专利名称:编码具有d-乳酸脱氢酶活性蛋白质的dna及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及D-乳酸及一项利用D-乳酸生产聚合物的技术。更具体地说，本发明涉及适合用于酵母生产D-乳酸的具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质、具有编码此种蛋白质的核苷酸序列的DNA及其用途。
技术背景
随着重组DNA技术的发展，获得目的基因产物的技术已经发展起来。该技术通过允许外源基因在宿主如微生物、霉菌、动物、植物或昆虫中表达以及允许所产生转化体繁殖得以实现。例如，当采用酵母培养技术时，可通过发酵生产大量目的基因产物。
从“碳中性”的观点来看，近年来一直期待着作为植物来源塑料原材料的乳酸的有效生产。
乳酸分为L-乳酸和D-乳酸，它们是光学异构体。发酵生产D-乳酸的技术已为大家所知，该技术利用能够生产D-乳酸的乳酸菌在含有酿酒酵母的培养基中发酵生产D-乳酸 (日本专利公开号(Kokai) 58-16688A (1983))。一项利用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的技术也已为大家所知(日本专利公开号(Kokai) 58-36394 A(1983))。一项获得高光学纯度D-乳酸的技术也已经公开(日本专利公开号(Kokai)6H93387A(1986)、 4-271787A(1992)和2001-29063 (A))。由于此种生产乳酸的微生物的生产率低并且需要复杂的培养基成份，所以不适于乳酸的工业生产。
也已经公开了另一项技术，通过该技术将乳酸脱氢酶基因掺入到不产生乙醇或乙醇产生能力降低的酵母菌株中，并且所得的重组体用于生产乳酸(日本专利公布号 (Kokai) 2001-516584 (A))。然而，该技术只公开了 L-乳酸的生产。此外，一项生产D-乳酸的技术也已经公开，由此将D-乳酸脱氢酶基因导入能够高容量生产丙酮酸的酵母中(日本专利公开号(Kokai) 2002-136293 (A))。但是，该技术关注的是在能够高容量生产丙酮酸的酵母菌株中的高度浓缩的丙酮酸。因此，其中并未描述通过普通酵母的生产。
本发明提供了一种编码用于生产D-乳酸并具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸，并且还提供了此种蛋白质。此外，本发明提供了使用此种多核苷酸生产D-乳酸的优良系统以及有效生产D-乳酸的技术。
发明内容
为了达到以上目的，本发明人寻找了 D-乳酸脱氢酶及允许此酶表达的基因。结果，他们发现了一种表现出优秀D-乳酸生产能力的转化系。更具体地说，他们发现了能够正向影响D-乳酸产量并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质、编码具有此种酶活性的蛋白质的DNA以及自此种DNA制备的转化体。此外，他们发现了使用相同转化系生产D-乳酸的方法和生产聚乳酸的方法。
基于以上发现，本发明提供下列内容。
(1)在下列(a)-(g)中任意一项所述的多核苷酸
(a)包含SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的多核苷酸；[0012](b)在严格条件下能与包含SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的全部或部分或其互补链的探针杂交并编码具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(c)编码由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；
(d)编码包含通过替代、缺失、插入或者添加一个或几个氨基酸残基而自SEQ ID NO 2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)编码与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(f)编码具有通过选自表1所示氨基酸残基替代列表中的一个或多个氨基酸残基的替代而由SEQ ID NO 4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并且具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸
表1 氨基酉I残基替代列表[0018]替代类型替代位置氨基酸:替代[0019]140缬氨酸(Val)[0020]2112异亮氨I酸(Ile)[0021]3131组氨酸(His)[0022]4139异亮氨I酸(Ile)[0023]5181谷氨酸(Glu)[0024]6266甘氨酸(Gly)[0025]7267亮氨酸(Leu)[0026]8268苯丙氨I酸(Phe)[0027]9269天冬酰胺(Asn)[0028]10270谷氨酸(Glu)[0029]11271天冬氨I酸(Asp)[0030]12272色氨酸(Trp)[0031]13273丝氨酸(Ser)[0032]14274甘氨酸(Gly)[0033]15276谷氨酸(Glu)[0034]16277苯丙氨I酸(Phe)[0035]17287丝氨酸(Ser)[0036]18292亮氨酸(Leu)[0037]19293缬氨酸(Val)[0038]其中替代位置表示为从对应于起始密码子的[0039](g)编码具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨^
296位氨基酸残基的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。
(2)在下列(h)-(l)中任意一项所述的蛋白质
(h)由序列表SEQ ID NO 2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(i)由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列通过替代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基而衍生的氨基酸序列组成的并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质；
(j)与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质；
(k)具有通过选自表1所示氨基酸残基替代列表中一个或多个氨基酸替代自SEQ ID NO 4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质；或
(1)具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中78和79,152-175,235和296 位氨基酸残基的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质。
(3)包含含有(1)中DNA的DNA片段以及含有编码启动子或其相同物的DNA片段的DNA构建体。
(4)根据(3)的DNA构建体，其中启动子来自丙酮酸脱羧酶基因。
(5)根据(3)或(4)的DNA构建体，其中启动子来自酵母属(Saccharomyces)的丙酮酸脱羧酶1基因。
(6)根据(5)的DNA构建体，其中启动子来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisae) 丙酮酸脱羧酶1基因。
(7)以在宿主中可表达方式携带(1)中DNA的转化体。
(8)根据(7)的转化体，其中宿主是选自包括酵母和真菌在内的真核微生物和包括乳酸菌、埃希氏菌属(Escherichiai)细菌和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌在内的原核微生物的微生物。
(9)根据(7)或⑶的转化体，其中DNA以在启动子或其相同物控制下的一种可表达方式携带。
(10)根据(9)的转化体，其中启动子来自丙酮酸脱羧酶基因。
(11)根据(9)或(10)的转化体，其中启动子来自酵母属丙酮酸脱羧酶1基因。
(12)根据(11)的转化体，其中DNA以在宿主丙酮酸脱羧酶1基因启动子控制下可表达的方式携带。
(13)根据(7)-(1 中任意一项所述的转化体，其中宿主微生物是酿酒酵母。
(14) 一种生产D-乳酸的方法，包括步骤
培养(7)-(13)中任意一项所述的转化体；和
从培养产物中回收选自D-乳酸、其盐及其衍生物中的至少一种组分。
(15) 一种生产乳酸聚合物的方法，包括步骤
培养(7)-(13)中任意一项所述的转化体；
从培养产物中回收选自D-乳酸、其盐及其衍生物中的至少一种组分；和
使用回收的D-乳酸或其衍生物作为至少一种聚合材料生产乳酸聚合物。
本说明书包括在日本专利申请号2003-145085的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，它是本专利申请的优先权文件。
附图简述
图IA显示SEQ ID NO 1所示核苷酸序列与SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的同源性资料。
图IB是图IA的继续，显示SEQ ID NO :1所示核苷酸序列与SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的同源性资料。
图2显示SEQ ID NO 2所示氨基酸序列与SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的同源性资料。[0069]图3显示构建pBTRP-PDCI-DLDHME载体的部分过程。
图4显示构建pBTRP-PDCI-DLDHME载体的部分过程。
图5显示构建pBTRP-PDCI-DLDHME载体的部分过程。
图6显示构建pBTRP-PDCI-DLDHME载体过程的最后步骤。
图7显示在实施例3中获得的二倍体转化酵母菌株的部分染色体结构。
图8是显示由亲本菌株和染色体上整合有转基因的转化体产生的D-乳酸盐(钙盐)的发酵试验结果的图，该图显示了每个菌株产生的D-乳酸盐和乙醇的量。
图9是显示由亲本菌株、染色体上整合有转基因的转化体及自主复制质粒转化体产生的游离D-乳酸的发酵试验结果的图，该图显示了每个菌株产生的D-乳酸和乙醇的量。
图10是显示由导入2个拷贝D-LDHME基因的菌株和导入4个拷贝D-LDHME基因的菌株产生的游离D-乳酸的发酵试验结果的图，该图显示了每个菌株产生的D-乳酸和乙醇的量。
本发明的实施方案
本发明的多核苷酸包含编码具有D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性的蛋白质的核苷酸序列。
使用本发明的多核苷酸导致产生表达上述蛋白质的转化体和生产D-乳酸的转化体。同样，也可以通过使用涉及本发明多核苷酸编码的蛋白质的酶反应系统生产D-乳酸。
根据本发明，可以提供D-乳酸生产原材料的新的来源。根据本发明还可以高选择性或高效率地生产D-乳酸。
因此，本发明可提供使用酶反应系统生产乳酸聚合物的技术，其涉及使用本发明蛋白质或允许表达本发明蛋白质的转化体产生的D-乳酸。
以下描述本发明的多核苷酸、蛋白质、转化体、生产D-乳酸的方法等。
本发明的多核苷酸包括以下任意一条。
即
(a)包含SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的多核苷酸；
(b)在严格条件下与包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的全部或部分或其互补链的探针杂交并编码具有D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性的蛋白质的多核苷酸；
(c)编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；
(d)编码由自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通过替代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基而衍生的氨基酸序列组成的并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)编码与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(f)编码具有通过选自表1所示氨基酸残基替代列表中的一个或多个氨基酸残基的替代而自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；或
(g)编码具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中78和79、152_175、235和 296位氨基酸残基的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸。
由本发明SEQ ID NO :1所示核苷酸序列组成的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。并且，此种多核苷酸来源于一种乳酸细菌肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)。更具体地说，此种多核苷酸来源于肠膜明串珠菌IF03^6 株(注册于 Institute forFermentation)。
该多核苷酸序列与GenBank注册的的序列(GenBank登录号U9327)有27bp核苷酸的差别。结果，该多核苷酸编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)与注册核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)有19个氨基酸残基不同。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列与SEQ ID NO :3所示核苷酸序列有97. 3%的同源性。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列与SEQ ID NO 4所示氨基酸序列有94. 3%的同源性。此种同源性是使用Genetyx-mac 10. 1版(Software Development Co. , Ltd.)计算的。
本发明涉及编码具有D-LDH活性蛋白质的多核苷酸。在本发明中，此种多核苷酸可以是天然存在的多核苷酸如DNA或RNA。备选地，此种多核苷酸可以包含人工合成的核苷酸衍生物。它可以是单链的或者是具有互补链。
根据本发明的实施方案，多核苷酸具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。SEQ ID N0 1所示多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白质。
根据本发明多核苷酸的另一个实施方案，多核苷酸编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质。具有编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸是符合条件的。
根据本发明的进一步实施方案，多核苷酸由自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失、插入或者添加而衍生的氨基酸序列组成并且具有编码具有D-LDH活性的蛋白质的核苷酸序列。可以推断具有自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通过替代、缺失、插入或者添加一个或几个氨基酸残基而衍生的氨基酸序列的多核苷酸会具有与拥有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸的相同的D-LDH活性。这是因为来自于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的D-LDH活性推断与由其通过替代、缺失、插入或者添加一个或几个氨基酸残基衍生的氨基酸序列的D-LDH活性相当。通过这种氨基酸替代等方法， 本领域技术人员能正常地筛选具有D-LDH活性的蛋白质，该蛋白质在本发明中可得到充分利用。
本领域技术人员通过定点诱变(NucleicAcid Res.，10，6487 页，1982 ;Methods in Enzymol. , 100,448 Jit, 1983 ；Melecular Cloning,第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；PCR :A Practical Approach, IRL Press，200 页，1991)或通过其它方法适当地将突变例如替代、缺失、插入、和/或添加引入具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的多核苷酸中。“几个氨基酸”优选地是约2-10个氨基酸残基，并且更优选地是约2-4 个氨基酸残基。
根据本发明的进一步实施方案，多核苷酸在严格条件下能与包含SEQID NO 1所示核苷酸序列的全部或部分或其互补链的探针杂交并编码具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质。能在严格条件下与此种多核苷酸杂交的探针至少包含由由SEQ ID N0:1所示序列中20 或以上、优选地30或以上(例如40、60或100)连续核苷酸组成的任意一个DNA序列。多核苷酸可在严格条件下与SEQ ID NO :1所示DNA或此类探针杂交。例如，在严格条件下，杂交在约37°C及50%甲酰胺存在下进行。在更严格的条件下，杂交在约42°C进行。在进一步严格的条件下，杂交在约65°C及甲酰胺存在下进行。[0100]能在严格条件下与SEQ ID NO 1所示核苷酸序列组成的DNA或探针杂交的多核苷酸实例是具有与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列相似的核苷酸序列的多核苷酸。此种多核苷酸很可能编码与那些由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列组成的蛋白质具有相同功能的蛋白质。
根据本发明的进一步实施方案，多核苷酸编码的蛋白质与SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列显示70%或更高，优选地80%或更高，更优选地90%或更高，并且进一步优选地95%或更高的同源性，并且具有D-乳酸脱氢酶活性。使用基因分析程序BLAST(超链接http://blast· genome, ad. jphttp://blast· genome, ad. jp)、FASTA (超链接http:// fasta. genome, ad. jp/SIT/FASTA. htmlhttp: //fasta. genome, ad. jp/SIT/FASTA. html)等进行蛋白质同源性检索。此处使用的术语“同源性”是指通过这些程序观察到的同一性。
本发明的多核苷酸编码的蛋白质具有通过选自表1所示氨基酸残基替代列表中的一个或多个氨基酸残基的替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列而衍生的的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶活性。SEQ ID NO :4所示氨基酸序列是注册于GenBank的肠膜明串珠菌的D-LDH序列(GenBank登录号L29327)。SEQ ID NO 2所示氨基酸序列是通过选自表1 所示氨基酸残基替代列表中标明的全部替代而自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生而来。 然而，即使没有对氨基酸序列进行全部替代，也可以获得可以在本发明中使用的具有D-LDH 活性的蛋白质。替代的数目优选地是2个或以上，更优选地是11个或以上，并且更优选地是19个或以上。
在表1所示的氨基酸残基替代列表中，优选地是替代类型1-19所指的氨基酸残基替代。更优选地是替代类型6-16所指的氨基酸残基替代。
根据本发明的进一步实施方案，多核苷酸编码的蛋白质具有至少含有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中的78和79、152-175、235和296位氨基酸残基的氨基酸序列并具有 D-LDH活性。78和79、152-175、235和296位氨基酸残基被认为是SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的特征。当一个多核苷酸含有此种氨基酸序列并具有D-LDH活性时，可以说它是本发明优选的多核苷酸。更优选地，多核苷酸具有在296位作为活性中心的组氨酸残基以及由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中152-175位氨基酸残基组成的辅酶NADH结合结构域。
如上所述，本发明的多核苷酸除了是由SEQ ID NO 1所示核苷酸序列组成的或包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列以外，可以是具有与上述多核苷酸编码的蛋白质的功能具有相同功能的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可通过以上提及的多种技术获得。此外，该多核苷酸可以化学合成，或者根据SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通过PCR克隆、杂交等从其它生物获得。例如，多核苷酸可从原核生物如乳酸菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或真菌来源的蛋白质或者真核生物如酵母或章鱼来源的蛋白质中分离。备选地，可以采用Fujimoto等的方法，此方法已知用于合成长链 DNA(Hideya Fujimoto, "Gousei idenshi no sakuseihou(Production of synthetic genes)，，，Shokubutsusaibo kogaku (Plant Cell Technology)，丛书 7，Shokubutsu no PCR jikkenpurotokoru (Protocol of plant PCR experiments)，1997，95-100页，Shujunsha)。
在本发明中，多核苷酸没必要是由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列组成的多核苷酸的同系物。这是因为导入此种多核苷酸的本发明的转化体是用于生产D-LDH和D-乳酸。[0108]例如，不管多核苷酸是否具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或者是其同系物，还可以采用编码来源于原核生物如乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或真菌的具有D-LDH活性的蛋白质的多核苷酸或者编码来源于真核生物如酵母或章鱼的具有D-LDH活性的蛋白质的多核苷酸。
(蛋白质)
本发明的蛋白质由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列组成或者包含SEQID NO 2所示氨基酸序列。此种蛋白质是本发明优选的实施方案。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白质由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失、插入或添加而衍生的氨基酸序列组成并具有D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性。根据进一步的实施方案，蛋白质表现出与SEQ ID NO :2所示氨基酸序列具有70 %或更高，优选地80 %或更高，更优选地90 %或更高并且进一步优选地95 %或更高的同源性并且具有D-LDH活性。
根据进一步的实施方案，蛋白质具有通过选自表1所示氨基酸残基替代列表中的一个或多个氨基酸残基替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列而衍生的氨基酸序列并具有 D-LDH活性。SEQ ID NO 4所示氨基酸序列是注册于GenBank的肠膜明串珠菌的D-LDH的序列(GenBank登录号L29327)。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列是通过表1所示氨基酸残基替代列表中所示的全部替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生的。然而，即使没有对氨基酸序列进行全部替代，仍然可以获得本发明中使用的具有D-LDH活性的蛋白质。替代数目优选地是2个或以上，更优选地11个或以上并且进一步优选地19个或以上。
氨基酸序列优选地是具有表1所示氨基酸残基替代列表中替代类型1-19所示的氨基酸替代，并且更优选地是具有替代类型6-16所示的氨基酸替代。
根据本发明的进一步实施方案，蛋白质包含至少含有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的78和79、152-175、235和296位氨基酸残基的氨基酸序列并具有D-乳酸脱氢酶 (D-LDH)活性。78和79、152-175、235和296位氨基酸残基被认为是SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的特征。当蛋白质包含此种氨基酸序列并具有D-LDH活性时，可以说它是本发明优选的蛋白质。更优选地，蛋白质具有在296位作为活性中心的组氨酸残基和由SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的152-175位氨基酸残基组成的辅酶NADH结合结构域。
本发明的蛋白质没必要由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列组成，只要它具有D-LDH 活性即可。
本发明的蛋白质可以通过培养肠膜明串珠菌IF03^6株获得。具体而言，蛋白质可以作为其培养产物得到。此菌株可通过常规细菌培养技术培养。本发明的蛋白质能按照常规技术从培养产物中纯化。备选地，培养产物本身或者细菌可以回收并用作本发明具有酶活性的物质。可以使用细菌、纯化酶或粗纯化酶，因为它们是固定化的或者可以固定化。
可以通过例如定点诱变(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等著，8. 1-8. 5节，1987，John Wily & Sons)向SEQ ID NO :2所示氨基酸序列或其它氨基酸序列中适当地引入突变如替代、缺失、插入、和/或添加来获得本发明的蛋白质。此种修饰并不限于人工诱变或合成。它还包括来自本质上基于人工突变的氨基酸突变的产物，但也并不仅限于此。
此外，可以得到由SEQ ID NO 1所示核苷酸序列组成的多核苷酸或作为其同系物的DNA，此种DNA可以导入宿主菌株以制备转化体，然后培养所得到的转化体。因此，可以得到同系物蛋白质。
例如，在本发明中，可以使用具有D-LDH活性的已知蛋白质。可以使用的蛋白质的实例包括来源于原核生物如乳杆菌(Lactobacillus)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或真菌的蛋白质或者来源于真核生物如酵母或章鱼的蛋白质。
此种蛋白质没必要具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。它没必要是由此种氨基酸序列组成的蛋白质的同系物。以可表达方式携带具有D-LDH活性的蛋白质的本发明的转化体是用于生产D-LDH和D-乳酸。
优选的用于获得本发明多核苷酸或者蛋白质、本发明转化体的细胞和为多核苷酸或蛋白质的基因来源的细胞并不限于自天然存在的生物。通过突变等获得的微生物或细胞可用作基因资源。
本发明使用的蛋白质具有D-LDH活性。例如，此种活性可以使用一种商业试剂盒 (乳酸脱氢酶(LDH/LD)测试-UV(Sigma))测定。
(DNA 构建体)
编码具有D-LDH活性蛋白质的分离的多核苷酸(DNA，当多核苷酸是DNA时在下文中称作“D-LDH-DNA”)可用于制备含有此DNA片段的DNA构建体。该DNA构建体可以以此种状态作为表达载体使用或者通过导入合适载体作为表达载体使用。用此DNA构建体转化宿主细胞。因此，获得了产生D-LDH活性蛋白质的转化体。此外，可培养该转化体以生产具有D-LDH活性的蛋白质。同样还可以生产D-乳酸。
宿主细胞的转化涉及DNA构建体的使用，所述DNA构建体允许包含D-LDH-DNA的 DNA片段在宿主细胞中表达。对用于转化的DNA构建体的实施方案没有特殊限制。根据所导入外源基因的形式(位于染色体外或位于染色体上)或宿主细胞的类型，可选择质粒 (DNA)、噬菌体(DNA)、反转录转座子(DNA)或人工染色体(例如，YAC、PAC、BAC或MAC)。因此，该DNA构建体除了包含目的DNA外还包含上述任意一个实施方案所述载体的组成片段。 优选的原核载体、真核载体、动物细胞载体和植物细胞载体为本领域公知。
质粒DNA的实例包括YCp大肠杆菌-酵母穿梭载体，如pRS413、pRS415、pRS416、 YCp50、pAUR112或pAUR123 ；YEp大肠杆菌-酵母穿梭载体，如pYES32或YEpl3 ；YIp大肠杆菌-酵母穿梭载体，如 pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAURlOl 或 pAUR135 ；来源于大肠杆菌的质粒(例如，CoIE 质粒，如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、 pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396 或 pTrc99A ；plA 质粒，如 pACYC177 或 pACYC184 ； 或pSClOl质粒，如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)和来源于枯草芽孢杆菌的质粒，如 pUBllO或pTP5。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(例如，Charon4A、Charon21A、EMBL3、 EMBL4、AgtlOO、gtll 或 zap)、Φ X174、M13mpl8 和 M13mpl9。反转录转座子的一个实例是 Ty因子。YAC的一个实例是pYACC2。
例如，目的DNA构建体可通过用适当的限制性酶切下包含D-LDH-DNA的片段并将其插入所使用载体DNA的限制性位点或多克隆位点来制备。
根据本发明的第一个实施方案，DNA构建体包含与由D-LDH-DNA组成的DNA片段以可表达方式连接的启动子片段。具体而言，这种DNA片段连接至启动子的下游位点，以致于启动子能够控制此DNA片段。[0129]具有D-LDH活性的蛋白质优选地在酵母中表达。因此，优选使用能够在酵母中表达该蛋白质的启动子。可优选使用的启动子的实例包括丙酮酸脱羧酶基因启动子、gall启动子、gallO启动子、热激蛋白启动子、MF α 1启动子、ΡΗ05启动子、PGK启动子、GAP启动子、 ADH启动子和AOXl启动子。特别优选的启动子是来源于酵母属的丙酮酸脱羧酶1基因的启动子，更优选地是使用来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶1基因的启动子。由这些启动子诱导的蛋白质的表达在酵母(酿酒酵母)的乙醇发酵途径中得到加强。通过PCR扩增分离目的启动子序列，其中使用酵母属酵母的丙酮酸脱羧酶1基因的基因组DNA作为模板。例如， SEQ ID NO :5显示了来源于酿酒酵母的启动子的核苷酸序列。DNA构建体中的启动子片段可以是由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列组成的DNA、由通过缺失、替代、插入和/或添加一个或几个核苷酸自SEQ ID NO :5所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列组成并具有启动子活性的DNA、或者能够在严格条件下与包含SEQID NO 5所示核苷酸序列的全部或部分或其互补链的DNA杂交并具有启动子活性的DNA(即，此种启动子的相同物)。也可以使用来源于其它类型酵母或其它类型酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因或丙酮酸脱羧酶1基因的启动子。
根据本发明的第二个实施方案，DNA构建体除包含目的DNA以外还包含用于与宿主染色体同源重组的DNA片段。用于同源重组的DNA片段具有与位于目的DNA所插入的宿主染色体上的靶位点邻近的DNA序列同源的DNA序列。DNA构建体至少包含1个并且优选是2个用于同源重组的DNA片段。例如，与位于染色体上靶位点上游和下游位点的DNA同源的DNA序列是作为用于同源重组的2个DNA片段提供的，并且目的DNA优选地连接至这些DNA片段之间的位点。
当通过同源重组将目的DNA导入宿主染色体时，此DNA以可被宿主染色体上的启动子控制的方式导入。在这种情况下，靶基因的导入也可能破坏本应由启动子控制的内源基因并且允许外源D-LDH-DNA的表达而不是内源基因的表达。当此种启动子在宿主细胞中能增强表达时特别有用。
为了在宿主染色体上产生此种表达系统，将能够增强表达的基因靶向宿主染色体上，并且优选地是将D-LDH-DNA导入启动子下游的位点，其中所述的启动子以D-LDH-DNA可被此种启动子控制的方式控制着目的基因。当用乙醇发酵微生物如酵母作为宿主时，靶向地是丙酮酸脱羧酶基因(特别是丙酮酸脱羧酶1基因)，并且编码具有LDH活性蛋白质的 DNA可以导入至内源丙酮酸脱羧酶基因启动子控制下。在这种情况下，用于同源重组的DNA 片段可与丙酮酸脱羧酶1基因的LDH结构基因结构域的序列或者其临近的序列(包括启始密码子附近的序列、起始密码子的上游序列、结构基因序列等)同源。DNA构建体可以包含丙酮酸脱羧酶基因启动子的片段。
优选地，使用酵母属酵母(特别是酿酒酵母)作为宿主，并且制备了靶向该宿主的丙酮酸脱羧酶1基因的DNA构建体。此种DNA构建体破坏了丙酮酸脱羧酶1基因并且通过使用单一载体用D-LDH替代了该结构基因部分。丙酮酸脱羧酶1是介导从丙酮酸到乙醛的不可逆反应的一种酶。其基因的破坏能抑制丙酮酸到乙醛以及随后到乙醇的转变。通过使用丙酮酸作为底物也能够加速通过D-LDH的D-乳酸的产生。
根据第一个实施方案的DNA构建体也可以是通过包含用于与宿主染色体进行同源重组的DNA片段而用于同源重组的DNA构建体。在根据第一个实施方案的DNA构建体的情况下，其启动子片段也可以作为与宿主染色体进行同源重组的DNA片段。例如，具有酿酒酵母宿主染色体启动子的DNA构建体(例如以丙酮酸脱羧酶1基因启动子作为启动子片段)构成具有作为靶位点的宿主基因的寻靶载体。在此种情况下，DNA构建体优选地包含与位于丙酮酸脱羧酶1基因下游的结构基因结构域序列同源的序列。
根据需要，除了终止子外，可将顺式元件如增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标记或核糖体结合序列(SD序列)连入DNA构建体。对选择标记并不作特别限定，可以使用的多种常规选择标记基因包括药物抗性基因和营养缺陷型基因。例如，可以使用二氢叶酸还原酶基因、潮霉素B基因和新霉素抗性基因。
(使用DNA构建体的转化)
一旦制备了 DNA构建体，可以通过任意一种适当的技术如转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、脂质体转染、醋酸锂法、粒子枪法、磷酸钙沉淀、农杆菌法、PEG法或直接微注射将此种DNA构建体导入合适的宿主细胞。在DNA构建体导入后，在选择性培养基上培养受体细胞。
宿主细胞的实例包括细菌如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；酵母如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；昆虫细胞如sf9和sf21 ；动物细胞如COS细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和植物细胞如甘薯和烟草。 优选地，宿主细胞是乙醇发酵微生物或抗酸微生物如酵母。其实例包括酵母属酵母如酿酒酵母。其具体实例包括酿酒酵母IF02260株和YPH株。
由目的DNA构建体制备的转化体包含位于染色体或染色体外元件(包括人工染色体)的此种DNA构建体组分。当DNA构建体在染色体外或通过随机整合整合至染色体上维持时，以丙酮酸作为底物的另一种类型的酶的基因(其中丙酮酸也是LDH的底物)例如丙酮酸脱羧酶基因(及酿酒酵母中丙酮酸脱羧酶1基因)优选地通过寻靶载体被敲除。
如果已导入上述能够进行同源重组的DNA构建体，连接的D-LDH-DNA以启动子能够控制D-LDH-DNA的方式位于目的启动子或由目的启动子或其相同物替代的启动子的下游位点。酵母属酵母转化体优选地在宿主染色体上包含D-LDH-DNA，其中D-LDH-DNA以启动子能够控制D-LDH-DNA的方式位于丙酮酸脱羧酶1基因启动子或由启动子或其相同物替代的启动子的下游位点。通常，同源重组体在D-LDH-DNA下游的位点包含选择标记基因或已破坏结构基因的一部分(对应于DNA构建体上的同源序列的位点)。
导入DNA构建体的结果是产生了由D-LDH-DNA编码的蛋白质。在酵母的丙酮酸脱羧酶基因被破坏的同时，导入了在该基因启动子或其相同物控制下的D-LDH。这导致原先不产生D-乳酸的酵母类型产生了 D-LDH，反过来D-LDH导致D-乳酸的产生。
更具体地说，将D-LDH-DNA导入酵母(具体而言是酵母属，并且一般是酿酒酵母) 丙酮酸脱羧酶1基因启动子或其相同物的下游位点可导致选择性产生D-乳酸。据推断如果D-LDH-DNA编码具有D-LDH活性的蛋白质，借助于此种启动子D-LDH的表达得到增强，这种情况也正向作用于使D-乳酸的生产增强。相反，D-LDH-DNA编码由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列组成的蛋白质。由此推断将导致D-乳酸的增强生产和/或选择性生产。
可通过PCR、Southern杂交或其它方法验证是否已经将D-LDH-DNA导入至目的启动子的下游位点。例如，可从转化体制备DNA，利用用于基因定点诱变的引物对该DNA进行 PCR，然后对PCR产物进行电泳以检测预期条带。备选地，可以利用荧光染料等标记的引物通过PCR验证。还可以根据转化体产生的蛋白质验证。这些技术均为本领域所公知。[0144]优选地是制备通过导入一个DNA构建体而将多拷贝D-LDH基因导入的转化体。例如，当制备酵母转化体时，导入至少2拷贝并且优选地是4-10拷贝D-LDH-DNA。导入多拷贝 D-LDH基因的转化体显著提高了 D-乳酸的生产能力。也就是说，使用导入多拷贝D-LDH基因的转化体能导致D-乳酸生产力的显著提高。
(D-乳酸的生产)
培养导入本发明DNA构建体的转化体导致培养物中D-LDH的产生，D-LDH是外源基因的表达产物。这还进一步导致D-乳酸的产生。通过分离乳酸的步骤能从培养产物中获得乳酸。在本发明中，除了培养物上清以外培养产物的实例还包括培养的细胞或细菌以及破坏的细胞或细菌。
在本发明中，D-乳酸可以选择性产生，例如，使用最初不产生D-乳酸的酵母细胞类型作为宿主。使用发酵微生物对于获取D-乳酸特别有效。由于其快速的生长率，来源于酵母的转化体有效增强D-乳酸的生产。随着对具有选择性生产D-乳酸能力的转化体的使用，不再需要分离光学异构体，从而导致更加有效地生产D-乳酸。
根据转化体的类型，本发明的转化体可在适当的条件下培养。此种适当条件为本领域公知。
作为用于培养从微生物宿主如大肠杆菌或酵母获得的转化体的培养基，天然的或者合成的培养基均可使用，只要它含有微生物可同化的碳源、氮源和无机盐并且能够有效培养转化体即可。碳源的实例包括碳水化物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和纤维素；有机酸如乙酸和丙酸；以及醇如乙醇和丙醇。氮源的实例包括氨、无机酸或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉汤提取物及玉米浸泡液。无机物的实例包括磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
通常，培养在有氧条件下(如振荡培养或通气搅拌培养)于30°C培养适当的一段时间。例如，培养6-120小时。在培养过程中，pH值优选地保持在2. 0-6.0。可用无机酸或有机酸、碱性溶液等调节PH值。
用于培养从动物宿主细胞获得转化体的培养基实例包括普通的RPMI1640培养基、DMEM培养基和通过向上述培养基中添加胎牛血清等制备的培养基。通常，培养在有5% CO2条件下于37°C进行1-30天。在培养过程中，如果需要可向培养基中加入抗生素如卡那
霉素或青霉素。
可以通过分批或连续系统进行培养。还可以通过对转化体进行碱中和(如用铵或钙盐)的方法进行培养以获得乳酸盐如D-乳酸铵或D-乳酸钙。备选地，培养产物可以是游离的D-乳酸。
培养完成之后，通过普通纯化技术等的适当组合能从培养产物中分离基因产物 D-乳酸。例如，当转化细胞中产生了 D-乳酸，可通过传统技术如超声破碎、研磨或压碎破坏细胞以便从这些细胞中分离基因产物。在这种情况下，可根据需要加入蛋白酶。当D-乳酸产生于培养物上清中时，需对溶液进行过滤、离心或其它方法以去除固体成分。
例如，在培养步骤结束后，可通过压带法、离心或压滤中的至少一种方式对培养液进行一步固相-液相分离。对分离后的滤液优选地进行纯化。例如，在纯化步骤中，含乳酸的滤液可进行电透析以去除除乳酸和糖类以外的有机酸。因此，乳酸或乳酸铵的水溶液得以制备。在乳酸铵溶液的情况下，通过双极膜等降解氨以便从氨水中分离乳酸水溶液。当滤液中除乳酸外的有机酸含量或糖的含量相对少时，不要进行电透析。在这种情况下，可根据需要通过蒸发水分对滤液进行浓缩，并通过双极膜使氨降解。
电透析时溶液的温度一般在20°C -45°C，优选地是35°C -40°C。不能通过电透析去除的氨基酸、无机离子(例如，K、Ca或Mg)和有机酸(例如，柠檬酸或苹果酸)可在后期阶段使用色谱分离器或离子交换剂去除。此外，如果需要可以对获得的乳酸溶液进行浓缩。 例如，蒸发溶液中的水分可获得50% -90%的乳酸溶液。
从培养液或粗提物中分离和纯化D-乳酸或其盐的技术并不仅限于前面所述。多种纯化和分离技术可用于分离和纯化D-乳酸或其盐，如使用有机溶剂分离和提取或蒸馏。 如果需要，可对培养液、粗提物及其纯化产物进行酯化反应、丙交酯转换、寡聚化、预聚合等。因此，可以获得多种D-乳酸衍生物。根据需要可以从发酵的乳酸溶液中回收D-乳酸、 其盐及其衍生物中的一种或多种。
也可以通过使用本发明所述的具有D-LDH活性的蛋白质的酶反应系统代替培养系统生产D-乳酸。D-乳酸能够在任何酶反应条件下生产，只要酶反应条件允许D-乳酸生产即可。多种诱导技术可应用于通过此种技术获得的D-乳酸。
(乳酸聚合物的产生)
获得的D-乳酸、其盐以及其衍生物可作为至少一种类型聚合材料使用以生产乳酸聚合物。可用作聚合材料的实例包括单体如D-乳酸或其衍生物以及由这种单体聚合至适当长度形成的预聚物或低聚物。此外，也可以使用L-乳酸或其衍生物及其预聚物或低聚物。
乳酸聚合物的实例包括D-乳酸同聚物、D-乳酸和L-乳酸的杂聚物、 hetero-block聚合物及乳酸与其它聚合材料的多种类型的杂聚物。
这些乳酸聚合材料、或者乳酸聚合材料和另一种聚合材料可与适当的聚合引发剂反应产生乳酸聚合物。
根据本发明，选择性和/或增强生产D-乳酸是可能的。因此，可有效获得D-乳酸， 并因此导致以D-乳酸作为聚合物材料的乳酸聚合物的有效生产。
实施例
从此处开始将描述本发明的实例，但本发明并非仅限于此。在本发明的范围内可进行多种修改。
实施例1 :D_乳酸脱氢酶基因的分离
分离了来源于原核乳酸细菌肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶基因(D-LDH基因，此后简称“D-LDHME基因”)。
以IF03426株(注册于化8{行肚6 for Fermentation)的基因组DNA作为模板通过PCR扩增分离该基因。使用基因组DNA制备试剂盒(Fast DNAKit, Bio 101)根据试剂盒内的方法制备该菌株的基因组DNA。用Ultrospec3000分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech)测定所制备基因组DNA的DNA浓度。
使用具有高正确性的KOD Plus DNA聚合酶(Toyobo Co.，Ltd)作为PCR的扩增酶。反应液(共50μ1)包含50ng先前制备的基因组DNA，各50pmol的两种引物DNA，5y 1 10 X KOD 酶反应缓冲液，2 μ 1 25mMMgS04, 5 μ 12mM dNTP 混合物和 1. 0 单位的 KOD plus DNA 聚合酶，用 PCR扩增仪(Gene Amp PCR system 9700,PE Applied Biosystems)进行 DNA扩[0169]在下述条件下进行PCR。首先于96°C进行2分钟的热处理，接着进行3阶段温度变化循环(96 °C，30秒；53°C，30秒和72 °C，90秒)。此循环重复25次，并且结束时温度降至4°C。将反应样品(5 μ 1)用1 % TBE琼脂糖凝胶(含0. 5 μ g/ml溴化乙锭)电泳，并且通过用2Mnm的紫外线(Fimakoshi)照射凝胶来检测DNA条带以确定扩增的基因片段。
使用合成的DNA引物(Sawady Technology)进行反应，并且这些引物的DNA序列显示如下。
· DLDEME-U (2 lmer, Tm {t 57. 2 °C )
5' -ATG AAG ATT TTT GCT TAC GGC—3' (SEQ ID NO 6)
· DLDEME-U (24mer，Tm 值 54. 7 °C )
5' -ATC TTA ATA TTC AAC AGC AAT AGC-3‘ (SEQ ID NO 7)
将PCR 扩增的片段亚克隆入 pBluescriptll SK+载体(Toyobo Co.，Ltd.)。反应根据一般的DNA亚克隆技术进行。具体而言，用T4 DNA连接酶将在实施例1中得到的扩增基因片段连接到用限制性酶EcoRV (Takara Shuzo Co.，Ltd.)和碱性磷酸酶去磷酸酶 (Takara Shuzo Co.，Ltd.)处理的上述载体中。使用！"4 DNA连接酶的反应使用LigaFast RapidDNA Ligation(Promega)根据其附带的方法进行。
随后，将连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。使用大肠杆菌JM109感受态细胞 (Toyobo Co.，Ltd.)，并且根据其附带的方法进行转化。在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB 平板上进行菌落筛选，从每个筛选的菌落中制备质粒DNA，并使用前述引物DNA对质粒DNA 进行 PCR 以亚克隆目的 D-LDH 基因。根据 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，Maniatis 等编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 中的指导进行乙醇沉淀、限制性酶处理等。
测定获得的D-LDH基因的核苷酸序列。使用仪器ABI PRISM 310Genetic Analyzer (ΡΕ Applied Biosystems)进行核苷酸分析，并且根据仪器的说明书确定样品的制备方法、仪器的使用以及其它条件。通过碱提取法制备包含所分离D-LDH基因的载体 DNA，然后使用GFX DNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)柱纯化载体DNA，接着使用Ultrospec3000分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech)测定DNA浓度，并且使用已进行浓度调整的载体DNA。
通过序列分析确定的DNA序列显示于SEQ ID NO :1，并且相应的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO :2ο
将本实施例中分离的D-LDHME基因的核苷酸序列与已在GenBank中注册的D-LDH 基因序列(GenBank登录号L29327，来源于乳酸菌肠膜明串珠菌，SEQ ID NO 3)进行比较。 结果显示它们在氨基酸序列水平有19个氨基酸残基的差异，在核苷酸序列水平有27bp核苷酸的差异。
图IA和图IB显示了本实施例中获得的D-LDHME基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)与已在GenBank中注册的D-LDH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)的同源性资料。上面的序列为本实施例获得的D-LDHME基因的核苷酸序列，并且下面的序列为已在GenBank中注册的D-LDH基因的核苷酸序列。
图2显示了对应于本实施例获得的D-LDHME基因核苷酸序列的氨基酸序列(SEQID NO 2)与对应于已在GenBank中注册的D-LDH基因核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的同源性资料。上面的序列为对应于本实施例中获得的D-LDHME基因的氨基酸序列， 下面的序列为对应于已在GenBank中注册的D-LDH基因的氨基酸序列。 基于氨基酸序列，发现在本实施例中获得基因的氨基酸序列有表2所示的氨基酸残基替代。
0183] 表2 氨基酸残基替代列表
0184]替代类型替代位置氨基酸替代0185]140缬氨酸(Val)0186]2112异亮氨酸(Ile)0187]3131组氨酸(His)0188]4139异亮氨酸(Ile)0189]5181谷氨酸(Glu)0190]6266甘氨酸(Gly)0191]7267亮氨酸(Leu)0192]8268苯丙氨酸(Phe)0193]9269天冬酰胺(Asn)0194]10270谷氨酸(Glu)0195]11271天冬氨酸(Asp)0196]12272色氨酸(Trp)0197]13273丝氨酸(Ser)0198]14274甘氨酸(Gly)0199]15276谷氨酸(Glu)0200]16277苯丙氨酸(Phe)0201]17287丝氨酸(Ser)0202]18292亮氨酸(Leu)0203]19293缬氨酸(Val)
0204]在本表中，替代位置表示为从对应于起始密码子的蛋氨酸开始的位置。
0205]实施例2 重组载体的构建
0206]构建了能够表达目的基因(即在实施例1中获得的D-LDHME基因)的染色体整合载体。载体能够在来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶1基因(PDCl)启动子序列的控制下表达目的基因。这种新构建的并进行染色体整合的载体称作PBTRP-PDC1-DLDHME载体。载体的构建按照DNA亚克隆的一般技术进行。
此后，本实施例中载体构建过程的详细描述参考图3-6。
所有用于载体构建的酶由Takara Shuzo Co.，Ltd生产。应该指出可能的载体构建过程并不仅限于该过程。
1. PDCl基因启动子片段(PDClP)和PDCl基因下游片段(PDClD)的分离
对于载体构建所必需的971-bp的PDCl基因启动子片段(PDClP)和518_bp的PDCl 基因下游片段(PDClD)从基因来源如酿酒酵母IF02260株通过使用该株基因组DNA作为模板的PCR扩增分离。IF02^0株注册于hstitute for Fermentation。使用基因组DNA制备试剂盒(Fast DNA Kit,Bio 101)根据试剂盒内的说明书制备该菌株的基因组DNA。使用Ultrospec3000分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech)测定所制备基因组DNA的浓度。
用具有高正确性的KOD Plus DNA聚合酶(Toyobo Co.，Ltd)作为PCR的扩增酶。 反应液(共50 μ 1)包含50ng先前制备的IF02260株的基因组DNA，各50pmol的两种引物 DNA, 5 μ 1 10XK0D 酶反应缓冲液，2 μ 125mM MgSO4, 5 μ 1 2mM dNTP 混合物和 1. O 单位 KOD plus DNA聚合酶，用 PCR扩增仪(Gene Amp PCR system 9700,PE Applied Biosystems)进行DNA扩增。
在下述条件下进行PCR。首先于96°C进行2分钟的热处理，接着进行3阶段的温度变化循环(961，30秒；531，30秒和721，90秒)。该循环重复进行25次，并且在结束时温度降至4°C。反应样品(5 μ 1)在TBE琼脂糖凝胶(含0.5 μ g/ml溴化乙锭)上电泳，通过用2Mnm的紫外线(Fimakoshi)照射凝胶来检测DNA条带以便确定扩增的基因片段。
使用合成的DNA引物(Sawady Technology)进行反应，并且这些引物的DNA序列显示如下。
[用于PDClP片段扩增的引物]
· PDC1P-LDH-U(31mer, Tm 值 58. 3 °C )
5' -ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C_3' (SEQID NO 8)(下划线部分=BamHI位点)
· PDCIP-LDH-D (3 Imer，Tm 值 54. 4°C )
5' -ATA TAT GM TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G_3' (SEQID NO :9)(下划线部分=EcoRI位点)
[用于PDClD片段扩增的引物]
· PDC1D-LDH-U(31mer, Tm 值 55. 3 °C )
5' -ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C-3' (SEQ ID N0:10) (下划线部分AhoI位点)
· PDC1D-LDH-D (31mer, Tm 值 65. 2 °C )
5' -ATA TAT GGG CCC CCC CTC GAG GTC CCC CCT C_3' (SEQ ID NO :11)(下划线部分ApaI位点)
在上述反应中获得的PDClP和PDClD基因的扩增片段通过乙醇沉淀纯化，并且分别用限制性酶BamHI和EcoRI以及限制性酶BioI和ApaI酶切扩增的PDClP片段和PDClD 片段°根据Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第二版,Maniatis等编，Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989中的指导进行乙醇沉淀和限制性酶切。
2. pBPDClP载体的构建
用T4 DNA连接酶将通过PCR扩增及限制性酶切的PDClP片段连接到用限制性酶 BamHI 和 EcoRI (Takara Shuzo Co.，Ltd.)以及碱性磷酸酶去磷酸酶(BAP) (Takara Shuzo Co.，Ltd.)处理的 pBluescriptll SK+ 载体(Toyobo Co.，Ltd.)上(图 3，上面的部分)。 使用LigaFast Rapid DNALigation (Promega)根据其附带的方法进行！"4 DNA连接酶的反应。[0227]随后，将连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。使用大肠杆菌JM109感受态细胞 (Toyobo Co.，Ltd.)根据其附带的方法进行转化。所得的培养液涂布于含ΙΟΟμ g/ml抗生素氨苄青霉素的LB平板上并培养过夜。使用引物DNA对长出的菌落进行菌落PCR，并对通过微量制备方法制备的质粒DNA溶液进行限制性酶处理以确定插入的片段然后分离目的 PBPDC1P载体(图3，中间部分)。
3. pBPDClP-LDHI 载体的构建
如图3所示，可以通过使用限制性酶EcoRI和AatII以及末端修饰酶(即 T4 DNA聚合酶)处理由Toyota Motor公司构建的pYLDl载体(日本专利公布号 (Kokai) 2001-204468 (A))获得 LDH 基因(来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium Iongum)) 片段，并将其亚克隆至已经如上述方式用限制性酶EcoRI及末端修饰酶(即T4 DNA聚合酶)进行过相似处理的PBPDCIP载体中。因此，pBPDClP-LDHI载体得以制备(图3，中间至下面部分)。将上述的PYLDl载体导入大肠杆菌(命名“大肠杆菌pYLDl”)，并且依照布达佩斯条约于1999年10月沈日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所 (National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)专利生物保藏 Φ·1^ (International Patent OrganismDepositary) (Tsukuba Central 6，1—1—1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki，305-8566，日本)，保藏号为 FERM BP-7423 (原始保藏)。
4. pBPDClP-LDH 载体的构建
如图4所示，将用限制性酶BioI和ApaI处理的pBPDClP-LDHI载体与用限制性酶进行同样处理的扩增PDClD片段连接以制备pBPDClP-LDHII载体(图4，上面部分)。
随后，将用EcoRV和T4 DNA聚合酶处理的pBPDClP-LDHII载体和通过用AatII 和kpl以及T4 DNA聚合酶处理pRS404载体(ftOmega)获得的Trp标记片段连接以制备 pBTRP-PDCI-LDH载体(图4，下面部分)。
5. pBTRP-PDClPII 载体的构建
如图5所示，将现有的pBPDClP载体用限制性酶HincII和碱性磷酸酶去磷酸化酶处理。pBTrp-PDCl-LDH载体用限制性酶ApaI和AflII处理然后用末端修饰酶即T4 DNA 聚合酶处理以产生含有trp标记的片段。将该片段连接到处理后的pBPDClP载体中以构建 pBTRP-PDClPII 载体。
6. pBTRP-PDCI-DLDHME 载体的构建
如图6所示，pBTRP-PDClPII载体用限制性酶EcoRV处理后再用末端修饰酶即T4 DNA聚合酶处理，并与在实施例1中分离的D-LDHME基因片段连接以构建最终载体，即染色体整合的pBTRP-PDCI-DLDHME载体。
至于其它的D-LDH基因，根据来自乳酸细菌肠膜明串珠菌的D-LDH基因数据库中 GenBank登录号为L29327的基因序列(SEQ ID NO 幻进行了寡核苷酸合成。将这些寡核苷酸相继连接以完全合成目的D-LDH基因。对所得的基因片段进行与本实施例中的那些同样的处理以构建染色体整合的载体。
实施例3 酵母的转化
将缺乏色氨酸合成能力的酵母宿主菌IF02^0株(注册于Institute forFermentation)在IOml YPD培养基中于30°C培养至对数生长期，收集细胞并用TE 缓冲液洗涤。随后，加入0.5ml TE缓冲液和0.5ml 0. 2M醋酸锂，将所得物于30°C振荡培养1小时，然后加入已经用限制性酶ApaI和SpeI (Takara Shuzo Co.，Ltd.)处理的 pBTRP-PDCl-DLDHME。
所得的悬液于30°C振荡培养30分钟，然后向其中加入150μ 1 70%的聚乙二醇 4000 (Wako Pure Chemical hdustries，Ltd.)，并彻底搅动混合物。再进一步于 30°C振荡培养1小时，培养产物于42°C热激处理5分钟，然后将细胞在Iml YPD培养基中于30°C培养12小时。将培养液洗涤后悬浮于200 μ 1无菌水中。然后将所得悬液涂布于色氨酸选择
培养基上。
将产生的菌落用新的色氨酸选择培养基再次分离，并且选择保持色氨酸合成能力的菌株作为候选转化体。将这些菌株在YPD培养液中培养并用基因组DNA制备试剂盒O^ast DNA Kit, Bio 101)制备其基因组DNA。对基因组DNA进行PCR以确定转基因的存在或不存在。结果，发现了具有导入至启动子下游的D-LDHME基因的菌株。
将获得的导入了转基因的菌株涂布于诱导孢子形成的培养基上，于30°C连续4 天诱导孢子形成。从培养基上收集细胞，并向其中加入5单位酶解酶(Zymolyase) (Zymo Research Corp.)，酶反应于37°C进行1小时，然后用显微镜(Olympus Corporation)和显微操作器(Narishige ScientificInstrument Laboratory)在 YPD 培养基上分离孢子。检查所获得孢子后代菌株的色氨酸标记选择能力，并且进行PCR以确定它们表现2 2分离。 因此，获得了目的二倍体菌株。二倍体菌株是TC14-6-1A、TC14-6-2A和TC14-6-3A株。获得的二倍体菌株在酵母染色体上具有图7所示的结构。
关于在实施例2中构建的其它D-LDH基因的染色体整合载体，以相似方法将基因导入缺乏色氨酸合成能力的IF02260株，并通过PCR发现了染色体上整合有D-LDH的 TC20-1-1A 株。
作为对照，将DLDHME导入酵母自主复制2 μ质粒载体pYPDl质粒，以构建自主复制载体。所得的载体以相似的方法导入IF02260株，并通过PCR发现了含有包含D-LDH基因的质粒的TC21-1株。
实施例4 转化体中D-乳酸生产的确认
对在实施例3中制备的5种类型的转化体和亲本菌IF02260株进行发酵试验。将这些菌株接种于5ml YPD液体培养基中，于30°C，130转/分振荡培养过夜，并制备发酵生产必需的细胞。
收集接种的细胞，将收集的细胞以0.5%的细胞浓度接种于含10%葡萄糖的YPD 液体培养基中，于30°C静止发酵4天。在该发酵试验中，测试2种类型的生产形式。即测试通过向发酵醪中添加2. 5%碳酸钙(NacalaiTesque Inc.)而制备D-乳酸盐的生产和使用不添加碳酸钙的游离D-乳酸的生产。
于发酵开始4天后收集发酵醪，使用多功能生物传感器BF-4(0jikientific Instruments)检测醪液中包含的D-乳酸和乙醇的量。使用检测D-乳酸的试剂盒(Oji Scientific Instruments)根据试剂盒内的说明书检测D-乳酸。结果示于图8和图9。
如图8和图9所示，没有基因导入的亲本酵母菌株(IF02^0)产生乙醇但不产生 D-乳酸。相反，实施例3中制备的具有染色体整合转基因的4种类型转化酵母菌株较亲本菌株表现为更低的乙醇产量但是产生D-乳酸。
具体而言，4种类型的菌株(即D-LDHME基因导入酵母染色体PDCl启动子下游的转化体TC14-6-lA、TC14-6-2A和TC14-6-3A，以及导入D-LDH基因的TC20-1-1A)产生浓度在4% -6%的D-乳酸和浓度在2% -3%的乙醇。这些染色体上整合了转基因的转化体不产生L-乳酸。
相反，借助于自主复制质粒导入D-LDHME基因的菌株(TC21-1)产生非常少量的 D-乳酸。产生的乙醇的量与菌株IF02260相同。
因此，染色体上整合了转基因的转化体能够有效表达D-LDH并有效产生D-乳酸。 具体而言，导入处于PDCl启动子控制下的D-LDH基因(包括D-LDHME基因)有效增强D-乳
酸生产。
在上述4种类型的染色体上整合有转基因的转化体中，D-LDHME基因整合于PDCl 启动子下游的3个菌株表现为5 %或6 %的高D-乳酸生产量但表现为2 %的低乙醇生产量， 即D-乳酸的生产量是乙醇的2或3倍。对于D-LDH基因(GenBank登录号L29327)整合于PDCl启动子下游的转化体，D-乳酸的生产量低至约4%，这与乙醇的产量基本上相同或约是乙醇产量的1.3倍。因此，D-LDHME基因有效增强了染色体上整合有转基因的转化体中D-乳酸的生产。
在D-乳酸盐(钙)和游离L-乳酸的情况下增强D-乳酸生产的水平大约相同。
实施例5 具有增加的D-LDHME拷贝数的基因重组体酵母菌株
在实施例4中制备的生产D-乳酸的酵母菌株中，TC14-6-3A株用于制备具有所导入D-LDHME基因拷贝数增加的基因重组体酵母菌株。根据实施例3中描述的方法将D-LDHME 基因导入TC14-6-3A株。具体而言，除了使用TC14-6-3A株代替宿主酵母菌IF02260株以外，以与实施例3中同样的方法将D-LDHME基因导入TC14-6-3A株。
所获得的导入基因的菌株称作TD1-10-1B、TD1-10-3B、TD1-10-6A 和 TD1-10-7D 株。以与实施例3中相同的方法对这4种菌株中导入的D-LDHME基因的拷贝数进行检查。 结果发现导入了 4个拷贝的D-LDHME基因。
随后，根据实施例4中描述的方法对这4种类型菌株进行发酵试验以检查产生 D-乳酸的量。结果示于图10。如图10所示，由本实施例中获得的TD1-10-1B、TD1-10-3B、 TD1-10-6A和TD1-10-7D株产生的D-乳酸的量在亲本TC14-6-3A株产生的量(4.65%)的基础上得到增加。与亲本菌株相比，本实施例中获得的所有4种菌株表现出降低的乙醇生产量。
这表明转化的酵母菌株的D-乳酸生产能力可以通过增加导入的D-LDHME基因的拷贝数得到提高。在本实施例中，检查了导入4个拷贝D-LDHME基因的转化酵母菌株。应当指出导入更多拷贝数的D-LDHME基因能导致增强的D-乳酸产生。更具体地说，本实施例揭示可以通过增加所导入D-LDHME基因的拷贝数制备具有较高D-乳酸生产能力的转化酵母菌株。
文中引用的所有公开、专利及专利申请在文中全文整合作为参考。
工业适用性
本发明提供了有效生产D-乳酸的技术。
序列表独立文本
SEQ ID NO :6_11 人工 DNA(引物)
权利要求
1.下列(a)-(d)中任意一项所述的多核苷酸(a)包含SEQID NO :1所示核苷酸序列并且编码具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸；(b)多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格条件下与SEQID N0:1所示核苷酸序列或其互补链杂交并且编码具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质，其中所述严格条件为在42°C及 50%甲酰胺存在下进行杂交；(c)编码由SEQID NO 2所示氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(d)编码蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质由通过替代、缺失、插入或添加1-4个氨基酸残基而自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列组成并且具有D-乳酸脱氢酶活性。
2.根据权利要求
1的多核苷酸，其中所述严格条件为在65°C及甲酰胺存在下杂交。
3.下面(h)-(j)中任意一项所述的蛋白质(h)由序列表中SEQID NO 2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(i)蛋白质，其中所述蛋白质由通过1-4个氨基酸残基替代、缺失、插入或添加而自序列表中SEQ ID NO :2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列组成并且具有D-乳酸脱氢酶活性； 或(j)由权利要求
1之(b)项所述的多核苷酸编码的具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质。
4.DNA构建体，其中所述DNA构建体包含由权利要求
1至2中任意一项的多核苷酸组成的DNA片段和由启动子组成的DNA片段。
5.根据权利要求
4的DNA构建体，其中启动子是丙酮酸脱羧酶基因启动子。
6.根据权利要求
4或5的DNA构建体，其中启动子是酵母属(Saccharomyces)丙酮酸脱羧酶1基因启动子。
7.根据权利要求
6的DNA构建体，其中启动子是酿酒酵母(Saccharomycescerevisae) 丙酮酸脱羧酶1基因启动子。
8.转化体，其中转化体以在宿主微生物中可表达的方式携带权利要求
1至2中任意一项的多核苷酸。
9.根据权利要求
8的转化体，其中宿主是选自真核微生物和原核微生物的微生物。
10.根据权利要求
9的转化体，其中宿主是选自真菌的微生物。
11.根据权利要求
9的转化体，其中宿主是选自酵母、乳酸菌、埃希氏菌Escherichia) 和芽孢杆菌(Bacillus)的微生物。
12.根据权利要求
8至11中任一项所述的转化体，其中DNA是置于启动子控制之下以可表达方式携带的。
13.根据权利要求
12的转化体，其中启动子是丙酮酸脱羧酶基因启动子。
14.根据权利要求
12的转化体，其中启动子是酵母属丙酮酸脱羧酶1基因启动子。
15.根据权利要求
12的转化体，其中DNA是置于宿主丙酮酸脱羧酶1基因启动子控制之下以可表达方式携带的。
16.根据权利要求
11的转化体，其中宿主微生物为酿酒酵母。
17.根据权利要求
12的转化体，其中宿主微生物为酿酒酵母。
18.根据权利要求
13的转化体，其中宿主微生物为酿酒酵母。
19.根据权利要求
14的转化体，其中宿主微生物为酿酒酵母。
20.根据权利要求
15的转化体，其中宿主微生物为酿酒酵母。
21.生产D-乳酸的方法，其中所述方法包括培养根据权利要求
8-20中任意一项所述的转化体和从培养产物中回收选自D-乳酸、其盐和其衍生物中的至少一种的步骤。
22.生产乳酸聚合物的方法，其中所述方法包括培养根据权利要求
8-20中任意一项所述的转化体；从培养产物中回收选自D-乳酸、其盐和其衍生物中的至少一种和使用回收的 D-乳酸或其衍生物作为至少一种聚合材料生产乳酸聚合物的步骤。
专利摘要
本发明提供了编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸以及可用于生产D-乳酸的此种蛋白质。该多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(a)，并且能够在严格条件下与包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列全部或部分或其互补链的探针杂交并编码具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质(b)。
文档编号C12P7/62GKCN1795270 B发布类型授权 专利申请号CN 200480014169
公开日2011年9月21日 申请日期2004年5月21日
发明者大西彻, 平井正名, 德弘健郎, 斋藤聪志, 石田亘广, 长森英二, 高桥治雄 申请人:丰田自动车株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),