专利名称：编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物基因技术领域的基因序列，具体涉及一种编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列。
背景技术：
在多细胞动物中，乙酰胆碱酯酶(简称AChE)位于神经元间、神经元与肌肉细胞间的化学突触上，是主要的信号传递分子，行使水解胆碱酯的功能。研究表明，多种化合物可抑制AChE活性，导致有机体类胆碱代谢途径过度，胆碱酯不能被有效水解，大量积累于神经末梢，有机体表现出肌肉抽搐，中枢神经系统功能紊乱等症状，严重者甚至死亡。在众多抑制剂中，有机磷和氨基甲酸酯类被认为是AChE的专性抑制剂，它们可使昆虫神经系统中的AChE的丝氨酸羟基基团发生磷酸化或甲氨酰化，从而AChE失去活性，不能迅速水解乙酰胆碱，致使昆虫死亡，因而被大量用作农业杀虫剂。农产品表面残留的有机磷或氨基甲酸酯类是否抑制人体神经系统的AChE，对人体产生危害？这一问题随着人民食品安全意识的普遍提高正受到研究人员的关注。人体主要存在两种胆碱酯酶，AChE和丁酰胆碱酯酶(简称BuChE)。AChE除主要分布于神经系统，还结合于红血细胞表面，BuChE主要分布在血清中。当有机磷或氨基甲酸酯类侵入机体时，这些分散在循环系统中的胆碱酯酶优先结合它们，从而使神经系统中的AChE免受磷酸化的威胁。然而，若抑制剂含量超出机体可耐受范围，充当信号传递分子的AChE将被破坏。
农药残留检测方法主要有两大类-色谱检测法和快速检测法。色谱检测法因为其监测数据的精确性和准确性可为农药残留执法提供有力的参考依据。但其操作程序复杂、需要高技术专业检测人员，检测仪器和费用都相当昂贵。快速检测法操作简便、不需昂贵仪器，适合于现场检测及大批样品的筛选检测，主要用来防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超标的蔬菜和水果流入市场。其中应用最为广泛的是酶抑制法，原理即是乙酰胆碱酯酶的活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制。近几年来，国内一些公司已研制出酶抑制法检测仪器和试纸，并在一些城市的市场中推广应用。这表明，我国的农药生物学检测手段已不再依赖于国外进口的试剂盒。不足的是，这些产品使用的酶原料主要是生物体的蛋白提取液，除AChE外，其它蛋白也存在其中，这在很大程度上影响了检测结果的重复性；同时，酶原料的多少受限于供体生物的数量，这极大地限制了这些产品的大量生产应用。
经对现有技术文献的检索发现，美国专利相关报道US Patent No.6770799，Expression of recombinant human Acetylcholinesterase in transgenic plants(美国专利号6770799，人源性乙酰胆碱脂酶在转基因植物中的重组表达)；USPatent No.5595903，Genetically engineered human Acetylcholinesterase(美国专利号5595903，基因工程人源性乙酰胆碱脂酶)。研究者利用这些重组蛋白注射老鼠、豚鼠和灵长类，证明其在有机磷中毒事件中取得了良好的预防与治疗效果。关于果蝇AChE基因的重组表达、以及在农药残留检测方面的应用，国外自90年代起已开展了大量研究工作，但至今未发现与本发明主题密切联系的文献与专利的报道。不同生物来源的AChE对抑制剂的敏感程度不同。果蝇的AChE发生磷酸化与甲氨酰化的速度高于其它生物的酶，也就是说，它对有机磷和氨基甲酸酯类农药是最为敏感的。因此，它是农药残留检测的理想生物学材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种编码果蝇AChE蛋白的核苷酸基因序列。使其在酵母细胞中得到高效表达，蛋白分泌至培养液中，易于分离纯化，为检测农药残留提供了优良的基因工程酶；进一步在甲醇酵母中表达对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的AChE蛋白，为开发农药生物学检测产品提供丰富的蛋白原料。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明编码具有AChE活性的蛋白质，且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5相同。所述的编码，果蝇AChE蛋白的信号肽与糖磷脂锚定信号的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列与SEQ ID NO.6相同。
所述的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7相同。
米氏常数Km＝12.3±3.7μM，近似于从果蝇提取的AChE的Km值(17.0±3μM)。
提取果蝇总RNA，以oligo dT为引物，反转录获得果蝇总cDNA。以果蝇总cDNA为模板，用引物1(核苷酸序列与SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列与SEQ ID NO2相同)进行PCR扩增，获得AChE的cDNA扩增产物，为1950bp。将果蝇AChE cDNA与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含AChE cDNA的大肠杆菌克隆。以抽提大肠杆菌的质粒pT-AChE为模板，用引物3(核苷酸序列与SEQ ID NO3相同)和引物4(核苷酸序列与SEQ ID NO4相同)进行PCR扩增，获得切除信号肽序列及糖磷脂锚定序列后的AChE cDNA扩增产物，为1749bp。用限制性内切酶ECoR1与Not1酶切改造后的AChE cDNA和酵母表达载体pPIC9K，连接两者酶切后的片段，转化大肠杆菌DH5α，获得含改造后的AChE cDNA的大肠杆菌克隆。
甲醇酵母表达载体pPIC9K-AChE，含有与SEQ ID NO6相同的核苷酸序列，且含有该表达载体的甲醇酵母可表达果蝇乙酰胆碱酯酶，并将乙酰胆碱酯酶分泌至酵母培养液中。抽提大肠杆菌的重组质粒pPIC9K-AChE，用限制性内切酶Sal1酶切，使其线性化。线性化质粒pPIC9K-AChE-L电转化甲醇酵母GS115，获得重组菌株。以甲醇诱导甲醇酵母重组菌株表达乙酰胆碱酯酶，收集培养液，通过测定乙酰胆碱酯酶活性，在1000个重组子中筛选出表达0.307U/mg乙酰胆碱酯酶的菌株AChE*-GS115。以甲醇诱导甲醇酵母菌株ACHE*-GS115表达乙酰胆碱酯酶，离心收集培养液，浓缩脱盐，得到乙酰胆碱酯酶粗酶液。
通过测定粗酶液活性，计算重组蛋白的Km值；计算敌敌畏，乐果，毒死蜱，抗蚜威对乙酰胆碱酯酶的抑制常数Ki。
以下进一步对本发明中的技术术语作出说明1.外源基因插入酵母基因组外源DNA转化甲醇酵母时，经线性化处理的该DNA片段将在酵母基因组的同源区域重组，使酵母的某一营养表型恢复，产生重组菌株。与重组有关的酵母基因组区域有两个AOX1区和his4区。
(1)外源基因在his4基因区的单点插入，外源基因插入到his4基因座中，载体中HIS4表达框的一部分序列与基因组his4基因的一部分结合，组成可表达组氨醇脱氢酶的表达框。由于这种基因重组未涉及AOX1基因区，该重组子的表型是Mut+。
(2)外源基因在AOX1基因区的单点插入，外源基因插入到AOX1基因座的3’端，可产生Mut+表型的重组子。同时，外源片段也可插入到AOX1基因座的5’端，这取决于线性化DNA时所用的酶。环状DNA亦可插入酵母基因组中，但频率很低。
(3)外源基因在基因组中的多拷贝插入。多拷贝插入是自发产生的，在AOX1基因座或his4基因座上皆可发生，它的频率较低，一般占所获得重组子的1-10％。
(4)外源基因替换基因组中AOX1基因区插入或替换由线性化外源DNA所用的酶决定。对于pPIC9K，SacI酶切后的DNA将插入AOX1基因座，SalI酶切后的DNA将插入his4基因座，而DraI酶切后的DNA则会替换AOX1基因座。与插入不同，替换发生时整个AOX1基因座完全被外源基因替代，其表型是Muts。
2.甲醇酵母表达系统——诱导表达外源蛋白甲醇酵母体内，AOX1基因和AOX2基因皆编码产生醇氧化酶(简称AOX)，这是甲醇代谢途径的关键酶。其中，AOX1基因启动子专一性受甲醇诱导，产生的AOX可达细胞可溶性蛋白的30％，含量很高，这使得甲醇酵母能在以甲醇为碳源的培养基中快速生长。AOX1启动子后接外源基因时，外源基因在甲醇以外的碳源(如葡萄糖、甘油或乙醇)中处于非表达状态，当在培养液中加入甲醇后，即被诱导表达。AOX1与AOX2的同源性达97％，但后者产物代谢甲醇的活性很弱，这一特征被用于分离Muts表型的菌株。
3.Ellman方法测定AChE活性AChE可水解乙酰硫代胆碱，生成硫代胆碱和乙酸盐。硫代胆碱还原二硫二硝基苯甲酸形成硝基苯甲酸盐，这种黄色物质在405nm具吸收峰值。这是AChE活性测定的通用方法，有机磷或氨基甲酸酯抑制了AChE活性，其抑制程度也可根据该方法计算出。
4.酶反应动力学参数(1)米氏常数Km米氏常数即为反应速度达到最大反应速度一半时的作用物浓度。它是酶的特征性常数，表示酶与作用物的亲和力大小。Km越大，酶与作用物的亲和力越小。这个常数可以通过反应速度及作用物浓度的双倒数作图获得。
(2)抑制常数Ki酶抑制剂分为两类不可逆抑制剂与可逆性抑制剂。有机磷及氨基甲酸酯类农药被认为是AChE的不可逆抑制剂，它们使AChE活性中心的丝氨酸发生磷酸化或甲氨酰化，抑制机制可表示为
E酶，PX抑制剂，X抑制剂中除有机磷或氨基甲酸酯外的基团。Ki表示酶被抑制的程度。有机磷或氨基甲酸酯抑制AChE的模型公式如下[E][E0]=([PX0]-[E0])e-Kit([PX0]-[E0])[PX0]-[E0]e-Kit([PX0]-[E0])]]>t代表酶与抑制剂反应的时间；[PX0]和[E0]分别是抑制剂与酶的初始浓度；[E]代表酶在反应不同时间后的残余浓度。
本发明获得了含果蝇乙酰胆碱酯酶cDNA的大肠杆菌克隆，在此基础上，获得了含改造后的果蝇乙酰胆碱酯酶cDNA的大肠杆菌克隆，将乙酰胆碱酯酶基因插入甲醇酵母GS115基因组后，本发明在1000个重组子中筛选获得了可表达活性为0.307U/mg乙酰胆碱酯酶的酵母重组子AChE*-GS115。1个酶单位定义为在室温(25℃)，一分钟内水解1mM底物的酶量。1M发色团DTNB的消光系数＝13.6×104。经甲醇诱导后，AChE*-GS115表达的乙酰胆碱酯酶分泌在酵母培养液中。而不同抑制剂对乙酰胆碱酯酶的抑制常数不相同，说明抑制剂的抑制能力不同(表1)。这表明，甲醇酵母表达的乙酰胆碱酯酶可被用于有机磷与氨基甲酸酯类农药的检测。此外，重组乙酰胆碱酯酶还可为农药残留检测生物传感器、试纸条的研制等提供灵敏的生物学材料。
表1 甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受各种抑制剂抑制的抑制常数
图1本发明的技术流程图。
图2以引物1(核苷酸序列与SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列与SEQ ID NO2相同)扩增含果蝇AChE cDNA的大肠杆菌所产生的片段。泳道1DNA分子量标记；泳道2扩增阳性克隆产生的目的片段，1950bp。
图3用限制性内切酶ECoR 1和Sal 1酶切质粒pPIC9K-AChE，鉴定含改造后的果蝇AChE cDNA的大肠杆菌克隆。泳道1pPIC9K质粒，酶切后有2.0kb片段切出；泳道2pPIC9K-AChE质粒，酶切后有3.7kb片段切出；泳道3DNA分子量标记。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施方式作出详细具体的描述1.实验材料1.1黑腹果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)购自复旦大学遗传学实验室。
1.2菌株与质粒大肠杆菌和酵母菌株由上海农科院生物中心基因工程实验室提供。
甲醇酵母表达载体pPIC9K由上海农科院生物中心基因工程实验室提供，大肠杆菌载体pMD18-T购自日本TAKARA公司。
1.3引物、酶与试剂PCR引物由上海博亚生物公司合成，详细序列信息见SEQ ID NO1-4；限制性内切酶、PyrobestTM DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等购自日本TAKARA公司；Trizol试剂盒购自北京塞百盛基因技术有限公司；反转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州V-gene生物技术公司；
YNB购自上海普飞生物技术公司；Ellman试剂成分(Acetylthiocholine iodide，DTNB)购自美国Sigma公司；甲醇、山梨醇、甘油、各种氨基酸等生化试剂均为国产分析纯或进口分装。
2.操作过程2.1提取果蝇总RNA，并用Oligo-dT引物进行反转录按TRIZOL方法(Molecular Research Center，Inc.，USA)提取总RNA。反转录操作参照试剂盒说明书。取1-5μg果蝇总RNA，与1μl 10mM的oligodT引物混合，加Rnase free水至20μl总体积，80℃保温5min，然后置于冰上；加入4μl 5×Reaction Buffer，2μl 10mM dNTP，1μl RNase inhibitor，37℃温育5min，置于冰上；加入1μl Reverse Transcriptase，42℃温育30-60min；最后80℃保温10min，反转录产物为果蝇总cDNA的第一条链。
2.2PCR扩增在无菌PCR管中加入5μl 10×PyrobestTM PCR缓冲液，5μl 2mM 4dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，2U PyrobestTM DNA聚合酶，加水至50μl总体积，最后加适量矿物油以防止蒸发。反应条件如下94℃，3min；94℃30sec，56℃30Sec，72℃2min(退火温度及延伸时间根据引物及扩增产物长度不同作相应改变)，30个循环；终延伸72℃10min。
反应结束后，在PCR体系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃1h。
2.3TBE-琼脂糖凝胶电泳和回收PCR产物用1％琼脂糖凝胶(含10ng/ml EB)电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收，PCR产物最终溶于25-30μl的Eluent Buffer中。
2.4DNA连接反应在无菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR产物，0.25μl pMD18-T载体，1μl T4 DNA连接酶，总体积为10μl。将各组分混匀，4℃中连接16h。当PCR产物与载体DNA片段通过酶切形成的互补粘端相连时，两者之间的质量比为5∶1。
2.5制备大肠杆菌感受态细胞在LB平板上划线接种大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。用接种环挑取10-12个单菌落(2-3mm直径)，接种于250mL的SOB培养液中。振荡培养(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用80ml预冷的TB溶液重悬细胞，冰浴10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用20ml预冷的TB轻轻地重悬细胞，加入DMS0至终浓度7％，轻轻混匀，置于冰上。10min后，按每管500μl分装细胞悬液于无菌的eppendorf管中。用液氮快速冷冻，储存于-70℃。
2.6DNA连接产物转化大肠杆菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受态细胞与10μl的DNA连接产物，手指轻弹管壁，混匀混合物。冰浴30min。42℃，温育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培养液，37℃，剧烈振荡混合液1h。将混合液涂布在选择性培养基上，37℃培养过夜。
2.7DNA序列分析采用ABI377型测序仪(购自美国ABI公司)测定DNA序列，用PCGENE软件分析序列，由上海博亚生物公司完成。
2.8小量制备质粒DNA从培养基平板上挑取含目的质粒的单菌落，接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，振荡培养过夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml离心管中，倒入1.5ml菌液，离心(4℃，13000rpm，30sec)，倒去上清，收集菌体，将离心管倒扣在纸巾上，晾干管壁上的残余液滴。加入100μl预冷的溶液I，剧烈震荡，悬浮菌体；加入200μl新鲜的溶液II，将盖关闭，迅速颠倒5次，混匀混合物，注意不要旋转离心管；加入150μl溶液III，将盖关闭，颠倒数次，使溶液III均匀分散在粘稠的菌裂解液中，冰浴3-5min。离心(4℃，13000rpm，5min)，将上清转移到新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，常温放置10min，离心(4℃，13000rpm，5min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，将盖关闭，颠倒数次，离心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，将离心管倒扣在纸巾上，室温放置数分钟，待管壁上的残余乙醇液滴完全挥发，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保温30min，DNA保存于-20℃备用。
2.9限制性内切酶酶切DNA
酶切反应参照限制性内切酶试剂盒(购自TAKARA公司)说明书中的具体操作进行。反应结束，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收操作与PCR产物回收相同。
2.10线性化质粒电转化甲醇酵母在50ml三角瓶中加入5ml YPD，将GS115酵母单菌落接种其中，振荡培养过夜(30℃，200rpm)。取0.1-0.5ml菌液，接种在100ml新鲜培养液中，再次剧烈振荡培养过夜，至OD600＝1.3-1.5。离心(4℃，5000rpm，5min)，用100ml预冷的无菌水重悬细胞沉淀。离心(4℃，5000rpm，5min)，用50ml预冷的无菌水重悬细胞沉淀。离心(4℃，5000rpm，5min)，用4ml预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀。离心(4℃，5000rpm，5min)，用200μl预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀。
取80μl经上述处理的酵母细胞悬液，与线性化质粒(5-20μg)混合。将混合物转移至预冷的电转化杯中。冰上放置5min。用电转化仪(购自美国Bio-rad公司)进行电转化(参数2KV，200Ω，25μF)。在电转化杯中迅速加入1ml预冷的1M山梨醇，颠倒数次，以混匀细胞，冰浴数分钟，取250μl等份，涂布于MD平板，温育(30℃，3-4d)至菌落出现。
2.11诱导甲醇酵母细胞表达AChE蛋白即使在同一个转化事件中，外源基因也可能以多种形式发生重组，不同的重组子表达外源蛋白的效率不同。实验中，挑选1000个酵母重组子，诱导其表达AChE，筛选表达水平高的重组子。为保证表达活力，从平板上挑取新鲜的单菌落，或从-70℃冻存的菌种中挑取一部分培养。诱导外源蛋白表达过程如下从MD平板上挑取单菌落，接种于25ml的BMGY中，振荡培养(28℃，250rpm)，至OD600＝2(约18h)，细胞处于对数增长期。离心(室温，5000rpm，5min)，收集细胞。用50ml BMMY重悬细胞沉淀，至OD600＝1。将菌液转移至另一个三角瓶，用两层纱布盖住瓶口，继续振荡培养。为持续诱导表达，每24h补充甲醇，终浓度为0.5％。为确定最佳诱导时间，分别在诱导后第48、72、96、120、144小时，收集500μl培养物，转入1.5ml离心管，离心(室温，13000rpm，2min)，将上清转移至另一离心管。所有样品用液氮快速冷冻后，保存于一70℃。
2.12用Ellman方法检测AChE活性吸取50μl酵母培养液，加入96孔酶标板的对应微孔中，25℃，放置5min。在孔中加入250μl Ellman试剂(1mM AsCh，0.3mM DTNB，0.1M磷酸钠缓冲液)，混匀，立即将96孔板置于酶标仪(购自美国Bio-tech公司)中，测定405nm波长下前3min吸光值的变化(ΔOD/min)。阴性对照是以50μl的磷酸缓冲液代替酵母培养液。每个时间点的收集样品平行测定2次。
2.13提取AChE粗酶液挑取新鲜的AChE*-GS115单菌落，在100ml BMMY培养液中持续诱导AChE表达144h。离心(4℃，13000rpm，5min)，收集上清。用0.22μm的滤膜过滤上清，除去残留的酵母细胞。将上清转移至半透膜中，两端以袋夹夹紧，放入表面皿，在膜的上表面及两侧撒上适量的聚乙二醇粉末，8h后，由于聚乙二醇的吸水性，培养液的大多数水分子被吸出半透膜，培养液被浓缩10倍。将盛有浓缩液的半透膜转移至Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，2-3h)，即得浓缩脱盐的AChE粗酶液。
2.14计算重组AChE蛋白的米氏常数Km将六个浓度(0.05，0.1，1，5，10，50mM)的AsCh，分别与五个浓度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，25℃，测定酶的反应速度，计算Km值。
2.15计算重组AChE蛋白的抑制常数Ki将三个不同浓度(10-6，10-8，10-10M)的抑制剂与五个不同浓度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，分别在两者反应的第15sec、1min、3min、5min，10min、15min、20min、30min时收集等量混合液，25℃，以1mM AsCh测定其残余酶的浓度，最后计算Ki值。
根据上述实验条件和具体技术要求进一步结合具体实施阐述本发明。这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量敌敌畏的抑制1.溶液、试剂(1)BMGY溶液在700ml水中溶解10g酵母提取物与20g蛋白胨，高压灭菌(20min)；溶液温度降至室温后，分别加入100ml磷酸钾缓冲液(1M，pH6.0)、100ml10×YNB、2ml 500×B、100ml 10×GY；溶液在4℃的保质期为两个月。
(2)BMMY溶液将BMGY溶液中的10×GY换为10×M，其余成分不变。溶液在4℃的保质期为两个月。
(3)敌敌畏溶液称量0.11g敌敌畏(MW＝220.98)晶体，溶于5ml丙酮中，此时敌敌畏浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
(4)Ellman试剂称量0.426g Na2HPO4(MW＝142)溶于30mL水中，调节pH＝7.0，配制成100mM磷酸钠溶液；称量0.0396g DTNB溶于10mL Na2HPO4溶液中，加入15mg NaHCO3，混匀后，用铝箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用时间不超过一天；称量0.0217g ACThI，溶于1mL水中，用铝箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用时间不超过一天。按15mL∶500uL∶200uL混合磷酸钠溶液、DTNB与ACThI溶液，即得Ellman试剂。
2.操作步骤(1)挑取新鲜的AChE*-GS115单菌落，接种于25ml的BMGY液中，振荡培养(28℃，200rpm)。
(2)18h后，离心(室温，5000rpm，5min)，收集菌体，倒去上清，用50ml BMMY液悬浮菌体，用两层纱布封住三角瓶瓶口，振荡培养(28℃，250rpm)。每隔24h，向培养液中加入甲醇，终浓度为0.5％。在第144h，收集菌液，离心(4℃，12000rpm，10min)，将上清(45ml)转移至无菌三角瓶中，置于冰上。
(3)取出一段无菌的半透膜，一端用夹子夹紧，将全部上清倒入膜内，再夹紧另一端，确认没有液体渗漏后，把它放入表面皿中，在膜的上下表面铺撒聚乙二醇，静置(4℃，8h)，用水冲洗膜表面残留的聚乙二醇后，将它放入500ml的Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，3h)，打开一端的夹子，用移液器吸取膜内粗酶液，按1ml/管分装在无菌Eppendorf管中，取1管，在冰上放置，其余用液氮速冻，保存于-70℃，备用。
(4)用丙酮溶解敌敌畏晶体，配制成浓度为10-5，10-6，10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的粗酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的酶标板孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。
(5)按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受敌敌畏抑制的抑制率。其中，Ri代表抑制率，ΔA0代表活性未受抑制的酶引起的吸光度变化值，ΔA代表酶受抑制后引起的吸光度变化值。
结果表明，低浓度的敌敌畏对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表2所示。
表2 甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受敌敌畏抑制的抑制率(％)
实施例2——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量毒死蜱的抑制1.溶液(1)毒死蜱溶液称量0.175g毒死蜱(MW＝350.6)晶体，溶于5ml丙酮中，此时毒死蜱浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤操作与实施例1基本相同。用丙酮溶解毒死蜱晶体，配制成浓度为10-5，10-6，10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的粗酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的酶标板孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受毒死蜱抑制的抑制率。
结果表明，低浓度的毒死蜱对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表3所示。
表3 甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受毒死蜱抑制的抑制率(％)
实施例3——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量抗蚜威的抑制1.溶液(1)抗蚜威溶液称量0.119g抗蚜威(MW＝238.33)晶体，溶于5ml丙酮中，此时抗蚜威浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤操作与实施例1基本相同。用丙酮溶解抗蚜威晶体，配制成浓度为10-5，10-6，10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的粗酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的微孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受抗蚜威抑制的抑制率。
结果表明，低浓度的抗蚜威对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表4所示。
表4 甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受抗蚜威抑制的抑制率(％)
实施例4——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量乐果的抑制1.溶液(1)乐果溶液称量0.115g乐果(MW＝229.12)晶体，溶于5ml丙酮中，此时乐果浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤操作与实施例1基本相同。用丙酮溶解乐果晶体，配制成浓度为10-5，10-6，10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的粗酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的微孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受乐果抑制的抑制率。
结果表明，低浓度的乐果对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表5所示。
表5 甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受乐果抑制的抑制率(％)
本发明的各个实施例获得了含果蝇AChE cDNA的大肠杆菌克隆，如图2；在此基础上，获得了含改造后的果蝇AChE cDNA的大肠杆菌克隆，如图3。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1atggccatctcctgtcggcag(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核苷酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2ttagaaaacccttttggttcgcaatg(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度30bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3agaattcgtcatcgatcgcctggtcgtgca(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度42bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4agcggccgcttattacgacgaatcgccatcgcaagtacctgc(5)SEQ ID NO.5-7的信息<110>上海交通大学<120>果蝇乙酰胆碱酯酶基因的克隆、改造及其在甲醇酵母中的表达<140>
<141>2005-05-01<160>7<170>PatentIn version 3.1
<210>5<211>1950<212>DNA<213>Drosophila AChE蛋白<400>5atggccatct cctgtcggca gagcagagtc ctgcccatgt ccttgcccct gcctctgacc 60atcccgctgc ccctggtgct ggtgctatca ctgcacctgt ccggcgtctg cggcgtcatc120gatcgcctgg tcgtgcagac atcctccgga cctgtacgcg gtcgctccgt gacggtgcag180ggcagggagg tgcatgtcta cacgggcatc ccctacgcca agccgcccgt cgaggacctg240cgcttccgaa agccggttcc cgcggagcca tggcacggcg tcctcgacgc cacgcggtta300tccgccacct gcgtccaata ccgtgacgag tacttccccg gcttctccgg cgaggagatc360tggaacccca acaccaacgt gtccgaggac tgcctctaca taaatgtctg ggcgccggca420aaggcccgac ttcgccatgg tcggggtgcc aacgggggtg agcaccccaa tggcaaacag480gcggacactg accatctcat ccacaacgga aatccgcaga acacgaccaa cggactgccg540attctgatct ggatctatgg cggtggcttc atgaccggat cggccaccct ggacatctac600aatgcggata tcatggccgc cgtgggcaat gtaatagtgg cctccttcca gtatcgagtg660ggagcctttg ggttcttgca cctggcgccg gaaatgccgt cggagtttgc ggaagaggcg720cccggcaatg tgggcctatg ggatcaggca ctcgccattc gctggctgaa ggacaacgct780catgccttcg gcggaaatcc ggagtggatg acactgttcg gagagtcggc tggatccagt840tcggtgaatg cccagctcat gtcgccggtg acgaggggtc tggtcaagcg cggaatgatg900cagtcgggca ctatgaacgc cccctggagc cacatgacct ccgagaaggc cgtggagatc960ggcaaggcgc tgatcaacga ctgcaactgc aatgcatcta tgctgaagac caatcccgct 1020cacgtgatga gctgcatgcg ttccgtggac gccaagacca tatcggtgca gcagtggaac 1080tcctactcgg gcatcctcag ctttccctcg gcgcccacca ttgatggtgc gttcctgccg 1140gcggatccca tgacgctgat gaagacggcg gatctgaagg actacgacat cctgatggga 1200aatgtcaggg atgagggcac ttacttcttg ctgtacgatt tcatcgatta cttcgataag 1260gacgatgcca cggccctgcc acgggacaaa tacctggaaa ttatgaacaa tatttttggc 1320aaggcaacgc aagcggaacg cgaggccatc attttccagt ataccagttg ggaaggcaat 1380cctggctatc agaaccagca gcaaatcgga cgcgccgtgg gcgatcactt cttcacctgc 1440cccaccaacg agtatgccca ggctctggcg gagcgaggcg cttccgtgca ctactactac 1500tttacacacc gcacaagcac ctcattgtgg ggcgaatgga tgggcgtgct gcacggcgat 1560gagatcgaat acttctttgg ccagccgctg aacaactccc tgcagtatcg acctgtggag 1620cgtgagctgg gcaagcgtat gctcagtgcg gtcatcgagt ttgctaagac gggaaatccc 1680gctcaggatg gcgaggagtg gcccaacttc tccaaggagg atcccgtcta ctatattttc 1740agcaccgacg ataagatcga gaaattggcc aggggtcctt tggcggctcg ctgctcgttc 1800tggaatgatt acttgccaaa agtcaggagt tgggcaggta cttgcgatgg cgattcggga 1860agtgcttcca tatccccgag gctccagctc cttggaatcg ctgctctgat ctacatctgc 1920gccgcattgc gaaccaaaag ggttttctaa1950
<210>6<211>1749<212>DNA<213>Drosophila AChE蛋白<400>6gtcatcgatc gcctggtcgt gcagacatcc tccggacctg tacgcggtcg ctccgtgacg 60gtgcagggca gggaggtgca tgtctacacg ggcatcccct acgccaagcc gcccgtcgag120gacctgcgct tccgaaagcc ggttcccgcg gagccatggc acggcgtcct cgacgccacg180cggttatccg ccacctgcgt ccaataccgt gacgagtact tccccggctt ctccggcgag240gagatctgga accccaacac caacgtgtcc gaggactgcc tctacataaa tgtctgggcg300ccggcaaagg cccgacttcg ccatggtcgg ggtgccaacg ggggtgagca ccccaatggc360aaacaggcgg acactgacca tctcatccac aacggaaatc cgcagaacac gaccaacgga420ctgccgattc tgatctggat ctatggcggt ggcttcatga ccggatcggc caccctggac480atctacaatg cggatatcat ggccgccgtg ggcaatgtaa tagtggcctc cttccagtat540cgagtgggag cctttgggtt cttgcacctg gcgccggaaa tgccgtcgga gtttgcggaa600gaggcgcccg gcaatgtggg cctatgggat caggcactcg ccattcgctg gctgaaggac660aacgctcatg ccttcggcgg aaatccggag tggatgacac tgttcggaga gtcggctgga720tccagttcgg tgaatgccca gctcatgtcg ccggtgacga ggggtctggt caagcgcgga780atgatgcagt cgggcactat gaacgccccc tggagccaca tgacctccga gaaggccgtg840gagatcggca aggcgctgat caacgactgc aactgcaatg catctatgct gaagaccaat900cccgctcacg tgatgagctg catgcgttcc gtggacgcca agaccatatc ggtgcagcag960tggaactcct actcgggcat cctcagcttt ccctcggcgc ccaccattga tggtgcgttc 1020ctgccggcgg atcccatgac gctgatgaag acggcggatc tgaaggacta cgacatcctg 1080atgggaaatg tcagggatga gggcacttac ttcttgctgt acgatttcat cgattacttc 1140gataaggacg atgccacggc cctgccacgg gacaaatacc tggaaattat gaacaatatt 1200tttggcaagg caacgcaagc ggaacgcgag gccatcattt tccagtatac cagttgggaa 1260ggcaatcctg gctatcagaa ccagcagcaa atcggacgcg ccgtgggcga tcacttcttc 1320acctgcccca ccaacgagta tgcccaggct ctggcggagc gaggcgcttc cgtgcactac 1380tactacttta cacaccgcac aagcacctca ttgtggggcg aatggatggg cgtgctgcac 1440ggcgatgaga tcgaatactt ctttggccag ccgctgaaca actccctgca gtatcgacct 1500gtggagcgtg agctgggcaa gcgtatgctc agtgcggtca tcgagtttgc taagacggga 1560aatcccgctc aggatggcga ggagtggccc aacttctcca aggaggatcc cgtctactat 1620attttcagca ccgacgataa gatcgagaaa ttggccaggg gtcctttggc ggctcgctgc 1680tcgttctgga atgattactt gccaaaagtc aggagttggg caggtacttg cgatggcgat 1740tcgtcgtaa 1749<210>7<211>582<212>PRT
<213>Drosophila AChE蛋白<400>7vidrlvvqts sgpvrgrsvt vqgrevhvyt gipyakppve dlrfrkpvpa epwhgvldat 60rlsatcvqyr deyfpgfsge eiwnpntnvs edclyinvwa pakarlrhgr ganggehpng 120kqadtdhlih ngnpqnttng lpiliwiygg gfmtgsatld iynadimaav gnvivasfqy 180rvgafgflhl apempsefae eapgnvglwd qalairwlkd nahafggnpe wmtlfgesag 240sssvnaqlms pvtrglvkrg mmqsgtmnap wshmtsekav eigkalindc ncnasmlktn 300pahvmscmrs vdaktisvqq wnsysgilsf psaptidgaf lpadpmtlmk tadlkdydil 360mgnvrdegty fllydfidyf dkddatalpr dkyleimnni fgkatqaere aiifqytswe 420gnpgyqnqqq igravgdhff tcptneyaqa laergasvhy yyfthrtsts lwgewmgvlh 480gdeieyffgq plnnslqyrp verelgkrml saviefaktg npaqdgeewp nfskedpvyy 540ifstddkiek largplaarc sfwndylpkv rswagtcdgd ss58权利要求
1.一种编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列，其特征在于，编码具有乙酰胆碱酯酶活性的蛋白质，且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5相同。
2.根据权利要求1所述的编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的编码，果蝇乙酰胆碱酯酶的信号肽与糖磷脂锚定信号的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列与SEQ ID NO.6相同。
3.根据权利要求1所述的编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7相同。
4.根据权利要求2所述的编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的果蝇，以其总cDNA为模板，用核苷酸序列与SEQ ID NO1相同引物1和核苷酸序列与SEQ ID NO2相同引物2进行PCR扩增，获得乙酰胆碱酯酶的cDNA扩增产物，为1950bp，以抽提大肠杆菌的质粒pT-AChE为模板，用核苷酸序列与SEQ ID NO3相同引物3和核苷酸序列与SEQ ID NO4相同引物4进行PCR扩增，获得切除信号肽序列及糖磷脂锚定序列后的乙酰胆碱酯酶的cDNA扩增产物，为1749bp。
5.根据权利要求1或者2或者4所述的编码果蝇乙酰胆碱酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的乙酰胆碱酯酶，米氏常数Km＝12.3±3.7μM。
全文摘要
本发明涉及果蝇乙酰胆碱酯酶的基因，属于分子生物基因技术领域。编码具有乙酰胆碱酯酶活性的蛋白质，且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5相同。所述的编码，果蝇乙酰胆碱酯酶的信号肽与糖磷脂锚定信号的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列与SEQ ID NO.6相同。该基因在甲醇酵母细胞中得到表达，产物具有乙酰胆碱酯酶活性且分泌于酵母培养基中。本发明对低浓度的有机磷及氨基甲酸酯农药具有显著的敏感性，该基因的表达产物可以用于农产品中农药残留的检测，并为研制农药生物学检测产品提供灵敏的蛋白酶材料，具有很大的应用价值。
文档编号C12N9/16GK1727487SQ20051002594
公开日2006年2月1日 申请日期2005年5月19日 优先权日2005年5月19日
发明者张大兵, 许诵辞, 武爱波, 梁婉琪, 潘爱虎 申请人:上海交通大学