一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一株莫哈韦芽孢杆菌BacillusmojavensisQLY002菌株，保藏编号为CGMCCNo.8905。本发明还提供该菌株的微生物菌剂、其制备方法及在马铃薯病原菌抑菌和对马铃薯促生作用中的应用。本发明的菌株和菌剂能够作为微生物农药和肥料使用，能够抑制马铃薯坏疽病菌、马铃薯早疫病原菌、马铃薯干腐病菌和马铃薯炭疽病菌，其抑菌率在61%以上；对马铃薯有促进作用，可以作为马铃薯专用微生物农药和微生物肥料使用，从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
【专利说明】一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药和微生物肥料【技术领域】，具体涉及一株莫哈韦芽孢杆菌 Bacillus mojavensis QLY002菌株及其微生物菌剂和应用。
【背景技术】
[0002] 随着化学农药的大量、频繁使用，环境污染、农药残留和增加抗性等问题也越来越 严重，植物病害的生物防治成为了研究热点，其中尤以植物内生菌作为拮抗菌的研究得到 众多学者的观注。植物内生细菌是指生活在植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，但对植物 没有任何实质性伤害的细菌，其具有多种生物学功能，特别是抑菌功能成为生防菌资源的 有力支撑。研究发现植物内生菌对植物有促进生长的作用，这些促生作用主要体现在内生 细菌通过产IAA、固氮作用和通过解磷或溶磷作用使植物能够尽可能的得到养分的补充，从 而使植物对生物量进行了积累；植物内生细菌也可以通过分泌抑菌物质、与病原菌竞争营 养空间及诱导植物获得抗病性阻止或降低病原菌对植物的侵染或造成的危害。以内生细菌 为菌种资源研制的微生物农药不易产生抗药性，不伤害天敌，且能利用农副产品甚至工业 废水广泛生产，应用于农业生产后为生产绿色或无公害农产品提供了一个新的途径。
[0003] 大量使用化学氮肥、磷肥和钾肥会导致重金属在土体中累积、资源与能源大量消 耗、环境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在农田中流失或挥发，对地下水资源、土 壤和空气造成了严重污染，使农畜产品的有毒物质超标，给人类健康带来了极大的危害，同 时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构，造成土壤板结，肥力下降。
[0004] 微生物肥料作为一种新型肥料，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能固定 大气中的氮素、释放土壤中固定态的磷、钾元素，使得环境的养分潜力得以充分发挥，并为 作物生长营造一个良好的土壤微生物环境，在减少化肥用量、降低环境污染、提高农作物品 质等方面具有重要意义。尤其是集抑菌、固氮、解磷、解钾和作物生长素于一身的复合微生 物肥料的研发，在农业可持续发展中有举足轻重的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中化学农药和化肥环保性差、易产生抗药性和安全 性差的缺陷，提供一株莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002菌株，利用所述内生 细菌莫哈韦芽孢杆菌的广谱杀菌活性和促生能力，来制备环保性好、不易产生抗药性和安 全性好的内生细菌莫哈韦芽孢杆菌微生物菌剂。
[0006] 本发明从高寒草地珠芽寥（Polygonum viviparum)、紫花针茅（Stipa purpurea Griseb),线叶嵩（Kobreasia Capillifolia),秦究（Gentiana macrophy pall)和乳白香 青（Anaphalis Lactea Maxin)等的内生细菌中筛选获得一株对马铃薯病原菌具有抑菌和 对马铃薯具促生作用的内生细菌：莫哈韦芽孢杆菌菌株，该菌株的拉丁文名称为Bacillus mojavensis QLY002,并对其生物学功能进行了研究，优化了其培养条件及发酵条件，并进 行了防治试验，提供了一株生物防治和生物菌肥的菌种资源和其菌剂的制备方法。本申请 人将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8905,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏单位简称：CGMCC，保藏日期为2014年03月10日。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基， 所述菌体为莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No. 8905。
[0008] 优选地，在每毫升所述微生物菌剂中，莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No. 8905的活菌 数为 4. 12 X 101CI-1. 59 X 10nCFU。
[0009] 优选地，所述培养基的组分和含量包括：氯化铵10-18. 5g/L，玉米粉14-24g/L，马 铃薯180-280g/L ;pH值为7. 2-8. 2,溶剂为蒸馏水或无离子水。
[0010] 最优选地，所述培养基的组分和含量包括：氯化铵14. 25g/L，玉米粉19g/L，马铃 薯230g/L ;pH值为7. 7,溶剂为蒸馏水或无离子水。
[0011] 优选地，在微生物菌剂中，所述菌体的质量百分比含量为5-11 %，其余为培养基。
[0012] 本发明通过以下试验来确定莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)的最适培养基。
[0013] 将莫哈韦芽孢杆菌 Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)分别接种于 标号依次为A、B、C、D、E、F和G的培养基中，观测莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在这7种培养基中的生长能力。
[0014] 经观测，发现莫哈韦芽孢杆菌 Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在 这7种培养基中均能生长，但活菌数有差异。其中，对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在这7种培养基中活菌数的测定结果参见图1。
[0015] 在图1中，"A"表示营养琼脂（Nutrient Agar，简称NA)培养基，在NA培养基中， 包括牛肉胨5. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g和蒸馏水/去离子水1000mL ;"B"表示PDA培 养基，在PDA培养基中，包括马铃薯200. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g和蒸馏水/去离子水 1000mL;"C"表示营养肉汤（Nutrient Broth，简称NB)培养基，在NB培养基中，包括牛肉 胨3. 0g、蛋白胨5. 0g、葡萄糖2. 5g和蒸馏水/去离子水1000mL ;"D"表示酵母葡萄糖固体 (即NYDA)培养基，在NYDA培养基中，包括牛肉胨8. 0g、酵母浸膏5. 0g、葡萄糖10. 0g和蒸 馏水/去离子水l〇〇〇mL ;"E"表示第一玉米淀粉培养基，在第一玉米淀粉培养基中，包括玉 米淀粉2. 5g、(NH4)2S04 10. 0g、鹿糖10. 0g和蒸馈水/去离子水1000mL ;"F"表示第二玉米 淀粉培养基，在第二玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉3. 0g、(NH4)2S0410. 0g、KH2P04 15. 0g、 蔗糖l〇g和蒸馏水/去离子水l〇〇〇mL ;"G"表示蛋白胨培养基，在蛋白胨培养基中，包括蛋 白胨10. 〇g、酵母浸膏5. 0g、NaCl 10. 0g和蒸馏水/去离子水1000mL。
[0016] 由图1可知，在相同的条件下，选择7种不同的培养液培养莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905,其活菌量有明显差异。B培养液中活菌数1. 045 X 109CFU/mL，培养液E和F中活菌 数均低于3 X 103CFU/mL，培养液A，C，D和G活菌数显著低于B培养液。可见，培养液B较为 理想，因此，马铃薯200. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g、水1000mL为莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905的基础培养基。
[0017] 在确定PDA培养基为最适合莫哈韦芽抱杆菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)生长的培养基的基础上，进一步利用正交法对PDA培养基中碳氮源含量和pH值进 行优化。
[0018] 1、碳源的优化：
[0019] 将莫哈韦芽孢杆菌 Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)以 5% 的接种 量，以玉米粉、马铃薯、玉米淀粉、白砂糖和不加碳源为处理，以150r/min的转速，在28°C的 温度条件下发酵24h后，测定发酵液中的活菌数。
[0020] 经综合测定，用4种不同的碳源培养，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)活菌量有明显差异，而以玉米粉处理中的活菌量为5. 5X109 CFU/ mL显著高于其他碳源。因此，玉米粉为筛选出的较优碳源。
[0021] 2、氮源的优化：
[0022] 将莫哈韦芽孢杆菌 Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)以 5% 的接种 量，以硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、黄豆粉和不加氮源为处理，以150r/min的转速，在28°C的温 度条件下发酵24h后，测定发酵液中的活菌数。
[0023] 经综合测定，用4种不同的氮源培养，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)活菌量有明显差异，当氮源为氯化铵时活菌数为1.41X101(I CFU/ mL，显著高于其他氮源所对应的活菌数，因此，选取氯化铵作为最优培养基的氮源。
[0024] 3、pH值的优化：
[0025] 通过培养基及碳氮源筛选，确定基础培养液的主要成分为氯化铵、玉米粉和 马铃薯，培养液的pH为7,对各因子取不同水平的值（参见表1)。根据响应曲面法 (Box-Behnken)设计，试验设计与结果见表2,利用Design-Expert 7. 0软件进行二次多项 回归拟合，得出菌株QLY002(CGMCC No. 8905)的活菌数对氯化铵、玉米粉、马铃薯及pH的动 态响应模型：
[0026] Y =
[0027] 2. 503X 1010+5. 939X 10%+5, 569X 109X2+6. 165X 10%+3, 905X 10%-1, 151 X 1 0^^2+2. 918 X 10^^3+6. 576 X 10^^-7. 193 X 109X2X4+2. 507 X 109X3X4-7. 751 X 10%2-4, 6-69X 109X22-1. 689X 109X32-2. 059 X 109X42-6. 144 X 10%%+3, 103 X 10%%+2, 774 X ΙΟ^Χ/ +1. 541 X 109X22X4
[0028] R2 = 0. 9714,矫正决定系数Adj-R2 = 0. 9273,式中Y为莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905活菌数的预测值。由矫正决定系数可以认为回归模型拟合程度较好；氯化铵、玉米 粉、马铃薯及pH对活菌数的影响显著，该模型（P>F)P〈0. 0001，表明回归方程的拟合度极显 著，矢拟项（P>F)P = 0. 196,表明该模型在实际拟合中所占的非正常误差较小；因此，可通 过回归模型预测菌株莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905的最佳培养条件。该模型预测当氯化 铵、玉米粉和马铃薯的添加量分别为14. 25g/L、19g/L、230g/L ;培养液pH为7. 7时，莫哈韦 芽孢杆菌CGMCC No. 8905菌株的活菌数有最大值3. 27X 101(lCFU/mL ;经在该培养条件下验 证，莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905菌株的活菌数可达3. 48 X 101(lCFU/mL，与预测值差异不 显著。说明莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No. 8905菌株的最佳培养液配方为氯化铵14. 25g/L、玉 米粉 19g/L、马铃薯 230g/L，ρΗ7· 7。
[0029] 表1 :响应曲面设计试验各因子取值范围
[0030]
【权利要求】
1. 一株莫哈韦芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述莫哈韦芽孢杆菌菌株 QLY002 的保藏编号为：CGMCC No.8905。
2. -种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，其特征在于：所述菌体为莫哈 韦芽孢杆菌菌株CGMCC No. 8905。
3. 根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：在每毫升所述微生物菌剂中，莫哈 韦芽孢杆菌菌株CGMCC No. 8905的活菌数为4. 12X 101° -1. 59X 10nCFU。
4. 根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基的组分和含量包 括：氯化铵10-18. 5g/L，玉米粉14-24g/L，马铃薯180-280g/L ;pH值为7. 2-8. 2,溶剂为蒸 馏水或无离子水；作为优选，所述培养基的组分和含量包括：氯化铵14. 25g/L，玉米粉19g/ L，马铃薯230g/L ;pH值为7. 7,溶剂为蒸馏水或无离子水。
5. 根据权利要求2-4任一所述的微生物菌剂，其特征在于：在微生物菌剂中，所述菌体 的质量百分比含量为5-11%，其余为培养基。
6. 权利要求2-5任一所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：将莫哈韦 芽孢杆菌菌株CGMCC No. 8905接种至培养基中，在温度为26-30°C、转速为150-210r/min和 溶氧量为50%-70%的条件下，进行液体发酵32-40h，制得发酵液，即得到微生物菌剂；优选 地，是在接种量为8%、温度为28°C、转速为180r/min和溶氧量为60%的条件下，进行液体发 酵36h，制得发酵液，得到微生物菌剂。
7. 权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株和权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制 备马铃薯专用微生物农药中的应用。
8. 权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株和权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制 备马铃薯专用微生物肥料中的应用。
9. 一种微生物农药，其含有权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或权利要求2-5任 一所述的微生物菌剂。
10. -种微生物肥料，其含有权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或权利要求2-5任 一所述的微生物菌剂。
【文档编号】A01P3/00GK104152385SQ201410390702
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】杨成德, 陈秀蓉, 薛莉, 畅涛, 李振东 申请人:甘肃农业大学