉1016g/L。6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述表面活性剂为0204、SilwetL-77、Mon0818、0P-10中的至少一种。7.根据权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，所述防腐剂为水杨酸钠、氯化钠中的至少一种。8.—种如权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤(1)试管菌种制备将解淀粉芽孢杆菌YN-1CGMCCN0.2328接种到试管NYDA斜面培养基上，2630。C下培养2448小时获得试管菌种；(2)种子液制备将上述试管菌种接入NYD培养液内，在2630。C下培养1216小时制成一级种子液，然后以l:100150的体积比将一级种子液接入NYD培养液内，在263(TC下进行发酵培养1214小时，获得二级种子液；(3)发酵培养基制备取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉加水配制成含葡萄糖812g/L、玉米粉1016g/L、黄豆饼粉1016g/L的培养基；(4)液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将二级种子液按1:2030的体积比接种于培养液，在2630'C下发酵培养至少36小时后，将发酵液过滤，灭菌，再将其浓縮至原来体积的4060X即得YN-1菌株发酵液；(5)制剂制备取上步所得YN-1菌株发酵液8295份、表面活性剂28份、防腐剂14份，充分混匀即成。9.根据权利要求8所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，进一步混入抗冻剂26份，所述抗冻剂为乙二醇、尿素、氯化钙、氯化钠中的至少一种。10.根据权利要求8或9所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂0204、SilwetL-77、Mon0818、OP-IO中的至少一种；所述防腐剂为水杨酸钠、氯化钠中的至少一种。全文摘要本发明涉及一种保藏编号为CGMCCNO.2328的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN-1和生防微生物制剂及其制备方法。以重量份计，该微生物制剂含芽孢杆菌发酵液82～95份、表面活性剂2～8份、防腐剂1～4份；其制备方法包括试管菌种、种子液、发酵培养基的制备及液体发酵生产、制剂制备等步骤。该解淀粉芽孢杆菌抑菌谱广、抑菌效果好；以该菌株制备的微生物制剂能有效防治苹果褐斑病、小麦纹枯病等真菌病害，防治效果显著、稳定，对苹果轮斑病、褐斑病等病害的防治效果可高达81.4％；该制剂的生产方法简单、合理，筛选出了成本低廉的工业用培养基，工业化生产成本低，易于普及应用。文档编号A01N63/02GK101423812SQ20081023140公开日2009年5月6日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者任应党,倪云霞,刘新涛,刘玉霞,刘红彦,杨丽荣,飞王,薛保国申请人:河南省农业科学院