一种松材线虫快速分离收集的装置的制作方法

本申请属于生物样品分离领域，具体地说，尤其涉及一种松材线虫快速分离收集的装置及方法。

背景技术：

松材线虫病(pinewiltdisease)是一种由松材线虫bursaphelenchusxylophilus(steinerandbuhrer)nickle引起的松树快速枯萎死亡、连片毁灭的危险性病害。由于危害严重、防治困难而受到世界各国的高度重视，被列为重要的危险性森林病害。松材线虫最初起源于美国，经木材贸易传入日本、中国大陆及台湾省、韩国、墨西哥、葡萄牙和西班牙，以上地区松树相继发生了松材线虫病。因此，快速分离收集松材线虫是实验室研究松材线虫的第一步，目前，松材线虫的分离收集一般采用贝曼漏斗分离法。

贝曼漏斗分离法是分离收集松材线虫的常用方法：首先，将直径7-10cm的漏斗架在铁架台上，漏斗下端接一段约为5cm的橡胶管，在橡胶管的末端接直径1.0cm的玻璃试管，橡胶管上装一个弹簧夹；将滤纸或面巾纸放置于漏斗内，用蒸馏水浸润滤纸，然后将待分离的线虫培养基切碎放置于滤纸上；加水淹没待分离培养基，静止分离24h；由于线虫的趋水性和重力作用，松材线虫离开培养基，在水中蠕动，最后经由漏斗末端的橡胶管沉降到玻璃试管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫与培养皿上盖收集到的线虫合在一起，备用。

贝曼漏斗分离法存在的问题是：1.松材线虫的分离效率低下，需要24h以上；2.无法确保将pda培养基上的松材线虫全部收集起来，严重限制了松材线虫在实验室内的研究。

技术实现要素：

本申请的目的在于提供一种松材线虫快速分离收集的装置及方法，其能够克服贝曼漏斗分离法存在的问题，能够最大限度将松材线虫从pda培养基中或木材分离出来，确保获取松材线虫获取数量的准确性，为松材线虫的科学研究以及检疫工作提供可信的保障。

为达到上述目的，本申请是通过以下技术方案实现的：

一种松材线虫快速分离收集的装置，包括一级分离器、二级分离器其中所述的一级分离器包括一级筒体，在一级筒体的底端设置有一级过滤筛绢；所述的二级分离器包括二级筒体，在二级筒体的底端设置有二级过滤筛绢；其中所述的一级筒体与二级筒体连接，且一级过滤筛绢位于二级筒体内，且一级过滤筛绢的目数小于二级过滤筛绢的目数。

进一步地讲，本申请中所述的二级分离器中的二级过滤筛绢为漏斗状结构，在漏斗状结构的底端开口并连接有螺旋固定器，螺旋固定器与收集管中的收集筒体的顶端连接，在收集筒体的底部设有收集筛绢，收集筛绢的目数大于或等于二级过滤筛绢的目数。

进一步地讲，本申请中所述的一级过滤筛绢的目数为50-200目。

进一步地讲，本申请中所述的二级过滤筛绢和/或收集筛绢的目数为1500~2000目。

进一步地讲，本申请还包括洗脱液回收装置，洗脱液回收装置位于二级分离器和收集管的下方。

进一步地讲，本申请中所述的一级过滤筛绢与一级筒体、二级过滤筛绢与二级筒体、收集筒体与收集筛绢之间均采用可拆卸式连接。

进一步地讲，本申请中所述的一级筒体、二级筒体、收集筒体均采用透明材质制作。

一种利用上述装置对松材线虫进行快速分离的方法，该方法包括以下步骤，

一、首先，将含有松材线虫的pda培养基（或含有松材线虫的木材）切碎后置于烧杯中，将培养松材线虫的平皿一起置于烧杯中，加入500ml无菌水浸泡1~3h（碎木屑浸泡24h），然后将浸泡液体及pda培养基（或碎木屑）倒入一级分离器内，用洗脱液缓慢冲洗，将培养基内的松材线虫全部冲洗到一级分离器中；

二、继续用洗脱液冲洗一级分离器的一级筒体、一级过滤筛绢，确保松材线虫全部进入到二级分离器中；

三、去掉一级分离器，将二级分离器取下，用洗脱液冲洗二级分离器中的二级筒体、二级过滤筛绢，使得松材线虫进入到收集管中；

四、观察洗脱液回收装置，保证该装置中的洗脱液的液面低于收集管底端所在平面5~10cm；

五、用胶头吸管吸取收集管中的松材线虫，转移到1.5ml、2ml或5ml离心管中，3000rpm/min，26℃，离心10min，得到松材线虫沉淀。

进一步地讲，本申请中所述的洗脱液为去离子水或无菌水。

与现有技术相比，本申请的有益效果是：

1、通过本申请所述的松材线虫的分离装置，能够将分离收集的时间控制在1~5h内，从而实现在实验室内快速分离松材线虫的目的，从而克服传统贝曼漏斗分离法时效慢的缺点。

2、本申请可确保将pda培养基及平皿盖上的松材线虫全部、快速的收集起来，从而提高松材线虫的获得率，保证实验结果的正确性。

附图说明

图1是本申请的结构示意图一。

图2是本申请的结构示意图二。

图3是本申请中一级分离器的结构示意图。

图4是本申请中二级分离器的结构示意图。

图5是本申请中收集管的结构示意图。

图6是本申请中二级过滤筛绢与螺旋固定器、收集筒的连接关系示意图。

图7是本申请与贝曼漏斗分离法对松材线虫获得率的比较图。

图中：1、一级筒体；2、放置架；3、螺旋卡扣；4、一级过滤筛绢；5、二级筒体；6、二级过滤筛绢；7、收集筒体；8、收集筛绢；9、螺旋固定器；10、洗脱液回收装置。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本申请所述的技术方案作进一步地描述说明。需要说明的是，在下述段落可能涉及的方位名词，包括但不限位“上、下、左、右、前、后”等，其所依据的方位均为对应说明书附图中所展示的视觉方位，其不应当也不该被视为是对本申请保护范围或技术方案的限定，其目的仅为方便本领域的技术人员更好地理解本申请所述的技术方案。

实施例1：一种松材线虫快速分离收集的装置，包括一级分离器、二级分离器其中所述的一级分离器包括一级筒体1，在一级筒体1的底端设置有一级过滤筛绢4；所述的二级分离器包括二级筒体5，在二级筒体5的底端设置有二级过滤筛绢6；其中所述的一级筒体1与二级筒体5连接，且一级过滤筛绢4位于二级筒体5内，且一级过滤筛绢4的目数小于二级过滤筛绢6的目数。

实施例2：一种松材线虫快速分离收集的装置，所述二级分离器中的二级过滤筛绢6为漏斗状结构，在漏斗状结构的底端开口并连接有螺旋固定器9，螺旋固定器9与收集管中的收集筒体7的顶端连接，在收集筒体7的底部设有收集筛绢8，收集筛绢8的目数大于或等于二级过滤筛绢6的目数。其余部分的结构及连接关系与任一前述实施例中所述的结构及连接关系相同。

实施例3：一种松材线虫快速分离收集的装置，所述一级过滤筛绢4的目数为50-200目。所述二级过滤筛绢6和/或收集筛绢8的目数为1500~2000目；还包括洗脱液回收装置10，洗脱液回收装置10位于二级分离器和收集管的下方。所述一级过滤筛绢4与一级筒体1、二级过滤筛绢6与二级筒体5、收集筒体7与收集筛绢8之间均采用可拆卸式连接。所述一级筒体1、二级筒体5、收集筒体7均采用透明材质制作。其余部分的结构及连接关系与任一前述实施例中所述的结构及连接关系相同。

实施例4：一种松材线虫快速分离收集的方法，其包括以下步骤：

一、首先，将含有松材线虫的pda培养基（或含有松材线虫的木材）切碎后置于烧杯中，将浸泡液体及pda培养基（或碎木屑）倒入置于一级分离器内，用洗脱液缓慢冲洗，将培养基内的松材线虫全部冲洗到一级分离器中；

二、继续用洗脱液冲洗一级分离器的一级筒体1、一级过滤筛绢4，确保松材线虫全部进入到二级分离器中；

三、去掉一级分离器，将二级分离器取下，用洗脱液冲洗二级分离器中的二级筒体5、二级过滤筛绢6，使得松材线虫进入到收集管中；

四、观察洗脱液回收装置10，保证该装置中的洗脱液的液面低于收集管底端所在平面5~10cm；

五、用胶头吸管吸取收集管中的松材线虫，转移到1.5ml、2ml或5ml离心管中，3000rpm/min，26℃，离心10min，得到松材线虫沉淀。所述洗脱液为去离子水或无菌水。

在上述实施例的情况下，本申请继续就其中涉及的结构及其在本申请中所起到的作用进行详细的描述。

在本申请中，其所述的一级分离器包括一级筒体1和安装于一级筒体1底端的一级过滤筛绢4。本申请中所述的一级筒体1为圆管状结构，其可采用不锈钢、有机玻璃或者透明树脂材料制作而成。一级筒体1的直径可在5~50cm之间，在一级筒体1的底部加工有外螺纹，可与带有内螺纹的螺旋卡扣3螺纹连接，从而将一级过滤筛绢4安装于一级筒体1上。连接之后的一级过滤筛绢4呈现漏斗状结构。而且在本申请中，所述的一级过滤筛绢4采用的是50~200目的筛绢，其孔径为75~300μm，能够利用洗脱液很好地冲洗长满松材线虫的pda平板，而且可以使得松材线虫顺利地通过该孔径的筛绢进入到二级分离器中。而pda固体培养基等的颗粒物质远大于该一级过滤筛绢4的孔径，从而被阻挡在一级筒体1中。一级筒体1可采用插接的方式与二级筒体5的内壁接触并实现两者的连接，连接完成后一级过滤筛绢4位于二级筒体5的内部。当然，本申请并不排除在现有实验手段中可采用的其余的连接方式，使得一级筒体1和二级筒体5连接。

在本申请汇总，其所述的二级分离器包括圆管状结构的二级筒体5，在二级筒体5的下端开口处安装有二级过滤筛绢6。与一级分离器相同的是，二级分离器中的二级筒体5同样采用不锈钢、有机玻璃或者透明树脂材料制作。二级分离器中的二级过滤筛绢6的孔径在6.5~10μm，其目数在1500~2000目。在取下一级分离器后，利用洗脱液继续对二级分离器中的松材线虫进行冲洗，由于松材线虫的尺寸要大于二级过滤筛绢6的筛孔尺寸，其并不能够通过二级过滤筛绢6，但是用于冲洗的洗脱液却可以通过该过滤筛绢。在洗脱液的冲洗作用下，其松材线虫能够全部留在二级过滤筛绢6中。

但是，在上述实施例1所述的结构中，如果只采用一个二级过滤筛绢6，由于二级过滤筛绢6在安装有呈现漏斗状结构，松材线虫全部汇集于该漏斗状结构的二级过滤筛绢6的底部，会造成松材线虫在此处堆积较多，从而影响洗脱液的冲洗。为了解决上述问题，我们在实施例一的基础上提出了实施例二的技术方案。

在二级过滤筛绢6所呈现的漏斗状结构的底部开口，并且在该开口处安装有螺旋固定器9，螺旋固定器9与二级过滤筛绢6的安装关系如图6所示。当去掉一级分离器并采用洗脱液对二级分离器中的松材线虫进行冲洗后，其二级分离器通过除二级过滤筛绢6底部外的区域进行洗脱液的过滤和松材线虫的冲洗，并且通过与之连接的收集筒体7来实现缓解二级过滤筛绢6因漏斗状结构造成的松材线虫堆积的问题。

原本堆积到二级过滤筛绢6底部的松材线虫被冲洗到收集管中的收集筛绢8上，由于收集筛绢8的目数要大于或等于二级过滤筛绢6的目数，松材线虫被冲洗到该筛绢位置后会停留在收集筒体7中等待收集。

在本申请中，所述的收集筒体7采用的是透明有机玻璃或树脂制成，为圆筒状结构。采用透明有机玻璃或者树脂制成的筒体能够便于从外部清晰观察内部洗脱液液面的高度。

在本申请中，所述的一级筒体1、二级筒体5是可以通过放置架2放置于洗脱液回收装置10的开口处的，并且在本申请中所采用的洗脱液为去离子水或无菌水，其在使用后都能够进行循环利用。但是需要注意的是，由于收集管中的收集筛绢8位于底部，其需要时刻观察洗脱液回收装置10中洗脱液的液位高度，保证该洗脱液的液面和收集筛绢8底端之间留有5~10cm的高度。本申请中所述的洗脱液回收装置10为圆筒状结构，同样可采用透明的有机玻璃或者树脂材料制作。

在上述装置的基础上，本申请进一步提出了基于该装置的对松材线虫的快速分离方法。在该方法中，对pda培养基上培养的松材线虫进行分离前，需要先将将松球壳孢菌接种于pda培养基上，26℃恒温培养箱中培养5天，待菌丝基本长满培养皿时，接种含有青霉素钠和硫酸链霉素的松材线虫悬浮液，每皿接种约3000头线虫；将接种后的培养皿盖内表面喷洒适量无菌水，培养皿用封口膜缠绕；将接种后的培养皿置于26℃恒温培养箱中培养，4天后pda培养基内及培养皿盖上即可获得大量的松材线虫。

将含有松材线虫的pda培养基（或含有松材线虫的木材）切碎后置于烧杯中，将培养松材线虫的平皿一起置于烧杯中，加入500ml无菌水浸泡1~3h（碎木屑浸泡24h），然后将浸泡液体及pda培养基（或碎木屑）倒入一级分离器内，并且采用去离子水或无菌水对培养基及平皿盖上的松材线虫全部冲洗到一级分离器中。继续利用去离子水或无菌水对一级分离器的内壁及一级过滤筛绢4进行分离，确保松材线虫全部进入到二级分离器中。冲洗完成后，去掉一级分离器，并且继续利用去离子水或无菌水对二级分离器的二级筒体5的内壁及二级过滤筛绢6进行冲洗，确保松材线虫全部进入到收集管中。

观察洗脱液回收装置10内的液面位置，及时倒掉该装置中的去离子水或无菌水，该装置中的液面低于收集筛绢8底端5~10cm。冲洗完成后，用胶头吸管吸取收集管中的松材线虫，转移到1.5ml、2ml或5ml离心管中，3000rpm/min，26℃，离心10min，即得到松材线虫沉淀，用于松材线虫相关的实验操作。