专利名称：人子宫颈癌1原癌基因以及所编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的原癌基因以及所编码的蛋白质，具体地说，本发明涉及人子宫颈癌1原癌基因及由该基因编码的蛋白质，这种蛋白质可被用于各种肿瘤的诊断。
背景技术：
高等动物包括人在内都携带大约100,000个基因，但其中只有15％得到表达，并且个体生物过程的特征，例如起源、分化、内环境稳定、对刺激应答、细胞分裂的控制、衰老和凋亡(程序化细胞死亡)，决定于某些基因的表达(参见Liang，P.和A.B.Pardee，科学(Science)，257967-971(1992))。
病理现象，例如肿瘤发生，是由导致基因表达模式发生变化的基因突变所引起的。因此，进行了不同细胞中基因表达的比较研究，从而为建立理解多样性生物现象的可行方法提供基础。
例如，由Liang和Pardee所建议的mRNA差异显示(DD)方法，有效地阐明了控制细胞凋亡的肿瘤抑制基因、细胞周期相关基因以及转录调控基因明的本质(参见Liang，P.和A.B.Pardee同上)。而且，DD方法已经广泛用于检查细胞内各种基因的相互关系。
据报道，肿瘤发生是由各种遗传变化，例如染色体杂合性的丢失、致癌基因的活化以及肿瘤抑制基因例如p53基因的失活，所引起的(参见Bishop，J.M.，细胞(Cell)，64235-248(1991)；以及Hunter，T.，细胞(Cell)，64249-270(1991))。而且，据报道，10％到30％的人类癌症发生于癌基因通过原癌基因扩增的活化。
因此，原癌基因的活化在许多癌症的病因学中发挥重要作用，因而需要对原癌基因进行鉴定。
本发明人致力于揭示并检查子宫颈癌的肿瘤发生所涉及的机制；而且，已经意外地发现了一个新的原癌基因一人子宫颈癌1(HCCR-1)在癌细胞中特异性过度表达。此原癌基因可被有效地用于各种肿瘤例如白血病，淋巴瘤，肾、肝、卵巢及子宫颈癌症的诊断、预防和治疗。
发明概述本发明的一个目的是提供一种新的原癌基因及其片段。
本发明的其它目的是提供一种含有所说原癌基因或其片段的重组载体以及用此载体转化的微生物一种由所说的原癌基因或其片段编码的蛋白质；一种含有所说的原癌基因或其片段的诊断癌症的试剂盒；一种含有所说的蛋白质或其片段的诊断癌症的试剂盒；一种具有与所说的原癌基因互补的碱基序列或其片段的反义基因；以及一种利用所说的反义基因治疗或预防癌症的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种新的具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的原癌基因或其片段。
根据本发明的另一个方面，提供了含有所说的原癌基因或其片段的重组载体以及一种用所说的载体转化的微生物。
根据本发明的又一个方面，提供了具有从所说的原癌基因或其片段衍生而来的具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其片段的蛋白质。
附图简要描述本发明的上述目的及特征以及其它目的及特征通过下文中参照附图的描述将显而易见。
图1在正常的子宫颈组织、原发性子宫颈癌组织、转移性淋巴结组织以及CUMC-6子宫颈癌细胞中已被改变的基因表达的DD鉴定。
图2利用TMPRED程序对本发明的原癌基因中跨膜区的疏水性的进行预测。
图3在正常的子宫颈组织、子宫颈癌组织以及子宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6)中表达的HCCR-1的Northern印迹分析结果。
图4在正常的肺组织和肺癌细胞系(NCI-H358、NCI-H460、NCI-H441、NCI-H1229、NCI-H520、NCI-H2009及NCI-H157)中表达的HCCR-1的Northern印迹分析结果；图5A在正常的人十二指肠组织中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果；图5B用图5A的相同的样品与β肌动蛋白杂交所获得的结果。
图6A在人癌细胞系中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果；图6B用图6A的相同的样品与β肌动蛋白杂交所获得的结果。
图7A在人的肿瘤组织以及于之相对应的正常组织中表达的HCCR-1的Northern印迹分析结果；图7B用图7A的相同的样品与β肌动蛋白杂交所获得的结果。
图8一张说明原位杂交的人子宫颈癌组织的代表性特征的显微照片；图9单层培养的野生型NIH/3T3细胞的一个相差照片；
图10单层培养的HCCR-1细胞的一个相差照片；
图11单层培养的HCCR-1细胞的苏木精-伊红染色；
图12说明培养的HCCR-1细胞的代表性特征的透射电子显微照片；
图13HCCR-1在裸鼠中的致癌性；
图14从裸鼠取得的皮下肿瘤瘤块的苏木精-伊红染色；
图15说明来源于裸鼠的皮下肿瘤组织的代表性特征的透射电子显微照片；
图16单层培养的来源于裸鼠的HCCR-1N细胞的相差照片；
图17十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE结果，显示IPTG诱导之前和之后的蛋白质表达模式；
图18未转染的NIH/3T3细胞(野生型)、只用pcDNA3载体转染的NIH/3T3细胞(pcDNA3)以及HCCR-1细胞的Western印迹分析结果；
图19人的肾、肺、卵巢及子宫颈肿瘤组织以及与之对应的正常组织的Western印迹分析结果；图20HCCR-1转染的NIH/3T3细胞针对网硬蛋白纤维的免疫组织化学研究(x250)；
图21HCCR-1转染的NIH/3T3细胞中，上皮细胞标记一角蛋白质的表达(x250)；图22HCCR-1转染的NIH/3T3细胞中，上皮膜抗原的表达(x250)；图23HCCR-1转染的NIH/3T3细胞中，间叶细胞标记—波状蛋白质的表达(x250)；图24在未转染的NIH/3T3细胞(野生型)、只用pcDNA3载体转染的NIH/3T3细胞(pcDNA3)及HCCR-1原癌基因转染的NIH/3T3细胞(HCCR-1细胞)的PKC活性；图25在293细胞、＋核糖核酸酶(RNase)、未转染的NIH/3T3细胞(野生型)、只用pcDNA3载体转染的NIH/3T3细胞(pcDNA3)以及HCCR-1原癌基因转染的NIH/3T3细胞(HCCR-1细胞)中的端粒酶活性；图26A在用反义寡脱氧核糖核苷酸处理过的H-358肺细胞癌细胞系中HCCR-1 cDNA的RT-PCR扩增结果；图26B用图26A的相同的样品与β肌动蛋白杂交所获得的结果。
图27用被正义、错义或反义HCCR-1 ODN处理过的H-358肺癌细胞系及没有处理过的亲本细胞系的生长曲线；图28HCCR-1蛋白质在胎儿期16天-(F16)、18天-(F18)、20天-(F20)、出生后1天-(P1)、7天-(P7)、14-天(P14)，及成年大鼠的肾的组织提取物中的表达；图2920日龄的胎儿期大鼠的肾的免疫组织化学染色(x42)；以及图3018日龄的胎儿期大鼠的肾的微分干扰相差显微术，说明基底膜外侧的髓袢集合导管(x220)的HCCR-1免疫组织化学。
发明详述本发明的新的原癌基因，即，人子宫颈癌1(以下称为“HCCR-1原癌基因”)，是由2118个碱基对组成的，并具有SEQ ID NO1所示的DNA序列。
在SEQ ID NO1中，对应于第9到1088位碱基的完整的开放阅读框是一个蛋白质编码区，预测的由此衍生而来的氨基酸序列表示于由360个氨基酸组成的SEQ ID NO2(“HCCR-1蛋白质”)。而且，对应于SEQID NO1的第9到83位碱基的区域编码一个具有SEQ ID NO2中第1到25位氨基酸的预测氨基酸序列的信号肽；由SEQ ID NO1的第435到494位核苷酸所代表的区域编码一个具有SEQ ID NO2第143到162位氨基酸的预测氨基酸序列的单一跨膜区域。这表明本发明的原癌基因是一种膜结合蛋白质基因。
一个单一的潜在N-糖基化位点(对应于SEQ ID NO1的第945到第953位碱基以及SEQ ID NO2的第313到315位氨基酸)，存在于HCCR-1蛋白质的C-末端，这表明，HCCR-1蛋白质是一种II型膜蛋白质。聚腺苷酸化信号对应于SEQ ID NO1的第2008-2012位核苷酸。
预测的HCCR-1细胞外结构域对应于第495-1088位碱基，具有第163-360位氨基酸的预测氨基酸序列，由198个氨基酸组成，其中有5个半胱氨酸残基。预测的HCCR-1细胞内结构域含有117个氨基酸(对应于SEQ ID NO1的第84-434位核苷酸及SEQ ID NO2的第26-142位氨基酸)，在Ser-42及Ser-48位点有两个潜在的蛋白质激酶C(PKC)磷酸化位点，在Gly-34及Gly-38位点有两个潜在的N-十四烷基化位点。进一步的计算机辅助分析表明，HCCR-1具有显著的疏水性并拥有一个特征性的单一跨膜结构域和前分泌信号肽，如图2所示。
考虑到密码子的简并性，以及要在其中表达本发明的原癌基因的特定动物的偏好密码子，可以进行SEQ ID NO1的DNA序列的变化和修饰，例如在其编码区域进行变化或修饰，而不改变所表达蛋白质的氨基酸序列，或者在非编码区域进行变化或修饰，而不改变所表达蛋白质的氨基酸序列。因此，本发明在其范围之内，还包括一条具有与本发明的原癌基因或其片段基本相同的碱基序列的多聚核苷酸。这里所使用的“基本相同的多聚核苷酸”是指其碱基序列显示出与本发明的原癌基因具有80％或更多，优选90％，最优选95％或更高同源性的多聚核苷酸。
用本发明的原癌基因表达的蛋白质由360个氨基酸组成，并具有SEQID NO2的氨基酸序列。此蛋白质的分子量是大约40kDa。然而，可以对该蛋白质进行氨基酸残基的各种取代、增加或/缺失而不影响蛋白质的功能。而且，当要完成一个特定的目的时，可以使用此蛋白质的一部分。这些被修饰的氨基酸及其片段也被包括在本发明的范围之内。因此，本发明在其范围之内，包括一种与从本发明的癌基因或其片段所衍生而来的蛋白质具有基本相同的氨基酸序列的多肽。这里所使用的“基本相同的多肽”是指其氨基酸序列显示与SEQ ID NO2具有80％或更多，优选90％，最优选95％或更高同源性的多肽。
本发明的原癌基因或蛋白质可从人癌症组织获得，或者利用常规的DNA或肽合成方法合成。而且，可将这样制备的基因插入到一种常规载体中从而得到表达载体，随后将表达载体导入到一种合适的宿主例如E.coli或酵母细胞中。用含有HCCR-1原癌基因或其片段的载体转化的细胞在下文称为“HCCR-1细胞”。
被转化的宿主此后可用于大规模生产本发明的DNA或核酸。例如，通过使用pGEM-T easy载体，用HCCR-1原癌基因转化E.coli JM109，此JM109/HCCR-1已于1999年10月11日，依据布达佩斯条约关于国际承认的用于专利程序之目的的微生物保藏的规定，保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures(KTCC)，地址KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，其保藏号为KCTC0667BP。
在制备载体时，表达控制序列，例如，启动子、终止子、自我复制序列以及分泌信号，依据所使用的宿主细胞进行适当选择。
本发明的原癌基因的过度表达不发生于正常的子宫颈及肺组织中，而是发生于子宫颈癌组织、子宫颈癌细胞系以及肺癌细胞系。这暗示，本发明的原癌基因诱导子宫颈癌及肺癌。而且，当正常的成纤维细胞，例如NIH3T3细胞系，用本发明的原癌基因转化时，产生了一种不正常的细胞。用光学及电子显微镜进行形态鉴定表明，不正常的细胞具有肿瘤细胞的形式。
当用本发明的原癌基因转化的正常的成纤维细胞被注射进裸鼠的后侧面时，注射之后大约21天观察到肿瘤发生，肿瘤的大小在40天内变成1.5cm×1.5cm。使用苏木精-伊红染色法可以证明肿瘤细胞是癌性的。上皮细胞癌的形成还可通过使用透射电子显微术及免疫组织化学染色的方法来证明。
除了上皮组织例如子宫颈和肺癌组织之外，在其它癌症组织中也观察到本发明的原癌基因的过度表达，例如白血病，淋巴癌，肾、肝以及卵巢癌。因此本发明的原癌基因被认为是一种各种形式的癌症的共同因子，因而可将其方便地用于各种癌症的诊断及转化动物的生产，以及反义基因治疗。
可使用本发明的原癌基因进行诊断的方法可以包括，例如，用含有本发明的原癌基因或其片段的探针与从受试者的体液分离的核酸杂交，以及通过使用本领域中常规检测方法来确定受试者是否含有此原癌基因的步骤。可以通过用同位素或酶来标记探针，而容易地检测此原癌基因的存在。因此，一种含有本发明的原癌基因或其片段的癌症诊断试剂盒也被包括在本发明的范围之内。
通过将本发明的原癌基因导入一种哺乳动物，例如大鼠，来生产的转化动物也包括在本发明的范围内。在生产这样一种转化的动物时，优选在第8细胞周期之前将本发明的原癌基因导入动物的受精卵。转化的动物可以方便地用于筛选致癌物及抗癌物药物，例如抗氧化剂。
本发明还提供一种可用于基因治疗的反义基因。本文所使用的术语“一种反义基因”指一条包括了与从具有SEQ ID NO1的碱基序列的原癌基因或其片段转录出的mRNA的序列完全或部分互补的碱基序列的多聚核苷酸，所说的核苷酸能够通过将自身结合到mRNA的蛋白质结合位点，从而阻碍原癌基因的开放阅读框(ORF)表达。
本发明的反义基因的一个例子是具有SEQ ID NO3的碱基序列的18-聚体HCCR-1反义寡聚脱氧核糖核酸(ODN)。因此，本发明在其范围之内还包括一种包括了与SEQ ID NO3的序列基本相同的碱基序列或其片段的多聚核苷酸。
本发明在其范围之内还包括一种通过施用治疗有效量的本发明的反义基因在受试者中治疗或预防癌症的方法。
在发明的反义基因治疗中，按照常规方式给受试者给药本发明的反义基因，从而阻碍此原癌基因的表达。例如，根据Kim，J.S.，等，(控释杂志(J.Controlled Release)，53，175-182(1998))所公开的方法，通过静电相互作用将反义ODN与疏水化的聚-L-赖氨酸衍生物混合，所产生的混合ODN通过静脉对受试者给药。
在本发明的范围之内，还包括含有本发明的反义基因作为活性成分，并且如果有必要，还与制药上可接受的载体、赋形剂或其它添加剂组合的抗癌组合物。本发明的药物组合物优选制备成可通过注射给药的剂型。
实际给药的反义基因的量应该根据各种相关因素，包括所要治疗的病态、选定的给药途径、患者个体的年龄及体重以及患者症状的严重程度来确定。
由发明的原癌基因表达的蛋白质可以用来生产用作诊断工具的抗体。本发明的抗体，可根据本领域中公知的方法，通过使用一种具有SEQID NO2的氨基酸序列的蛋白质或其片段，以单克隆或多克隆抗体的形式制备。癌症诊断可以使用本领域中公知的任何方法进行，例如，在聚丙烯酸凝胶上进行酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)、三明治试验、Western印迹或免疫印迹，从而评价此蛋白质是否在受试者的体液中表达。因此，一种含有具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质或其片段的癌症诊断试剂盒也被包括在本发明的范围之内。
可使用本发明的原癌基因建立一种永生性癌症细胞系，而这样一种细胞系可以从，例如，通过注射用本发明的原癌基因转化的成纤维细胞而在裸鼠背部形成的肿瘤组织获取。这样制备的细胞系可以方便的用于寻找抗癌物质。
下文描述实施例和试验实例，这些实施例和试验实例仅用于说明之目的，而不用于限定本发明之范围。实施例1肿瘤细胞的培养以及总DNA的分离步骤1-1肿瘤细胞的培养从接受过根治性子宫颈切除术的子宫颈癌患者获取正常的子宫颈组织，未处理过的原发性子宫颈癌组织和转移性常见回肠淋巴结组织，用于mRNA差异显示试验。用于差异显示方法的人子宫颈癌细胞系是由Kim，等，(妇科肿瘤学(Gynecol.Oncol.)，62230-240(1996))所描述的CUMC-6细胞系。
来自上述组织的细胞及CUMC-6维持于补充了2mmol/L谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素以及10％胎牛血清(Gibco)的Waymouth’s MB 752/1培养基(Gibco)。利用Freshney(“动物细胞培养基本技术手册(Culture of Animal CellsA Manual of Basic Techniques)”，第2版，A.R.Liss，New York(1987))所描述的台盼蓝染剂拒染试验进行评价，只有活度大于95％的细胞悬液才用于本试验。步骤1-2总RNA的分离及mRNA的差异显示使用由Qiagen(QiagenInc.，Germany)提供的商品化系统(RNeasy totalRNA kit试剂盒)，从步骤1-1所获取的正常子宫颈组织、原发性子宫颈癌组织、转移性常见回肠淋巴结组织以及CUMC-6细胞提取总RNA，使用Message clean kit试剂盒(GenHunter Corp.，Brookline，MA)从RNA中去除污染的DNA。实施例2差异显示逆转录(DDRT)-PCR根据Liang和Pardee(1992)，同上，所描述的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，稍做修改，进行差异显示逆转录。
首先，使用实施例1步骤1-2中所获得的各总RNA 0.2μg，及三个引物中任何一个，即，H-T11G、H-T11C或H-T11A，作为锚定的oligo dT引物(RNAimage kit试剂盒，GenHunter Cor.，MA，USA)，进行逆转录。
然后，使用相同的锚定引物和一种随机5′引物13聚体(RNAimageprimer sets1-4，H-AP1-32)，在存在0.5mM[α-35S]-标记的dATP(1200Ci/mmol)的条件下进行PCR。PCR热循环重复40次，循环包括95℃40秒，40℃ 2分钟和72℃40秒，最后在72℃下进行反应5分钟。
将PCR扩增的片段在6％聚丙烯酸测序凝胶上电泳。通过检查放射自显影来鉴定差异表达的片段。
将大于200碱基的带CC214，从干测序凝胶中切除。通过煮沸15分钟将CC214 cDNA洗脱下来，并使用相同的引物对及上述扩增步骤所使用的PCR条件使其再次扩增，只是不使用[α-35S]-标记的dATP而使用20μMdNTP。实施例3克隆根据制造商的使用说明，使用TA克隆系统(Promega，USA)将如上所获得的再次扩增的CC214 PCR产物插入到pGEM-T Easy载体中。步骤3-1连接将2μl在实施例2中所获得的再次扩增的CC214 PCR产物、1μlpGEM easy载体(50μg、1μlT4DNA连接酶，10X缓冲液，以及1μl的T4 DNA连接酶(3weiss units/ul；T4连接酶，Promega，USA)加到0.5ml管中，向其中加入蒸馏水使最终体积为10μl。连接反应混合物14℃过夜温育。步骤3-2TA克隆转化使用以下程序进行TA克隆转化。
E.coli JM109(Promega，WI，USA)在10ml LB肉汤培养基(Bacto-胰蛋白质胨10g，Bacto-酵母提取物5g，NaCl 5g)中温育直到600nm处的光密度达到大约0.3到0.6。将培养混合物置于0℃10分钟，并在4℃下按4000rpm离心10分钟。去除上清而收获细胞。所收获的细胞小团暴露于10ml 0.1M CaCl20℃ 3分钟到1小时，从而获得感受态细胞。产物在4℃下按4000rpm又离心10分钟，将收获的细胞悬浮在0℃ 2ml 0.1MCaCl2中。
将20μl的感受态细胞悬液转移到一支微量离心管中，并加入2μl在步骤3-1中所获得的连接产物。将此混合物在42℃水浴中温育90秒，并迅速冷却到0℃。向其中加入800μl SOC培养基(Bacto-胰蛋白质胨2.0g，Bacto-酵母提取物0.5g，1M NaCl 1ml，1M KCl 0.25ml，TDW 97ml，2M Mg2+1ml，2M葡萄糖1ml)，并将此混合物在旋转的摇动培养箱中按220 rpm转动，37℃温育45分钟。
用玻璃涂布器(spreader)将25μl X-gal(40mg/ml溶于二甲基甲酰胺的原液)涂布在琼脂上面，制备含有氨苄青霉素(50μl/ml)LB琼脂平板。将25μl如此获得的转化细胞涂布于其上，将这些平板在37℃温箱温育过夜。将白色的克隆加载到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，将转化的E.coli，即，JM 109/CC214，选择出来并在terrific肉汤(TDW 90ml，Bacto-胰蛋白质胨12g，Bacto-酵母提取物24g，甘油4ml，0.17M KH2PO4，0.72NK2HPO4100ml)中温育。实施例4重组质粒DNA的分离根据制造商的使用说明，使用WizardTMPlus Pinipreps DNAPurification Kit试剂盒(Promega，USA)分离了转化的E.coli的CC214质粒DNA。
用EcoRI酶处理如此分离的一部分质粒DNA，并进行凝胶电泳以证明质粒中CC214部分序列的插入。实施例5DNA的序列分析在实施例2中所获得的CC214 PCR产物，根据常规的方法进行PCR，而克隆的、再次扩增的CC214PCR片段，根据双脱氧链终止法，按照制造商的使用说明，使用Seqenase version 2.0 DNA sequencing kit试剂盒(United Sates Biochemical，Cleveland，OH)进行序列分析。
此DNA的碱基序列对应于SEQ ID NO1的第1883-2088位核苷酸，并被命名为“CC214”。
使用一个5′随机引物H-AP21及一个3′H-T11C锚定引物进行206bp cDNA片段，即以上所获得的CC214的差异显示逆转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)，并通过电泳分离。通过DD方法鉴定的在原发性子宫颈癌、转移性淋巴结组织和CUMC-6细胞中改变的基因表达表示于
图1中。如
图1所见，这个206bp片段，即CC214，在子宫颈癌、转移性组织以及CUMC-6细胞中表达，而在正常的细胞中不表达。实施例6HCCR-1原癌基因的全长cDNA的序列分析通过与作为探针的32P-标记的CC214进行噬斑杂交，筛选噬菌体λgt11人肺胚胎成纤维细胞cDNA文库(参见Miki，T.，等，基因(Gene)，83137-146(1989))。从人肺胚胎成纤维细胞cDNA文库获得了在pCEV-LAC载体中含有的一个2118bp插入的全长HCCR-1cDNA克隆，并于1999年11月5日在GenBank注册，登记号为AF195651。
通过NotI切割将插入到λpCEV载体(参见，Miki，T.，等，同上)的HCCR-1克隆以氨苄青霉素抗性的pCEV-LAC噬菌粒载体的形式(参见，Miki，T.，等，同上)切出来。
用T4 DNA连接酶连接含有HCCR-1基因的pCEV-LAC载体，从而制备HCCR-1质粒DNA，并将连接好的克隆转化进E.coli JM109。
如此获得的转化的E.coli JM 109/HCCR-1，已于1999年10月11日，依据布达佩斯条约关于国际承认的用于专利程序之目的的微生物保藏的规定，保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collectionfor Type Cultures(KTCC)，地址Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejion，305-333，Republic of Korea)，保藏号为KCTC 0667BP。
HCCR-1的全长序列由SEQ ID NO1中所示的2118bp组成。
在SEQ ID NO1中，本发明的HCCR-1原癌基因的全长的开放阅读框对应于第9-1088位核苷酸，并预测编码表示于SEQ ID NO2的由360个氨基酸组成的氨基酸序列。而且，对应于SEQ ID NO1的第9到83位核苷酸的区域编码一个具有对应于SEQ ID NO2的第1到25位氨基酸的25个氨基酸的信号肽；SEQ ID NO1的第435到494位核苷酸的区域编码一种单一跨膜结构域，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO2的第143-162位氨基酸。这表明，本发明的原癌基因是一种膜结合基因。
在HCCR-1蛋白质的C-末端存在一个单一的潜在N-糖基化位点(对应于SEQ ID NO1的第945到953位碱基，和SEQ ID NO2的第313到315位氨基酸)，这暗示，HCCR-1是一种II型膜蛋白质。聚腺苷酸化信号对应于SEQ ID NO1的第2008-2012位核苷酸。
预测的细胞外结构域含有198个氨基酸，其中有5个半胱氨酸残基。预测的细胞内结构域含有117个氨基酸(对应于SEQ ID NO1的第84-434位核苷酸及SEQ ID NO2的第26-142位氨基酸)，在Ser-42及Ser-48处具有两个潜在的PKC磷酸化位点，在Gly-34及Gly-38位具有两个潜在的N-十四烷基化位点。进一步的计算机辅助分析表明，HCCR-1是显著疏水的，并且如图2所示，拥有一个特征性的单一跨膜结构域及前分泌信号肽。在图2中，X-轴代表本发明的肽的氨基酸序列编号，而Y-轴代表肽的疏水性。实施例7各种细胞中HCCR-1基因的Northern印迹分析如实施例1一样，从各种组织和细胞系提取总RNA。
将20μl变性的来自每种组织及细胞系的总RNA在1％甲醛琼脂凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim，Germany)，从而确定HCCR-1基因表达的水平。用32P-标记的随机引发的HCCR-1全长cDNA探针与这些印迹斑点杂交，这种32P-标记的随机引发的HCCR-1全长cDNA探针是使用rediprimeII随机引物标记系统(Amersham，England)制备的。重复Northern印迹分析两次，结果用密度计量法定量并用β-肌动蛋白质标准化。
图3表示正常的子宫颈组织、子宫颈癌组织以及子宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6)中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果。如在图3所见，HCCR-1的转录水平在子宫颈癌组织及癌细胞系(CaSki(ATCCCRL 1550)和CUMC-6)中是高的，但是在正常的子宫颈组织中是低的或者是检测不到。
图4表示在正常的肺组织及7种肺癌细胞系，即H358(ATCC NCI-H358)、H460(ATCC NCI-H460)、H441(ATCC NCI-H441)、H299(ATCCNCI-H299)、H520(ATCC NCI-H520)、H2009(ATCC NCI-H2009)及H157(ATCC NCI-H157)中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果。如图4所示，HCCR-1转录水平在肺癌细胞系H358、H460、H1299、H520和H157中处于高水平，而在正常的肺组织中检测不到。
图5A表示正常的人十二指肠；脑、心、骨骼肌、结肠、胸腺、脾、肾、肝、小肠、胎盘、肺及白细胞组织(Clontech)中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果。图5B表示用相同样品与β-肌动蛋白杂交从而证明mRNA完整性的结果。如图5A所见，HCCR-1 mRNA(～2.1kb)在许多正常的组织中存在量很小或者不存在，但是在正常的肾组织中却有高表达水平。
图6A表示在人癌细胞系；HL-60、HeLa、K-562、MOL-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中表达的HCCR-1基因的Northern印迹分析结果。图6B表示用相同样品与β-肌动蛋白杂交从而证明mRNA完整性的结果。如在图6A所见，HCCR-1在人白血病及淋巴瘤细胞细胞系，例如慢性骨髓性白血病K-562、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)Raji、淋巴母细胞性白血病MOLT-4和前骨髓细胞性白血病HL-60以及HeLa细胞中被高水平地转录。
特别地，K-562、MOLT-4及HL-60，与正常的白细胞相比，显示更高的转录水平，增加的倍数分别是约190，90和70。HCCR-1在结直肠癌SW480、肺癌A59和黑色素瘤G361细胞系中的表达水平比在白血病和淋巴瘤中的表达水平低。
还进行了人的肾、肝、肺、卵巢及子宫颈肿瘤组织，以及与之对应的正常组织的Northem印迹分析。如图7A所示，HCCR-1在人癌细胞中高水平地转录，而在正常的细胞中HCCR-1基因的表达几乎观察不到。图7B显示用相同样品与β-肌动蛋白杂交从而证明mRNA完整性的结果。实施例8人子宫颈癌组织原位杂交的显微照片为了进行原位杂交，人子宫颈癌组织用高碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定，根据Ahn筑(美国生理学杂志(Am.J Physiol.)265，F792-F801(1993))所描述的程序用石蜡包埋，并做切片(5μm)。用全长的HCCR-1 cDNA片段合成一种地高辛标记的RNA探针。用通过DIG RNA Labelling Kit试剂盒(Boehringer Mannheim)制备的反义RNA探针进行RNA原位杂交。正义RNA探针作为阴性对照。
图8表示一张说明人子宫颈癌组织原位杂交的代表性特征的显微照片。如图8中所见，原位杂交的人子宫颈癌组织被证明含有高水平的HCCR-1基因。在周围的正常纤维组织没有检测到染色。实施例9表达载体的构建及细胞的转化步骤9-1含有HCCR-1的载体的制备如下构建一种含有HCCR-1的编码区的表达载体。
首先，将在实施例6中所获得的完整的HCCR-1 cDNA插入到一种原核表达载体pCEV-LAC的Sal I限制性位点(参见Miki，T.等，基因(Gene)，83137-146(1989))。然后，从pCEV-LAC/HCCR-1载体分离SalI片段。
然后，用XhoI消化pcDNA3(Invitrogen)从而产生一个与SalI匹配的末端。将这个含有全长HCCR-1编码序列的SalI片段插入用XhoI消化的pcDNA3中。使用转脂胺(Lipofectamine)(Gibco BRL)将所产生的pcDNA/HCCR-1表达载体导入NIH/3T3细胞(ATCC CRL 1658，USA)，随后在补充G418(Gibco)的培养基中选择。所产生的用HCCR-1转化的NIH/3T3细胞命名为“HCCR-1细胞”。制备了另一群只含有pcDA3的NIH/3T3细胞，作为对照，命名为“pcDNA3细胞”。步骤9-2用HCCR-1原癌基因转化的NIH/3T3成纤维细胞如
图10所示，野生型的正常NIH/3T3细胞—一种分化的成纤维细胞系，是一种具有如图9所示的细长形细胞核及少量细胞浆的纺锤形细胞。当HCCR-1在步骤9-1中所获得的表达HCCR-1的NIH/3T3(HCCR-1细胞)中表达时，细胞的形状变成具有卵形细胞核和圆胖细胞浆的多角形形式。
如
图11所示，被苏木精-伊红染色的单层培养的HCCR-1转化的NIH/3T3细胞，表现出多态性、清晰可辩的细胞核、颗粒状染色质形式、肿瘤巨细胞及不典型的有丝分裂图。
为了进行透射电子显微术(TEM)，用溶于磷酸缓冲液(pH7.4)的2.5％戊二醛固定细胞和组织。然后用2％四氧化锇将它们后固定(postfix)。然后用乙醇梯度使标本脱水，并用环氧树脂812(Epon 812)进行包埋。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对其超薄切片进行染色，并用TEM照相(JOEL1，200EX，Tokyo，Japan)。
如
图12所示的TEM照片揭示，所培养的肿瘤细胞具有微绒毛及发育良好的细胞器(inset)。如在
图12所见，此HCCR-1细胞在细胞表面上具有微绒毛，分成小叶状的具有突出的核仁的细胞核及发育良好的粗内质网(rER)以及高尔基复合体(圆状)。在
图12中，定标线条相当于3μm。而在由圆环所示的范围的更高的放大倍数中，定标线条相当于1μm。实施例10动物中HCCR-1原癌基因的肿瘤发生及转移为了分析肿瘤发生，在9只小鼠(5周龄，无胸腺nu/nu，Balb/c背景)的躯干后侧部皮下注射5×106HCCR-1细胞。当皮下的肿瘤直径达到1.5-2.5cm时处死裸鼠。
如
图13所示，全部9只注射HCCR-1细胞的小鼠在21天之后都表现可触知的肿瘤。
负荷HCCR-1同种异体移植物的裸鼠表现了上皮细胞瘤的特征。
图14显示了从裸鼠获得的皮下肿瘤瘤块的苏木精-伊红染色。这些肿瘤瘤块的切片揭示了典型的被纤维性基质隔离的上皮细胞巢。实施例11HCCR-1原癌基因诱导的肿瘤组织的电子显微术及其癌细胞系的建立用电子显微镜检查了从实施例10的裸鼠上形成的肿瘤瘤块所取得的肿瘤组织，这揭示肿瘤瘤块表现发育良好的细胞器而肿瘤细胞细胞桥粒被连接(
图15)。如
图15所示，肿瘤组织包括紧密粘附着的具有胞间连接的细胞(圆环)。在
图15中，定标线条相当于3μm。而在由圆环所示范围的说明细胞桥粒的更高放大倍数中，定标线条相当于0.5μm。
从以上肿瘤组织所获得的细胞，用20％胎牛血清按常规方式培养，如
图16所示，所培养的细胞被命名为HCCR-1N，此细胞具有与HCCR-1细胞相似的体外细胞学特征。实施例12在用HCCR-1原癌基因转化E.coli之后所表达的蛋白质的大小的测定将对应于第123-473位核苷酸及预测的第39-155位氨基酸的HCCR-1原癌基因的一部分插入到pET-32b(＋)载体(Novagen)的多克隆位点中，将产生的pET-32b(＋)/HCCR-1载体转化进E.coli BL21(ATCC 47092)。转化的E.coli使用LB肉汤培养基在旋转的摇动培养箱中温育，1/100稀释，并温育3小时。向其中加入1mM异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma)，从而诱导此蛋白质合成。
培养物中的E.coli利用超声破碎，并在IPTG诱导之前和之后使用12％十二烷基硫酸钠(SDS)进行凝胶电泳。
图17表示SDS-PAGE结果，此结果表示了用pET-32b(＋)/HCCR-1载体转化的E.coli BL21菌株的蛋白质表达模式。在IPTG诱导之后，在大约35kDa处观察到一条明显的蛋白质带。这个35kDa融合蛋白质含有一个由pET-32b(＋)载体中一个基因表达的大约20kDa的Trix.Tag硫氧还蛋白质。实施例13抗体的生产使用His-Bind Kit试剂盒(Novagen)纯化从用实施例12中pET-32b(＋)/HCCR-1载体转化的E.coli BL21菌株所分离的35kDa融合蛋白质。所纯化的肽的免疫印迹证明了存在较多量的35kDa蛋白质。
然后，用1mg这样纯化的肽给两只体重大约150g的6周龄的Sprague-Dawley大鼠皮下免疫，每周1次免疫3次。从被免疫的小鼠取得血液样品，并进行离心从而得到多克隆血清。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定和证明了此多克隆抗体的抗-HCCR-1活性(1∶10,000)。实施例14免疫印迹证明抗体特异性为了进行Western印迹分析，根据Laemmli(自然(Nature)227680-685(1970))所描述的方法，收获
图18和19中已经鉴定的细胞，并用Laemmli样品缓冲液裂解。利用10％SDS-PAGE分离细胞蛋白质，然后将其电转移到硝酸纤维膜上。将这些膜与在实施例13中制备的大鼠多克隆抗-HCCR-1血清温育16小时。洗涤之后，将这些膜与一种含有1∶10,000稀释的作为第二抗体的连接了过氧化物酶的羊抗大鼠免疫球蛋白质(Jackson ImmunoResearch)的封闭液温育。利用ECL-Western blot detectionkit试剂盒(Amersham)显示此蛋白质。
如
图18所示，HCCR-1蛋白质在HCCR-1细胞中过量表达，而在野生型和只转化载体(pcDNA3)的细胞仅观察到微弱的带。此结果说明了多克隆血清中抗HCCR-1抗体的特异性。
而且，多克隆血清中HCCR-抗体识别了不同组织的人蛋白质提取物中的大约40kDa的蛋白质。如
图19所示，包括肾、肺、卵巢及子宫颈细胞癌在内的人肿瘤组织，在将它们和与之对应的正常组织比较时，显示HCCR-1表达增加。实施例15免疫组织化学将在实施例9的裸鼠中形成的肿瘤瘤块分别与抗-波状蛋白质、抗-角蛋白质、抗-EMA(上皮细胞膜抗原)抗体(DAKO)及抗HCCR-1的多克隆抗体温育。然后，在温育的肿瘤瘤块的5um-低温切片上进行免疫组织化学。
利用生物素化的第二抗体、亲合素、生物素化的辣根过氧化物酶及AEC(Aminoethyl Carbaxzole Substrate Kit试剂盒)生色团(HISTrAIN-BULK KITS，Zymed)显示第一抗体的结合。免疫组织化学研究显示，HCCR-1转染进NIH/3T3细胞引起了细胞性质从间叶细胞转变为上皮细胞。这些细胞巢由网硬蛋白纤维包被。
这些细胞显示了上皮细胞标记，例如角蛋白质(图21)和上皮细胞膜抗原(图22)，及间叶细胞标记，例如波状蛋白质的共表达(图23)。实施例16蛋白质激酶C和端粒酶活性试验为了证明HCCR-1调节细胞中蛋白质激酶C(PKC)活性，使用在实施例9的步骤9-1中制备的野生型NIH/3T3细胞、含有pcDNA3的NIH/3T3细胞及HCCR-1转染的NIH/3T3细胞进行PKC试验。
根据制造商的使用说明，使用SignaTECTTMProtein Kiase C AssaySystem(Promega)测量PKC活性。PKC活性定义为在存在或缺乏磷脂的条件下每分钟掺入底物的PKC量的差异。每个数值都是三个独立实验的平均值±标准偏差(means±s.d.)。
图24中的结果显示，HCCR-1转染的NIH/3T3细胞的PKC活性比野生型的高大约10倍。
为了解释HCCR-1的肿瘤发生，根据制造商的使用说明，使用端粒酶PCR-ELISA kit试剂盒(Bohringer Mannheim)测量了野生型NIH/3T3细胞、含有pcDNA3的NIH/3T3细胞及HCCR-1转染的NIH/3T3细胞的端粒酶活性。用此试剂盒所提供的人端粒酶-阳性的永生性人肾细胞(293细胞)作为阳性对照。
用做阴性对照的是用RNase(＋RNase)预处理过的293细胞。用相当于1×103细胞的提取量进行此试验。
图25中的结果显示四组独立实验(平均值±标准偏差)的平均光密度(OD)值。与以前的研究(Holt，S.E.，Wright，W.E.，及Shay J.W.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)162932-2939(1996)一致的，野生型NIH/3T3细胞显示了可以检测的端粒酶活性。与野生型细胞比较，HCCR-1转染将端粒酶活性提高了大约7倍。通过RNase预处理可消除293细胞的高端粒酶活性。实施例17细胞周期试验培养于DMEM培养基中处于对数中期的野生型及HCCR-1转染的NIH/3T3细胞，通过在含有0.5％牛血清的DMEM血清中温育16小时而使其生长停滞。在胰蛋白质酶化之后，收获要用来分析DNA含量的细胞，用70％乙醇的固定。然后如Hedley(Flow Cytometry，DNA AnalysisfromParaffin-embedded Blocks，Darzynkiewicz，Z&Crissman，H.A.eds.，Academic Press，San Diego，1990)所描述的一样，用碘化丙锭对被固定的细胞进行染色。
首先，将50μg/ml碘化丙锭染色液(Sigma)和每毫升100单位的RNase(Boerhringer Mannheim)加到2×106细胞中。温育1小时之后，使用FACSCaliber(Becton Dickinson)在488nm通过荧光分析测定细胞DNA含量。每个样品最少有1×104细胞用Modfit 5.2软件进行分析。
为了研究HCCR-1转染的NIH/3T3细胞的生长性质是否有变化，检查了细胞周期图。测量了处于G0/G1、S、G2/M期的野生型NIH/3T3细胞及HCCR-1转染的NIH/3T3细胞(对数中期)的细胞含量，结果显示于表I。
表I
如表I所见，野生型和HCCR-1转染的NIH/3T3细胞在S-期的百分含量分别是20.6％和31.5％(对数中期)。这些结果暗示，在HCCR-1转染的NIH/3T3细胞中，有显著细胞群从G0/G1期转变到S-期。
为了评价血清依赖性细胞周期的进展，在0.5％牛血清中培养细胞16小时。温育之后，用20％牛血清释放细胞，并在所示时间收获这些细胞。在所示时间测量了处于G0/G1、S、G2/M期的野生型NIH/3T3细胞及HCCR-1转染的NIH/3T3细胞的细胞含量，结果见表II。
表II
如从表II所见，在0 h测量的野生型细胞中，少数细胞维持在S-期。相反地，在0h测量的HCCR-1细胞有显著数量的细胞仍然处于S-期(21.8％)，这暗示HCCR-1的组成型过量表达允许对血清剥夺性-诱导的G0/G1俘获有一个相对量的抗性。在由于血清剥夺所引起的细胞从生长停滞释放之后，与在各时间间隔(12h，24h和48h)所测量的野生型细胞比较，在S-期HCCR-1细胞群中有一致的超过10％的增加。因此，HCCR-1细胞的过量表达可通过缩短G0/G1-期及增加S-期细胞群而下调细胞生长。实施例18反义寡聚脱氧核苷酸的构建利用氰乙基磷酸酰胺(cyanoethylphosphoramidite)化学方法，在自动化DNA合成仪(Expedite Nucleic Acid System，Framingham，MA)上合成了以HCCR-1 mRNA翻译启始位点作为靶的反义及正义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ODNs)。
18-聚体HCCR-1反义ODN的序列是5′-CCTGGACATTTTGTCACC-3′(SEQ ID NO3；对应于SEQ ID NO1的第66到83位核苷酸)。对应的正义序列，5′-GGTGACAAAATGTCCAGG-3′(SEQ ID NO4)，及错义序列，5′-CGCGGATATTTCCTCACC-3′(SEQ ID NO5)被作为对照。实施例19使用HCCR-1反义ODN进行癌症基因治疗步骤19-1基因表达的抑制利用胰蛋白质酶-EDTA使指数生长的2×105H-358肺细胞癌细胞(ATCC CRL-5807)脱落，在24孔板上接种。将转脂胺(Lipofectamine)(GibcoBRL)用于寡脱氧核苷酸(ODN)处理。将转脂胺(5μg/ml培养基)与适量的ODN在细胞悬液中室温温育30分钟，从而获得100nM ODN的终浓度。此后，将此混合液按各1,000μl直接加入24孔板上的细胞中，并分别温育1，2，3，5和7天。利用台盼蓝染剂拒染试验表明转染试剂没有细胞毒性。
为了观察HCCR-1反义ODN的抑制效应，分别用各100nM的在实施例18中所获得的正义、错义及反义ODNs处理所培养的肺细胞癌细胞。利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，揭示了用反义ODN-处理的肺细胞癌细胞中HCCR-1表达的抑制(效应)。根据HCCR-1 cDNA的编码区合成的、用于RT-PCR的寡核苷酸引物的序列如下正向引物5′-GGGAGATGGAGCATTTGAGA-3′(SEQ ID NO6；对应于SEQ ID NO1的第376-395位核苷酸)和反向引物5′-GCTTCCGGAAAGCATGATAG-3′(SEQ ID NO27，与SEQ ID NO1的第554-573位核苷酸互补)。
反义核酸发挥抑制效应的剂量与HCCR-1 mRNA表达的水平有关(图26A)。用497 bp的β-肌动蛋白质作为内部对照来证明mRNA的完整性(图26B)。阴性对照(N)含有无核酸酶的水，而不含有RNA模板。还使用了1000-bp的梯形DNA分子量标记。如图26A所示，通过反义ODN处理，198bp的HCCR-1 RT-PCR产物的水平按时间依赖性方式降低。在用100nM反义HCCR-1 ODN处理7天的细胞中，HCCR-1基因表达被完全抑制。相反，在分别用100nM HCCR-1正义及错义ODN处理的细胞以及没有处理的亲本细胞中，检测到了期望的198bp HCCR-1 RT-PCR产物。
这些结果表明，用100nM的反义HCCR-1ODN处理完全组断了肺癌细胞中HCCR-1基因的表达。步骤19-2细胞生长的抑制利用生长曲线评价了用100nM正义、反义或错义HCCR-1寡聚脱氧核苷酸处理过的H-358肺癌细胞的生长表型。
在三个独立的实验中，用胰蛋白质酶处理H-358并在存在100nM的在实施例18中所获得的正义、反义或错义HCCR-1 ODN的条件下铺平板，每隔一天更换一次含有100nM的HCCR-1 ODN的生长培养基(RPMI-1640)。使在三个重复的培养圆盘中的细胞脱落，每隔一天使用台盼蓝拒染试验计数活细胞。
所图27所示，直到处理的第1天，在正义(□)、错义(△)、反义(○)HCCR-1 ODN-处理的癌细胞之间，细胞生长没有没可以辨别的差异。然而，在HCCR-1 ODN处理3天之后，反义HCCR-1 ODN按时间依赖性方式抑制了肺癌细胞的生长。
在接触反义HCCR-1ODN7天之后，H-358肺癌细胞生长抑制的程度是大约100％，而接触正义或错义HCCR-1 ODN的细胞显示了与未处理过的野生型H-358细胞相似的生长模式(对照细胞，◇)。实施例20HCCR-1基因作为胚胎肾发育的调节者因为通过成纤维细胞-剥夺性HCCR-1细胞获得上皮细胞性状，模拟了肾脏器官发生期间从间叶细胞向上皮细胞的细胞转变(Giordano，S.，等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，649-653(1993)；Tsarfaty，I.，等，科学(Science)263，98-101(1994))，所以进行了一项实验来检查HCCR-1在发育中的肾中是否表达。
用胎儿期16-、18-和20-天大鼠的肾、出生后1-、7-和14-天大鼠的肾以及成年大鼠的肾的组织提取物中的总蛋白质进行SDS-PAGE。如同在实施例14中一样，使用大鼠抗-HCCR-1血清，利用ECL-Western印迹检测试剂盒检测了HCCR-1阳性带中的HCCR-1蛋白质。
图28中的结果显示，具有大约为40,000(Mr～40K)的相对分子量的HCCR-1蛋白质，在胎儿期18-天开始过量表达，维持在一个高的表达水平直到出生后14-天，在成年大鼠的肾中降低到非常低的一个水平。图28F和P分别表示了胎儿期和出生后的情形。
如实施例15一样，使用一个20日龄的胎儿期大鼠的肾进行免疫组织化学染色。正如表示大鼠的肾的染色切片的图29所揭示的(放大倍数，x 42)，HCCR-1抗体仅染色集合导管(左侧的骨髓)，此集合导管来自于输尿管芽(Saxen，L.，肾脏器官发生学(Organogenesis of the Kidney)，88-128(Cambridge University Press，Cambridge，United Kingdom，1987)；Coles，H.S.，等，发育学(Development)118，777-784(1993))。皮质中的发育中的肾单位不被染色(右侧的肾单位区域)。
而且，如实施例15一样使用一只18日龄的胎儿期大鼠的肾进行免疫组织化学染色，然后在微分干涉相差显微镜下观察。如图30所示，髓袢集合导管的基底侧质膜对HCCR-1抗体特别有反应性(放大倍数，x220)。
因为肾单位发生是通过一种不同的输尿管信号—扩散限制性基底侧分子刺激的(Barasch，J.，等，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)271，F50-F61(1996))，这些分子触发从间叶细胞到上皮细胞的转变，所以假设，HCCR-1产物可能是刺激肾发育过程中上皮细胞多态性以及在肿瘤转变期间调节间叶细胞和上皮细胞之间相互作用的间叶细胞-剥夺性调节因子(Brasch，J.等，细胞(Cell)99，377-386(1999)；Brasch，J.等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)103，1299-1307(1999))。
本说明书包括后附的49个核酸及氨基酸序列的序列表。本文中引用的专利和科学期刊的内容全部引入本文作为参考。
虽然本发明的实施方案已经得到完整地描述和说明，但是很明显，在这里可进行各种变化和修饰而不偏离本发明的精神和范围。
微生物国际保藏和存活证明(译文)
序列表<110>金振宇<120>人子宫颈癌1原癌基因以及所编码的蛋白质<130>PCA00211/KJW<150>KR1999-44811<151>1999-10-15<160>7<170>KOPATIN1.5<210>1<211>2118<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(9)..(1088)<220><221>sig_peptide<222>(9)..(83)<220><221>misc_feature<222>(435)..(494)<223>跨膜结构域<400> 1ctgtgaag atg gcg ctc tcc agg gtg tgc tgg gct cgg tcg gct gtg tgg50Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp1 5 10ggc tcg gca gtc acc cct gga cat ttt gtc acc cgg agg ctg caa ctt 98Gly Ser Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu15 20 25 30ggt cgc tct ggc ctg gct tgg ggg gcc cct cgg tct tca aag ctt cac 146Gly Arg Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His35 40 45ctt tct cca aag gca gat gtg aag aac ttg atg tct tat gtg gta acc 194Leu Ser Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr50 55 60aag aca aaa gcg att aat ggg aaa tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat 242Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His65 70 75ttc ccc cgc ttc tat atc ctg tac aca atc ttc atg aaa gga ttg cag 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权利要求
1.一种具有SEQ ID NO1的碱基序列的人子宫颈癌1原癌基因或其片段。
2.权利要求1的原癌基因的片段，它具有相应于SEQ ID NO1的第9到1088位碱基的碱基序列。
3.一种具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质或其片段。
4.一种载体，它含有权利要求1的原癌基因或片段。
5.一种用权利要求4的载体转化的微生物。
6.权利要求5的微生物，它是E.coli JM109/HCCR-1(保藏号KCTC0667BP)。
7.一种制备权利要求3的蛋白质或片段的方法，包括培养权利要求5或6的微生物。
8.一种包括权利要求1或2的原癌基因或片段的诊断癌症的试剂盒。
9.一种包括权利要求3的蛋白质或片段的诊断癌症的试剂盒。
10.一种反义基因，具有与从权利要求1或2的原癌基因或片段转录出的全长或部分mRNA的序列互补的碱基序列，并切能够与该mRNA结合从而抑制所说的原癌基因或片段的表达。
11.权利要求10的反义基因，它具有SEO ID NO3的碱基序列。
12.一种治疗或预防人类癌症的方法，包括对人施用治疗有效量的权利要求10或11的反义基因。
全文摘要
具有SEQ ID NO∶1的碱基序列或其片段的人子宫颈癌(1)原癌基因在各种癌症组织中过度表达。它可用于诊断各种癌症,与其互补的反义基因可用于治疗癌症。
文档编号C12N15/09GK1327449SQ00802273
公开日2001年12月19日 申请日期2000年3月30日 优先权日1999年10月15日
发明者金振宇 申请人:金振宇