本发明属于苗木种植方法领域，具体地，涉及一种杉木组织培养方法。
背景技术：
杉木为杉科植物，是一种适应性广、材质优良的经济林树种。由于杉木是异花授粉树种，用种子繁殖，个体分化大，难以保持杉木母体的性状。而常规的扦插、压条或嫁接等无性繁殖方法，繁育速度缓慢，难以满足日益增长的市场需求。为此，杉木要在短期内获得大量优良无性系苗木，只有通过植物组织培养方法解决问题。组织培养方法是一种快速无性繁殖方法，选择杉木优良无性系材料，采用组织培养方法，既可以保持母体的优良性状，又可以有效节约生产成本。
传统杉木组织培养幼苗主要依靠培养基中的糖作为碳源，极易引起微生物的污染。为了减少微生物的污染，必须使用封闭的、小的培养容器。培养容器小，并且由于培养基中糖的存在，导致叶片表层结构发育差，气孔开闭功能不强，叶片小，叶绿素含量低，最终抑制和降低了幼苗的光合作用能力。与幼苗自然生长差异悬殊的容器内环境，还导致幼苗生理、形态上的一定紊乱，导致部分幼苗生长发育延缓或死亡，幼苗生长细弱，叶片舒展度差，生根不良，引起驯化阶段幼苗较高的死亡率，为此必须使用植物生长调节剂，但是植物生长调节剂的使用又会导致畸形和变异。因此，导致了杉木组织过程中生根缓慢、生根率低、生长速度慢、易生病等问题，一直阻碍着杉木产业化育苗生产进程。
技术实现要素：
针对现有方法中的缺陷，本发明的目的是提供一种杉木组织培养方法，该方法针对现有杉木组织培养过程中存在的问题，从碳源的补给、组织培养使用的培养容器等方面入手，研发一种新型的组织培养方法，该方法可加速杉木组织生根、提高生根率、减少疾病的发生。
根据本发明提供的一种杉木组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取生长健壮的杉木萌芽条，将其剪切成长5-9cm，直径0.16-0.30cm，消毒后于萌芽条顶部0.6-1.0cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成1.0-2.5cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1-3个茎段作为杉木组织培养的外植体；
(2)消毒：将(1)中处理后的外植体浸泡在消毒液中3-5min进行消毒灭菌，浸泡完成后用无菌水冲洗2-3次；
(3)初代无糖组织培养：将(2)消毒后的外植体接种至无糖组织培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行初代培养，所述初代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉8-10g/l，6-苄氨基腺嘌呤1-2mg/l，苹果泥90-110mg/l，凹凸棒泥3-7mg/l，玉米浆液7-13mg/l，ph值为5.5-5.7，所述培养的条件为：培养周期10-20天，培养温度20-26℃，光照强度1200-1400lx，光照时间10-17h/天；
(4)无根苗筛选：待(3)中初代培养的外植体生根后，进行生根苗筛选，选择长度为3-4cm的生长健壮的有根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的有根苗切割成长度为0.5-1.2cm的单苗；
(5)继代无糖组织培养：将(4)中的单苗接种至继代无糖培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行继代培养，所述继代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉5-12g/l，a-萘乙酸1-3mg/l，香蕉泥115-120mg/l，凹凸棒泥5-11mg/l，小麦浆液5-11mg/l，ph值为6.1-7.1，所述继代无糖组织培养的条件为：培养周期9-18天，培养温度21-25℃，光照强度1800-2100lx，光照时间9-15h/天；
(6)生根培养：将(5)中所述继代培养苗接种到生根培养基中，进行生根培养，所述生根培养基配方：0.25mm的硅藻土粉6-12g/l，吲哚丁酸0.1-0.5mg/l，萘乙酸0.3-0.5mg/l，小麦浆液6-10mg/l，ph值为5.6-6.0，培养温度为25-30℃，光照强度1700-2000lx，光照时间12-20h/天。
优选地，所述(2)中消毒液为浓度为0.2-0.5％的高锰酸钾溶液。
优选地，所述凹凸棒泥的制备方法为：将粉状凹凸棒原料研磨后过80-100目筛，制成凹凸棒粉，加入到水中，搅拌15-25min，所加水的重量为凹凸棒粉重量的41-50％，搅拌15-25min，制得凹凸棒泥。
优选地，所述玉米浆液是采用新鲜玉米的胚芽打浆而成的。
优选地，所述小麦浆液的制作方法是将小麦用水浸泡后去除小麦皮，打浆制得。
优选地，所述光照是采用led组培灯进行光照。
优选地，所述木制外壳的植物培养箱内部为无菌环境。
优选地，所述培养箱在使用前经紫外线照射10-20min。
与现有方法相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的一种杉木组织培养方法，一方面进行碳源的改变，传统的杉木组织培养方法，外植体以糖(如蔗糖、白砂糖、果糖等)作为主要碳源进行异养或兼养生长，增加了微生物的感染。而本发明中则用苹果泥、玉米浆、香蕉泥、小麦浆替代糖作为杉木外植体或幼苗生长的碳源，在一定程度上避免了微生物的污染。一方面进行培养基质的改变：在传统的组织培养中，通常使用琼脂作为培养基质，它的透气性差，不利于水分、气体和营养物质的移动和吸收。本发明使用硅藻土粉作为培养基质，此基质具有良好的透气性，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量，而且与琼脂相比，此无机基质价格相对低廉，节约了培养成本。一方面培养容器的改变，在传统的组织培养中，由于培养基中糖的存在，为了防止污染，只能使用小的培养容器。本发明在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，因此选用木制外壳植物培养箱作为培养容器，可以人工控制光照强度和温度。采用本发明的组织培养方法使得生根率提高10-15％，减少了疾病的发生。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供的一种杉木组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取生长健壮的杉木萌芽条，将其剪切成长9cm，直径0.16cm，消毒后于萌芽条顶部1.0cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成1.0cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取3个茎段作为杉木组织培养的外植体；
(2)消毒：将(1)中处理后的外植体浸泡在消毒液中5min进行消毒灭菌，浸泡完成后用无菌水冲洗2次；
(3)初代无糖组织培养：将(2)消毒后的外植体接种至无糖组织培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行初代培养，所述初代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉10g/l，6-苄氨基腺嘌呤1mg/l，苹果泥110mg/l，凹凸棒泥3mg/l，玉米浆液13mg/l，ph值为5.5，所述培养的条件为：培养周期20天，培养温度20℃，光照强度1400lx，光照时间10h/天；
(4)无根苗筛选：待(3)中初代培养的外植体生根后，进行生根苗筛选，选择长度为4cm的生长健壮的有根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的有根苗切割成长度为0.5cm的单苗；
(5)继代无糖组织培养：将(4)中的单苗接种至继代无糖培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行继代培养，所述继代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉12g/l，a-萘乙酸1mg/l，香蕉泥120mg/l，凹凸棒泥5mg/l，小麦浆液11mg/l，ph值为6.1，所述继代无糖组织培养的条件为：培养周期18天，培养温度21℃，光照强度2100lx，光照时间9h/天；
(6)生根培养：将(5)中所述继代培养苗接种到生根培养基中，进行生根培养，所述生根培养基配方：0.25mm的硅藻土粉12g/l，吲哚丁酸0.1mg/l，萘乙酸0.5mg/l，小麦浆液6mg/l，ph值为6.0，培养温度为25℃，光照强度2000lx，光照时间12h/天。
其中，所述(2)中消毒液为浓度为0.5％的高锰酸钾溶液。
其中，所述凹凸棒泥的制备方法为：将粉状凹凸棒原料研磨后过100目筛，制成凹凸棒粉，加入到水中，搅拌15min，所加水的重量为凹凸棒粉重量的50％，搅拌15min，制得凹凸棒泥。
其中，所述玉米浆液是采用新鲜玉米的胚芽打浆而成的。
其中，所述小麦浆液的制作方法是将小麦用水浸泡后去除小麦皮，打浆制得。
其中，所述光照是采用led组培灯进行光照。
其中，所述木制外壳的植物培养箱内部为无菌环境。
其中，所述培养箱在使用前经紫外线照射20min。
实施例2
本实施例提供的一种杉木组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取生长健壮的杉木萌芽条，将其剪切成长5cm，直径0.30cm，消毒后于萌芽条顶部0.6cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成2.5cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1个茎段作为杉木组织培养的外植体；
(2)消毒：将(1)中处理后的外植体浸泡在消毒液中3min进行消毒灭菌，浸泡完成后用无菌水冲洗3次；
(3)初代无糖组织培养：将(2)消毒后的外植体接种至无糖组织培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行初代培养，所述初代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉8g/l，6-苄氨基腺嘌呤2mg/l，苹果泥90mg/l，凹凸棒泥7mg/l，玉米浆液7mg/l，ph值为5.7，所述培养的条件为：培养周期10天，培养温度26℃，光照强度1200lx，光照时间17h/天；
(4)无根苗筛选：待(3)中初代培养的外植体生根后，进行生根苗筛选，选择长度为3cm的生长健壮的有根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的有根苗切割成长度为1.2cm的单苗；
(5)继代无糖组织培养：将(4)中的单苗接种至继代无糖培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行继代培养，所述继代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉5g/l，a-萘乙酸3mg/l，香蕉泥115mg/l，凹凸棒泥11mg/l，小麦浆液5mg/l，ph值为7.1，所述继代无糖组织培养的条件为：培养周期9天，培养温度25℃，光照强度1800lx，光照时间15h/天；
(6)生根培养：将(5)中所述继代培养苗接种到生根培养基中，进行生根培养，所述生根培养基配方：0.25mm的硅藻土粉6g/l，吲哚丁酸0.5mg/l，萘乙酸0.3mg/l，小麦浆液10mg/l，ph值为5.6，培养温度为30℃，光照强度1700lx，光照时间20h/天。
其中，所述(2)中消毒液为浓度为0.2％的高锰酸钾溶液。
其中，所述凹凸棒泥的制备方法为：将粉状凹凸棒原料研磨后过80目筛，制成凹凸棒粉，加入到水中，搅拌25min，所加水的重量为凹凸棒粉重量的41％，搅拌25min，制得凹凸棒泥。
其中，所述玉米浆液是采用新鲜玉米的胚芽打浆而成的。
其中，所述小麦浆液的制作方法是将小麦用水浸泡后去除小麦皮，打浆制得。
其中，所述光照是采用led组培灯进行光照。
其中，所述木制外壳的植物培养箱内部为无菌环境。
其中，所述培养箱在使用前经紫外线照射12min。
实施例3
本实施例提供的一种杉木组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取生长健壮的杉木萌芽条，将其剪切成长7cm，直径0.20cm，消毒后于萌芽条顶部0.8cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成1.6cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取2个茎段作为杉木组织培养的外植体；
(2)消毒：将(1)中处理后的外植体浸泡在消毒液中4min进行消毒灭菌，浸泡完成后用无菌水冲洗2次；
(3)初代无糖组织培养：将(2)消毒后的外植体接种至无糖组织培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行初代培养，所述初代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉9g/l，6-苄氨基腺嘌呤2mg/l，苹果泥94mg/l，凹凸棒泥4mg/l，玉米浆液11mg/l，ph值为5.6，所述培养的条件为：培养周期13天，培养温度23℃，光照强度1230lx，光照时间14h/天；
(4)无根苗筛选：待(3)中初代培养的外植体生根后，进行生根苗筛选，选择长度为4cm的生长健壮的有根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的有根苗切割成长度为0.9cm的单苗；
(5)继代无糖组织培养：将(4)中的单苗接种至继代无糖培养基中，置于木制外壳的植物培养箱中进行继代培养，所述继代无糖培养基配方：0.25mm的硅藻土粉7g/l，a-萘乙酸2mg/l，香蕉泥117mg/l，凹凸棒泥6mg/l，小麦浆液7mg/l，ph值为6.7，所述继代无糖组织培养的条件为：培养周期12天，培养温度23℃，光照强度1900lx，光照时间13h/天；
(6)生根培养：将(5)中所述继代培养苗接种到生根培养基中，进行生根培养，所述生根培养基配方：0.25mm的硅藻土粉7g/l，吲哚丁酸0.4mg/l，萘乙酸0.4mg/l，小麦浆液10mg/l，ph值为6.0，培养温度为30℃，光照强度2000lx，光照时间17h/天。
其中，所述(2)中消毒液为浓度为0.3％的高锰酸钾溶液。
其中，所述凹凸棒泥的制备方法为：将粉状凹凸棒原料研磨后过90目筛，制成凹凸棒粉，加入到水中，搅拌19min，所加水的重量为凹凸棒粉重量的44％，搅拌19min，制得凹凸棒泥。
其中，所述玉米浆液是采用新鲜玉米的胚芽打浆而成的。
其中，所述小麦浆液的制作方法是将小麦用水浸泡后去除小麦皮，打浆制得。
其中，所述光照是采用led组培灯进行光照。
其中，所述木制外壳的植物培养箱内部为无菌环境。
其中，所述培养箱在使用前经紫外线照射17min。
实验测试：
实验材料：选择长势相当的生长健壮的杉木萌芽条；
实验处理：将杉木萌芽条分成均等分的4组，进行相同的消毒处理，第1组、第2组、第3组，采用本实施例1-3的方法进行组织培养，第4组采用常规的方法进行组织培养，统计生根率，观察疾病发生情况；
结果显示：第1组、第2组、第3组的生根率分别比第4组的生根率大10％、12％、15％；第1组、第2组、第3组均未发现有微生物感染情况，第4组受到微生物感染。由此可见，本发明的杉木组织培养方法，提高了生根率，减少了疾病的发生。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域方法人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。