一种用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的方法与流程

本发明属于农业技术领域，更具体涉及褐藻酸寡糖用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的方法。

背景技术：

黄瓜属葫芦科，黄瓜属，是我国重要的蔬菜种植作物之一，黄瓜的栽培在生产中往往受到很多逆境的影响，如干旱、盐碱、高/低温等，逆境会降低黄瓜的产量和品质，

目前有报道中提到壳聚糖可以提高辣椒的抗氧化酶活力，壳寡糖是由来源于虾蟹壳的壳聚糖降解成的带有氨基的小分子寡糖，是一种聚合度在2-20之间寡糖产品，分子量小于3200da。褐藻酸寡糖(alginate-derivedoligosaccharide,ado)是由褐藻胶通过氧化降解、酸水解或者裂合酶降解而得到的小分子量片段。褐藻酸寡糖与壳寡糖来源不同，理化性质也不同。而现阶段植物抗逆领域有关于褐藻酸寡糖的研究比较少，且目前未有关于褐藻酸寡糖提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的报道。研究褐藻酸寡糖在提高植物抗逆性方面的应用，可以使褐藻酸寡糖拥有更多的生物功能，褐藻酸寡糖在植物生长中的使用，可以提高植物的抗逆能力。因此，需要在此方面进行更多的研究。

技术实现要素：

褐藻酸寡糖来源于褐藻中的褐藻胶，本发明研究发现，褐藻酸寡糖可以通过提高抗氧化酶活性从而提高植物的抗逆性，在宏观上表现为抵抗逆境、病害等功效。尤其是对于黄瓜幼苗，褐藻酸寡糖组合物能够提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性。

为此，本发明提出了一种用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的方法。

另外，本发明还提供了褐藻酸寡糖在制备用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的组合物中的应用。

根据本发明的实施方案，提供一种用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的方法，所述方法包括将包含褐藻酸寡糖的组合物的水溶液施加在黄瓜幼苗的叶面上，

其中，所述组合物包含褐藻酸寡糖30-85重量％，氢氧化钾10-20重量％以及水份2-6％；

其中，所述褐藻酸寡糖通过以下步骤制备：

1)将海藻原料粉碎至1×1-4×4cm；

2)制备浓度为0.05-0.2mol/l的碳酸钾或氢氧化钾溶液；

3)将步骤1)获得的海藻与步骤2)获得的碳酸钾或氢氧化钾溶液按照重量比1:3-1:11形成混合物；

4)在搅拌下和40-55℃，使步骤3)获得的混合物中的海藻在碳酸钾或氢氧化钾作用下反应1-4小时，冷却至常温，离心，上清液用30％浓盐酸沉淀，混合液与浓盐酸按照重量比20:1加入，然后离心分离，用同体积水洗涤2-5次，分别反复再离心2-5次，取沉淀物；

5)使步骤4)获得的沉淀物加入0.05-0.2mol/l氢氧化钾溶液中和调ph值至6.5-8.5，按照重量比1:10-1:20；

6)使步骤5)获得的混合液中加入酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶，按照重量比20:1-100:1，在温度为30-50℃下酶解1-6h；

7)使步骤6)获得的酶解液用平均分子量为100-200万道尔顿的微滤膜过滤；滤出液然后用10-50万道尔顿的超滤膜过滤；滤出液继续用300-2万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤；去掉滤出液；将截留液用3000-1万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤，取滤出液；

8)使步骤7)获得的滤出液在温度120-150℃下喷雾干燥，即制得所述褐藻酸寡糖。

根据本发明一个实施方案，其中，所述酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶通过以下步骤制备：

1)将酶活为1000iu/g海藻酸裂解酶粗酶液经过3000-6000纳滤膜过滤，去掉滤出液；

2)将步骤1)获得的截留液经过6000-10万超滤膜过滤，去掉滤出液；

3)将步骤2)获得的截留液在温度-50～-60℃冷冻干燥，即制得酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶。

根据本发明一个实施方案，其中，所述褐藻酸寡糖为聚合度在2-20的单糖聚合物，分子量在3000-1万道尔顿。

根据本发明一个实施方案，其中，所述海藻为天然野生或人工养殖的褐藻。

根据本发明一个实施方案，其中，所述海藻选自淡干海带、干马尾藻和干裙带菜中的一种或多种。

根据本发明一个实施方案，其中，所述海藻为粉末形式的淡干海带、干马尾藻和干裙带菜中的一种或多种。

根据本发明一个实施方案，其中，所述水溶液中包含0.05-0.50重量％,优选0.20重量％的褐藻酸寡糖。

根据本发明一个实施方案，其中，所述褐藻酸寡糖重量百分比为50-80％，氢氧化钾重量百分比为15-20％，水份重量百分比为2-6％。

根据本发明实施方案，还提供一种上述组合物的制备方法，包括将所述褐藻酸寡糖、氢氧化钾溶于水中，干物质和水按照1:10比例加入，在40-55℃，搅拌反应2-4小时，然后用喷雾干燥而成。

本发明还涉及褐藻酸寡糖在制备用于提高黄瓜幼苗的抗氧化酶的活性的组合物中的应用，其中组合物中包含根据本发明的褐藻酸寡糖。

根据本发明的褐藻酸寡糖及其组合物在能够作为生长促进剂，明显促进黄瓜幼苗的抗性酶活力，尤其可以促进黄瓜幼苗sod、pod的活力，增强黄瓜幼苗对逆境的抵抗能力。

附图说明

图1是褐藻酸寡糖对黄瓜叶片超氧化物歧化酶(sod酶)活力的影响实验结果图；

图2是褐藻酸寡糖对黄瓜叶片过氧化物酶(pod酶)活力的影响实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规商店购买得到。

实施例1：褐藻寡糖的制备

褐藻寡糖通过以下步骤制备：

1)将海藻原料粉碎至1×1-4×4cm；

2)制备浓度为0.16mol/l的碳酸钾溶液；

3)将步骤1)获得的海藻100公斤与步骤2)获得的碳酸钾溶液900公斤形成混合物；

4)在搅拌下和40℃，使步骤3)获得的混合物中的海藻在碳酸钾作用下反应4小时，冷却至常温，用50公斤30％浓盐酸沉淀，离心分离，用1050公斤水反复洗涤3次，反复离心3次，得沉淀物50公斤；

5)使步骤4)获得的沉淀物加入0.08mol/l氢氧化钾溶液500公斤，中和调ph值至7.0；

6)使步骤5)获得的混合液中加入酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶10公斤，在温度为40℃下酶解3h；

7)使步骤6)获得的酶解液用平均分子量为100-200万道尔顿的微滤膜过滤；滤出液然后用10-50万道尔顿的超滤膜过滤；滤出液继续用300-2万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤；去掉滤出液；将截留液用3000-1万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤，取滤出液；

8)使步骤7)获得的滤出液100公斤在温度130℃下喷雾干燥，制得酶解法褐藻酸寡糖20公斤。

其中，酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶通过以下步骤制备：

1)将酶活为1000iu/g海藻酸裂解酶粗酶液1000公斤经过3000-6000纳滤膜过滤，去掉滤出液；

2)将步骤1)获得的截留液经过6000-10万超滤膜过滤，去掉滤出液；

3)将步骤2)获得的截留液在温度-50～-60℃冷冻干燥，制得酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶100公斤。

实施例2：褐藻寡糖组合物的制备：

取通过上述实施例1方法制得的褐藻寡糖850公斤，氢氧化钾100公斤，溶于9500公斤水中，在40℃，搅拌反应4小时，然后在温度145℃下喷雾烘干，制得上述褐藻寡糖组合物。

实施例3：褐藻寡糖的制备

褐藻寡糖过以下步骤制备：

1)将海藻原料粉碎至1×1-4×4cm；

2)制备浓度为0.18mol/l的氢氧化钾溶液；

3)将步骤1)获得的海藻150公斤与步骤2)获得的氢氧化钾溶液850公斤形成混合物；

4)在搅拌下和55℃，使步骤3)获得的混合物中的海藻在氢氧化钾作用下反应4小时，冷却至常温，用50公斤30％浓盐酸沉淀，离心分离，用1050公斤水反复洗涤3次，反复离心3次，得沉淀物50公斤；

5)使步骤4)获得的沉淀物加入0.10mol/l氢氧化钾溶液750公斤，中和调ph值至6.5；

6)使步骤5)获得的混合液中加入酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶22公斤，在温度为50℃下酶解5h；

7)使步骤6)获得的酶解液用平均分子量为100-200万道尔顿的微滤膜过滤；滤出液然后用10-50万道尔顿的超滤膜过滤；滤出液继续用300-2万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤；去掉滤出液；将截留液用3000-1万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤，取滤出液；

8)使步骤7)获得的滤出液100公斤在温度150℃下喷雾干燥，制得酶解法褐藻酸寡糖20公斤。

其中，酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶通过以下步骤制备：

1)将酶活为1000iu/g海藻酸裂解酶粗酶液1000公斤经过3000-6000纳滤膜过滤，去掉滤出液；

2)将步骤1)获得的截留液经过6000-10万超滤膜过滤，去掉滤出液；

3)将步骤2)获得的截留液在温度-50～-60℃冷冻干燥，即制得酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶100公斤。

实施例4：褐藻寡糖组合物的制备

将根据实施例3方法制备的褐藻寡糖740公斤，氢氧化钾200公斤，溶于9400公斤水中，在40℃，搅拌反应4小时，然后在温度150℃下喷雾烘干，制得上述褐藻寡糖组合物。

实施例5：褐藻寡糖的制备

褐藻寡糖通过以下步骤制备：

1)将海藻原料粉碎至1×1-4×4cm；

2)制备浓度为0.2mol/l的碳酸钾溶液；

3)将步骤1)获得的海藻200公斤与步骤2)获得的碳酸钾溶液800公斤形成混合物；

4)在搅拌下和50℃，使步骤3)获得的混合物中的海藻在碳酸钾作用下降解3小时，冷却至常温，用50公斤30％浓盐酸沉淀，离心分离，用1050公斤水反复洗涤3次，反复离心3次，得沉淀物50公斤；

5)使步骤4)获得的沉淀物加入0.05mol/l氢氧化钾溶液500公斤，中和调ph值至7.5；

6)使步骤5)获得的混合液中加入酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶20公斤，在温度为30℃下酶解2h；

7)使步骤6)获得的酶解液用平均分子量为100-200万道尔顿的微滤膜过滤；滤出液然后用10-50万道尔顿的超滤膜过滤；滤出液继续用300-2万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤；去掉滤出液；将截留液用3000-1万道尔顿的超滤-纳滤膜过滤，取滤出液；

8)使步骤7)获得的滤出液100公斤在温度140℃下喷雾干燥，即制得酶解法褐藻酸寡糖20公斤。

其中酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶通过以下步骤制备：

1)将酶活为1000iu/g海藻酸裂解酶粗酶液1000公斤经过3000-6000纳滤膜过滤，去掉滤出液；

2)将步骤1)获得的截留液经过6000-10万超滤膜过滤，去掉滤出液；

3)将步骤2)获得的截留液在温度-50～-60℃冷冻干燥，即制得酶活为10万iu/g海藻酸裂解酶100公斤。

实施例6：褐藻寡糖组合物的制备

将根据实施例5的方法制备的褐藻寡糖800公斤，氢氧化钾160公斤，溶于9600公斤水中，在40℃，搅拌反应4小时，然后在温度145℃下喷雾烘干，制得上述褐藻寡糖组合物。

实施例7：褐藻寡糖组合物溶液处理黄瓜幼苗

一，黄瓜幼苗的培养

选择籽粒饱满，均匀的黄瓜种子，漂洗干净后，在蒸馏水中室温下催芽，选取发芽情况整齐的黄瓜种子播种于培养钵中。放于人工气候室内培养。试验条件为25℃(昼)/18℃(夜)，光强为500μmol·m^-2·s^-1，每天的光照时数为10h。

二，褐藻寡糖组合物溶液的配置

选用上述包含本发明的褐藻酸寡糖(分子量3000-10000da)的褐藻酸寡糖组合物，配制为适当浓度的溶液，例如浓度为0.20％的ado水溶液，以蒸馏水作为对照。

三，具体处理

待黄瓜幼苗长到两叶一心时期，选取长势一致的幼苗植株，分为3组，每组20株，其中一组利用蒸馏水进行处理，作为对照组；另外两组利用本发明的溶液进行处理。将配制好的0.20％的褐藻酸寡糖喷施在两叶一心时期的黄瓜幼苗叶片上(10ml/株)，处理后3天和7天时，分别选取各处理同样节位的叶片称重放于液氮中，之后将其保存于－80℃冰箱中，测定黄瓜叶片的超氧化物歧化酶(sod)及过氧化物酶(pod)活性。抗氧化酶活性测定3次重复。测得的数据均采用excel软件分析数据。同时对对照组进行同样的操作，仅仅将本发明的溶液换成蒸馏水。

植物在逆境胁迫的条件下，将会产生很多的氧自由基，进而导致抗逆防御酶类超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)活性的增强，以清除植物体内的自由基，减少植物在逆境胁迫下所受到的伤害。sod是一种植物体内重要的抗逆酶,可以催化o^2-发生歧化反应，生成o2和h2o2，h2o2在pod、cat以及谷胱甘肽过氧化物酶的催化条件下转化为水。pod可以催化乙烯的生物合成，参与消除氧自由基的反应，其活力高低通常是一个表征植物抵抗的一个关键指标。

根据图1、图2结果显示，ado处理3天后，与对照组(ck)相比黄瓜幼苗体内抗逆防御酶sod、pod的活性均有显著提高，分别提高了20.5％，63.9％，ado处理7天后，与对照相比黄瓜幼苗体内抗逆防御酶sod、pod的活性均有显著性提高，分别提高了44.5％，104.8％。

本发明的优点；

本发明所用的褐藻酸寡糖是由褐藻中的褐藻胶通过氧化降解、酸水解或者裂合酶降解而得到的小分子量片段，具有来源丰富，制作简单，且对植物以及人类无毒无害，在环境中可以自然降解，无污染。

本发明的小分子量的褐藻酸寡糖(例如3000-10000da的褐藻酸寡糖)，能明显促进黄瓜幼苗的抗性酶活力，尤其可以促进黄瓜幼苗sod、pod的活力，增强黄瓜幼苗对逆境的抵抗能力，本发明成分简单，配置方便，用量低且有显著效果。

上述实施例仅用以说明本发明而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，本发明的范围由所附权利要求限定，可以在不脱离本发明的精神和范围之内，进行各种修改和变化，这些变化和修改均应理解为涵盖在本发明的所保护的范围之内。