专利名称：特异性识别人脑乙酰胆碱酯酶的核酸适配体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及特异结合人脑乙酰胆碱酯酶的寡核苷酸适配体、含有它的组合物、检测或鉴别人脑乙酰胆碱酯酶的方法、诊断或治疗与人脑乙酰胆碱酯酶相关的疾病(特别是神经管缺陷和神经功能紊乱)的方法和诊断试剂和药物等。
背景技术：
SELEX技术是近年来发展起来的研究核酸结构、功能及进化等的一种新的组合化学技术，它不仅在基础研究、生物筛选等方面有很好的应用，而且在临床诊断方面也显示广阔的前景(Brody EN &Gold L，J.Biotechnol.，2000，755-13)。筛选出的寡核苷酸适配子(aptamer)可高亲和力和高特异性地识别不同的分子。它的亲和力和特异性可与抗体相媲美，被认为是“挑战”抗体地位的一种新型试剂，在疾病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。SELEX技术一般需要数轮或数十轮才能得到其相应配基。最近，Santa-Coloma TA等报道了用靶标切换技术制备的高特异性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸适配体)”、“monoclonal oligobody(单克隆寡核苷酸适配体)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸适配体)”(Bianchini M et al，J.Immunol.methods，2001，252191-197)可特异性地识别相应的蛋白质，应用于蛋白质印迹、免疫组化、免疫共沉淀等分析实验中。
蛋白类抗体的产生与应用存在以下限制(1)用毒性抗原时，免疫动物承受不了，免疫原性弱的难以产生抗体；(2)杂交瘤产生于鼠，在人体应用受限；异源抗体在诊断中还产生非特异性反应(假阳性)；(3)成本高、费时费力，稀有抗体需大量筛选才能得到；(4)克隆细胞株的有效保存不易，有些杂交瘤难以在体内生长；(5)批间质量不一，诊断时要重新优化；(6)体内与体外的识别特异性有差别；(7)抗体-靶分子相互作用的动力学参数无法依要求改变；(8)寿命有限，对温度敏感，发生不可逆变性。而核酸(适配子或适配体)有以下的优越性(1)在体外而非体内(动物、细胞)条件下筛选，特性可依要求改变；(2)动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变；(3)无毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；(4)在体外化学合成，可以保证时间、质量和数量；(5)特异性和亲和性不受组织或样品中非靶蛋白的干扰；(6)可以在合成时精确、定点、随意连接其它功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等；(7)比抗体分子小，更适用于体内影像诊断和治疗。如接上硫代磷酸，可用于细胞内诊断和治疗；(8)变性和复性可逆，而且速度快，可反复使用、长期保存和在室温下运输(Jayasena SD，Clin.Chem.，1999，451628-1650)。
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC 3.1.1.7)是神经系统的重要水解酶类，它的主要功能是水解突触后膜的ACh，从而维持神经冲动的正常传递。AChE具有分子多样性(Grisaru D，et al.Eur.J.Biochem.，1999；264672-686)。分子克隆揭示，由AChE的mRNA前体的可变剪接导致三种不同AChE亚型。突触型AChE(AChE-S)主要分布于神经系统和肌肉，它有一个含40个氨基酸残基的亲水性C端。红细胞型AChE(AChE-E)分布于成熟红细胞表面，可能与假性胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BChE)一起参与清除血液中的一些酯类化合物。近来稀有的通读型AChE(AChE-R)被发现，它以可溶性单体形式存在于胚胎及肿瘤细胞中，在急性生理应激、封闭性颅脑损伤或接触AChE抑制剂时脑中AChE-R含量显著上升。突触型和红细胞型AchE的序列大部分相同，仅其C-末端氨基酸残基不同。由于mRNA前体不同的剪接及翻译后修饰，红细胞型AChE(557aa)比脑型AChE(583aa)少26个残基。
神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是我国最常见的先天畸形，平均发病率为千分之七。NTD是胚胎期神经管未闭所致的畸形，主要包括无脑儿、脊柱裂和脑膨出。NTD婴儿的出生带来终身灾难，给家庭和社会带来沉重负担。NTD是多基因遗传病，妊娠期缺乏叶酸及环境因素影响至关密切。NTD的产前诊断主要有以下几种方法(1)母血及羊水甲胎蛋白(AFP)检查；(2)羊水AChE测定人脑AChE由神经组织分泌，当脊髓和脑组织暴露在羊水中时，羊水中能测出AChE，正常羊水中测不到AChE。羊膜穿刺时可能由于血样污染而导致假阳性，所以能区分人脑AChE和人红细胞AChE的试剂在NTD产前诊断中十分有用；(3)B超检查等方法在妊娠早期不适用。(董学君，中国优生与遗传杂志，1996，4114-115)。
本发明的目的主要是产生能区分突触型和红细胞型AChE的寡核苷酸适配体。它们可应用于神经管缺损和神经功能紊乱(e.g.早老性痴呆)的诊断和治疗。
发明内容
人脑AChE和人红细胞AChE的区别在于C-末端的不同。我们利用“靶标切换”(target switching)法从二者的差异肽段入手，得到特异的针对人脑AChE的多克隆及单克隆寡核苷酸适配体。筛选出的寡核苷酸适配体特异性高，可明确鉴别人红细胞AChE及人脑AChE。此外与人BChE也无交叉反应。由此完成本发明。
因此，一方面，本发明提供特异结合人脑乙酰胆碱酯酶的寡核苷酸适配体。
具体地，本发明的寡核苷酸适配体包含如下的核苷酸序列a)包含序列AAACAXnGYCCC的长15-50nt(包括15-50之间的任何整数，优选15-40nt，更优选20-30，最优选23-28nt，特别是25nt)或更多的核苷酸序列，其中，每个X分别独立地是A、T、C或G，n为0-20(包括0-20之间的任何整数，例如0、1、2、3、4…、10、11、12、18、19、20，优选0-15，更优选1-10，最优选2-4，特别是2和4)的整数或更多，Y为G或C；
b)SEQ ID NO3的序列；c)在严紧条件下与a)或b)的序列杂交的序列；或d)a)或b)或c)的互补序列。
寡核苷酸杂交的严紧条件是本领域公知的，可参见例如J.Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》第二版或Frederick M.Ausubel等编著的《精编分子生物学实验指南》。例如，在低于Tm值15-25℃的温度下杂交，甚至在低于Tm值5-10℃的温度下杂交。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸适配体是DNA。本发明的寡核苷酸适配体也可以是RNA，还可以是核酸类似物，例如肽核酸(PNA)。
在一个具体实施方案中，所述寡核苷酸适配体具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列。
在另一个具体实施方案中，本发明的寡核苷酸适配体连接或标记了其它功能基团或分子，例如巯基、氨基、放射性同位素、荧光素、生物素、毒素、或酶等。这些功能基团或分子可以用于标记目的以便于检测或诊断，也可以用于治疗目的或其它目的。
本发明还提供包含所述寡核苷酸适配体的载体和包含本发明载体的细胞。载体可以是用于克隆或表达或其它目的的任何载体，包括但不限于质粒、病毒载体。寡核苷酸适配体可以采用适当的常规方法克隆到载体中。包含本发明载体的细胞不受限制，可以是真核细胞或原核细胞，例如大肠杆菌细胞、真菌细胞如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞或细胞系。转化或转染细胞的方法取决于载体和细胞的种类等本领域技术人员熟知的因素，可以采用任何适当的方法转化或转染细胞。
另一方面，还提供检测或鉴别人脑乙酰胆碱酯酶的方法，包括使可能含有人脑乙酰胆碱酯酶的样品与本发明的寡核苷酸适配体接触，并检测人脑乙酰胆碱酯酶与所述寡核苷酸适配体的结合。
另一方面，还提供抑制人脑乙酰胆碱酯酶活性或减少人脑乙酰胆碱酯酶的方法，包括给予有效量的本发明寡核苷酸适配体。该方法可以在体内或体外使用。体内使用时，使用对象可以是有此需要的任何动物，优选哺乳动物，例如人。
本发明还提供包含本发明寡核苷酸适配体的诊断试剂或药物。所述诊断试剂或药物优选用于诊断或治疗与人脑乙酰胆碱酯酶相关的疾病，特别是神经管缺陷和神经功能紊乱。所述诊断试剂或药物还可以包含其他适当辅助试剂，例如适当溶剂、赋形剂。所述药物也可以联合其他活性成分一起使用。药物的剂型、剂量、给药方式、频率可以结合本发明的实施例由本领域技术人员通过常规方法确定。
再一方面，还提供所述寡核苷酸适配体在制备本发明诊断试剂或药物中的用途。
以下通过实施例结合附图对本发明进行更详细的说明。所述实施例仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。
图1是放射标记的次级文库与人脑十肽点杂交的结果。
图2显示本发明得到的多克隆寡核苷酸适配体和人脑匀浆免疫共沉淀的结果。A)人脑匀浆与生物素化多克隆适配体作用；B)阳性对照人脑匀浆与抗人脑AChE抗体作用。
图3显示本发明得到的单克隆寡核苷酸适配体和以下成分蛋白质印迹的结果A)纯化人红细胞AChE；B)人脑匀浆；C)人全血；D)阳性对照(人脑匀浆与抗人脑AChE抗体作用)。
图4显示本发明得到的单克隆寡核苷酸适配体和不同胆碱酯酶的酶蛋白结合测定。(■)，人脑AChE；(▲)，电鳐AChE；(●)，人红细胞AChE；()，人BChE.n＝3，Mean±SD。
图5显示本发明得到的单克隆寡核苷酸适配体的可能二级结构。
实施例实施例1 ssDNA扩增文库的构建在PCR体系(10XPCR反应缓冲液10ul，dNTPs(25mM)8ul，5’引物(25pmol/ul)2ul，3’引物(25pmol/ul)2ul，模板0.25ug，Pfu DNA聚合酶1ul)中，下游引物的5’端标记有生物素。以原始ssDNA库(由上海博亚公司合成并纯化)为模板进行PCR扩增，可得到3’端带有生物素的dsDNA库。
所述原始ssDNA库(单链DNA文库)是一个具有25个随机序列，全长85个碱基的随机DNA文库。此文库两端为固定序列，可设计引物对文库进行PCR扩增。ssDNA的序列为5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(25个随机核苷酸)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’dsDNA产物经分离纯化后，加入链亲和素磁珠结合，此时dsDNA通过生物素与磁珠上的链亲和素结合，然后用0.15N的NaOH使dsDNA变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，而不带生物素的一条链解离出来，经乙醇沉淀，溶于TE缓冲液中，测定OD值，作为第一次筛选的随机ssDNA库。
实施例2 ssDNA次级文库的构建选用人脑AChE的560-569位氨基酸残基(NH2-WSSYMVHWKN-COOH)作为第一个靶分子。它位于人AChE的C末端的第11个抗原表位中，此十肽具有抗原性。首先将DC膜(0.45μm，0.15cm2)与10mg/ml的靶蛋白4℃孵育过夜，然后把约0.5nmol上述生物素标记的随机ssDNA和NC膜在400μl含1％BSA的结合TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM CaCl2，1mM MgCl2)中孵育，轻轻振摇，4℃过夜。然后NC膜用1ml TE洗涤15min×3次(室温)。最后NC膜浸于7M尿素中洗脱结合的寡核苷酸，94℃，10min。然后再用酚/氯仿/异丙醇(25∶24∶1，pH8)抽提。洗脱液加入10％糖原后用乙醇沉淀，再进行PCR(95℃预变性5min后，扩增5个循环94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸1min，最后72℃终延伸5min。取10ul上述PCR产物为模板，再次PCR扩增，每3个循环取样，选择PCR产量大，无杂带的循环数为最佳循环数，将剩余90ul产物全部扩增。)。其中一部分以[α-32P]CTP为底物进行PCR，得到的产物与不同浓度十肽(1μg/5μg/8μg)的结合通过在NC膜上进行的点杂交(Sorensen K，et al.Biochim Biophys Acta，1987，91256-62.)进行验证。其余部分通过PCR生成生物素化dsDNA，再拆分为生物素化ssDNA。
不同浓度的十肽和放射性标记的第一轮筛选后的扩增文库进行点杂交，结果显示随着加入多肽的量的增加，X光片上的斑点也随着加入肽量的增加而逐渐加深。此结果表明放射性标记文库和多肽有结合作用(图1)。
实施例3 多克隆寡核苷酸适配体采用“靶标切换”的方法获得特异性多克隆寡核苷酸适配体。即将起始靶分子十肽“切换”为人脑匀浆中的人脑AChE。人脑匀浆(80μg)(制备方法取人脑尾状核和小脑，在高速组织捣碎机中慢速破碎，制成匀浆。加辛酸数滴去除泡沫后，再加10％Triton X-100至终浓度为1％，4℃搅拌4h，100,000g离心60min，上清即为人脑匀浆)进行12％的SDS-PAGE，转膜后用含5％脱脂奶粉的PBS封闭。NC膜与生物素化的ssDNA次级文库在含1％BSA的3ml TE结合缓冲液中室温孵育2h，然后用链亲和素标记的HRP进行显色。切下相对应于人脑AChE的66kD条带(同样也被抗人脑AChE抗体所验证)。结合的寡核苷酸用尿素-酚法洗脱，并进行PCR。最后得到的产物即为多克隆寡核苷酸适配体。
免疫共沉淀首先将人脑匀浆(200μg)和上述的生物素化的多克隆寡核苷酸适配体在TE结合缓冲液中室温孵育1h。加入25μl链亲和素磁珠来分离寡核苷酸适配体和人脑AChE的复合物。用1ml TE缓冲液洗涤4次。将磁珠-寡核苷酸适配体-人脑AChE复合物进行12％SDS-PAGE，转印到NC膜上。然后依次用抗人脑AChE抗体和HRP-IgG二抗显色。阳性对照用抗人脑AChE抗体对人脑匀浆中的AChE进行检测。
免疫共沉淀在66kD处呈现一条主带(图2A)，与抗人脑AChE抗体(阳性对照)的单一条带相当(图2B)。此结果说明多克隆寡核苷酸适配体与人脑AChE产生特异性结合(图2)。
实施例4 单克隆寡核苷酸适配体多克隆寡核苷酸适配体经过PCR扩增后，连接于pGEM-T easyvector，然后转染感受态细胞，挑取3个克隆进行测序。每一个阳性克隆即为一个单克隆寡核苷酸适配体。3个单克隆寡核苷酸适配体的免疫共沉淀、蛋白质印迹、点杂交及酶抗原免疫测定结果相似，下面是1号单克隆寡核苷酸适配体(Ob1)的实验结果。
1.蛋白质印迹(western blotting)将人脑匀浆、纯化的人红细胞AChE及人全血样品进行SDS-PAGE，转膜后与1号生物素化单克隆寡核苷酸适配体孵育，然后用链亲和素标记的HRP进行显色。
1号单克隆寡核苷酸适配体可与人脑AChE产生特异性结合，在66kD处呈现一条主带(图3B)，而与纯化人红细胞AChE及人全血无结合(图3A、C)说明1号单克隆寡核苷酸适配体可区分变性的人脑AChE和人红细胞AChE。
2.点杂交将0.5U的胆碱酯酶溶于5μl的0.01M PBS(pH7.4)-144mMNaCl-1ml/L Triton X-100中(变性样品加SDS至1g/L浓度，煮沸5min)，然后点样于NC膜上。用3％BSA的buffer A(0.05M Tris-HCl，pH7.4，0.14M NaCl)对NC膜封闭2h，然后用不含BSA的buffer A漂洗一次。然后加入生物素化单克隆适配体，再用链亲和素连接的HRP显色。
结果表明1号寡核苷酸适配体和天然及变性的人脑AChE和电鳐AChE显示特异性结合，而与人及牛红细胞AChE及人BChE无结合能力(表1)。
表1.单克隆寡核苷酸适配体和不同来源的纯化胆碱酯酶的点杂交Source Native enzyme Denatured enzyme人脑AChE + +人红细胞AChE - -牛红细胞AChE - -人BChE - -电鳐AChE + +3.酶蛋白结合测定(ECA)酶蛋白结合测定法仿效酶抗原免疫测定进行。将链亲和素(5g/L，用PBS稀释)加入微孔板中，100μl/孔，4℃过夜。用PBS洗涤后，用1％BSA封闭，室温1h。生物素化1号单克隆寡核苷酸适配体用包被缓冲液(0.01M PBS，pH8.0，144mM NaCl)稀释后加入每孔(0.3μg/孔)，37℃孵育2h。经洗涤缓冲液(0.01M PBS，pH7.2，0.05％Tween-20)洗涤2次后，用含1％BSA的包被缓冲液，每孔200μl，37℃封闭1h。洗涤2次后，每孔加酶反应缓冲液(0.01 PBS，pH7.4，144mM NaCl，0.01％Triton X-100)稀释的不同种属的AChE 100μl，在室温中缓慢摇动2h，洗涤5次后，加底物反应液(1mM ATCh·I，0.025mM DTNB，0.1M PBS，pH7.4，0.1％ Triton X-100)，每孔100μl，在414nm波长处测定消光值。
ECA显示人脑AChE的1号单克隆寡核苷酸适配体与人脑及电鳐AChE均显示明显的特异结合反应性，而与人红细胞AChE及人假性胆碱酯酶(BChE)无结合现象(图4)。从另一个侧面说明1号单克隆寡核苷酸适配体对人脑AChE有特异性。
实施例5 寡核苷酸适配体的一级结构和二级结构分析对所获的阳性孔中3个克隆进行测序，分别命名为Ob1，Ob2，Ob3。使用Clustal W和DNA folding server软件分别对这3个适配体进行一级结构和二级结构分析。一级结构如下。其中Ob1和Ob2有一定的同源性，含保守序列，而Ob3无同源发现。
Ob1CTCTCGTGCTAAACATAGGCCCGTA(SEQ ID NO1)Ob2CTTCGAAAACACCCTGCCCCTCACA(SEQ ID NO2)保守序列AAACA G(G/C)CCCOb3CATTAGAATCTGTGACAATAACGTT(SEQ ID NO3)二级结构分析3个寡核苷酸适配体分子的二级结构均用DNA Folding Server进行最低能量二级结构分析。结果显示Ob1-3的二级结构有相似框架，近5’端固定序列形成一个相同的茎环，随机序列中部有一个小的茎环(图5)。
权利要求
1.特异结合人脑乙酰胆碱酯酶的寡核苷酸适配体。
2.权利要求1的寡核苷酸适配体，包含如下的核苷酸序列a)包含序列AAACAXnGYCCC的长15-50nt(优选15-40nt，更优选20-30，最优选23-28nt，特别是25nt)的核苷酸序列，其中，每个X分别独立地是A、T、C或G，n为0-20(优选0-15，更优选1-10，最优选2-4，特别是2和4)的整数，Y为G或C；b)SEQ ID NO3的序列；c)在严紧条件下与a)或b)的序列杂交的序列；或d)a)或b)或c)的互补序列。
3.权利要求1或2的寡核苷酸适配体，其是DNA。
4.权利要求3的寡核苷酸适配体，具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列。
5.权利要求1-4任意一项的寡核苷酸适配体，其连接或标记了其它功能基团或分子，例如巯基、氨基、放射性同位素、荧光素、生物素、或酶等。
6.包含权利要求1-5任意一项的寡核苷酸适配体的载体。
7.包含权利要求6的载体的细胞。
8.检测或鉴别人脑乙酰胆碱酯酶的方法，包括使可能含有人脑乙酰胆碱酯酶的样品与权利要求1-5任意一项的寡核苷酸适配体接触，并检测人脑乙酰胆碱酯酶与所述寡核苷酸适配体的结合。
9.抑制人脑乙酰胆碱酯酶活性或减少人脑乙酰胆碱酯酶的方法，包括给予有效量的权利要求1-5任意一项的寡核苷酸适配体。
10.包含权利要求1-5任意一项的寡核苷酸适配体的诊断试剂或药物。
11.权利要求10的诊断试剂或药物，其用于诊断或治疗与人脑乙酰胆碱酯酶相关的疾病，特别是神经管缺陷和神经功能紊乱。
12.权利要求1-5任意一项的寡核苷酸适配体在制备权利要求10或11的诊断试剂或药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了优选具有SEQ ID NO1.SEQ IDNO2或SEQ ID NO3之序列的特异结合人脑乙酰胆碱酯酶的寡核苷酸适配体、检测或鉴别人脑乙酰胆碱酯酶的方法、诊断或治疗与人脑乙酰胆碱酯酶相关的疾病(特别是神经管缺陷和神经功能紊乱)的方法和诊断试剂和药物等。
文档编号C12Q1/68GK1611509SQ200310103048
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者张兴梅, 李前, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所