专利名称:一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(ar－ache)及基因编码序列的制作方法
本发明涉及酶学和分子细胞生物学，尤其是关于参与细胞凋亡过程中的酶。具体地，本发明涉及一种人类各组织细胞在发生细胞凋亡时表达的乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-ACHE)及其核酸序列。
乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，ACHE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶，属于糖蛋白。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut-H；et alJ-Clin-Invest.1990，86(3)900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches to cholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。
人的乙酰胆碱酯酶基因位于7号染色体上(7q22)，目前发现有3种不同的剪切形式神经肌肉型、红细胞型和通读型(Soreq，H.et al.Proc Natl AcadSci U S A.1990，87，9688-92；Soreq，H.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1994，91，7907-11)。乙酰胆碱酯酶在胆碱能神经系统的功能是水解神经递质乙酰胆碱，使之生成胆碱和乙酸。红细胞型和通读型的功能不清楚，也有报道认为乙酰胆碱酯酶具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性.。近年来，由于体外培养的肿瘤细胞株也检测到AChE mRNA的转录和化疗后的卵巢癌患者的血清检测到乙酰胆碱酯酶活性，有作者认为乙酰胆碱酯酶与肿瘤发生有关(Lev-Lehman-E，et alBlood.1997，89(10)3644-53)。
老年性痴呆(AD)是退行神经性中较多见的疾病。虽然AD病人脑中的总ACHE活性是降低的，但在老年斑中和老年斑周围的ACHE活性却是升高的(Javier Saez-Valero et al.，J.Neurochem.1999，Vol.72，1600-1608；Opazo-G & Inestrosa-NC，Mol-Chem-Neuropathol.1998，33(1)39-49；MimoriY.et al.，Behav Brain Res.1997，83(1-2)25-30.)，而且，与神经递质降解功能无关。已经证明发现老年性痴呆患者病灶处有凋亡细胞存在，在长期研究细胞凋亡过程中，发现哺乳动物包括人类的一切细胞株，除了红细胞外，经过诱导，启动凋亡过程中表达乙酰胆碱酯酶异构体，这个结果可以很好注释上述现象。我们已经申请了该类酶的获得方法(张学军等，中国专利申请号97 1 25216.5，发明专利证书第61260号)和部分功能(张学军等，中国专利申请号97 1 25220.3，公开号CN 1186859)的专利。本发明采用RACE等方法，获得了AR-ACHE的cDNA全序列。
本发明的第一目的就是提供一种新的人基因乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)(Genbank Accession No.AF334270未公开)，该基因是一个人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白基因。
本发明的第二目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白和核酸序列的方法。
本发明还提供了这种人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白多肽和编码序列的应用。
本发明使用了体外培养的SK-N-SH，人肺成纤维细胞(HLF)、K562等细胞株，用DMEM，1640培养基，添加10％小牛血清，在37℃，5％CO2，培养箱培养。诱导细胞凋亡方法有3种自然衰老法，UV-B和化疗药物诱导法。自然衰老法，培养细胞，3-4天不换培养液，这时，贴壁生长的细胞，部分失去贴壁能力，进入了凋亡过程，收集这时的细胞。药物诱导法用抗肿瘤药物或低血清或去细胞因子等方法诱导细胞凋亡。对于细胞因子依赖的细胞株，入M07e巨核细胞株，只要在培养液中不加入GM-CSF，2-3天后，大量细胞发生凋亡，收集这时的细胞。UV-B诱导10分钟，培养18小时后可收集凋亡细胞。全过程的具体操作如下总RNA提取将SK-N-SH细胞，HLF或K562在1640培养基中(Gibco BRL公司)于不换液的条件下培养至细胞凋外亡状态，然后用Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取细胞总RNA。约106细胞加入1ml Trizol，吹打均匀后室温放置5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置3分钟。然后4℃ 12000g离心15分钟，吸出上层无色水相，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃ 12000g离心10分钟。再用75％乙醇洗沉淀，7500g，4℃离心5分钟。待干燥后溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
mRNA的分离先将总RNA定量，再使用Qiagen公司的Oligotex mini mRNA Kit按Kit的产品操作手册分离mRNA，溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
基因的全长克隆(1)RT-PCR根据人类ACHE基因的序列，设计5′和3′引物，引物序列为R1(SEQ IDNo.3)5′-cttccacggcctgcagctggct-3′，(正向)，R2(SEQ ID No.4)5′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′(反向)，采用常规方法合成上述引物。用SK-N-SH细胞的mRNA进行RT-PCR扩增。条件为96℃ 3分钟后，以95℃ 30秒，72℃ 2分钟做5个循环，再以95℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 1分钟做39个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测PCR产物为527bp长度，将产物克隆测序，发现存在一种与人类正常ACHE基因不同的拼接形式。
(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)根据已经测得的序列，设计5′和3′引物，用SK-N-SH细胞mRNA的RT产物分别扩增上游和下游序列，将PCR产物克隆测序。
通过使用以上两种方法，获得了人类AR-ACHE的全长(见SEQ IDNo.1)。
人AR-ACHE基因的序列信息与同源性分析本发明新的人AR-ACHE全长cDNA(GenBank AccessionNo.AF334270)的长度为1936bp；其中开放读框位于106-1686位核苷酸(见SEQ ID No.1)。根据全长cDNA推导出人AR-ACHE的氨基酸序列，共526个氨基酸残基(见SEQ ID No.2)，分子量58352.30D，PI为6.44.将AR-ACHE的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人的ACHE基因至少存在85.7％的同源性。但AR-ACHE是一种人ACHE基因的异常拼接形式基因。在核苷酸水平上，它是人ACHE基因的mRNA全编码序列(GenBank Accession No.M.55040)在Exon3中从第一到第264个碱基发生缺失后形成的一种拼接体。在氨基酸水平上，它是人ACHE蛋白(GenProt Accession No.AAA68151)的第357-444位氨基酸残基缺失后形成的一种新的拼接体蛋白(见图1)。
本发明的人AR-ACHE除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明的人AR-ACHE还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明的人AR-ACHE蛋白的N端与人ACHE蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人AR-ACHE的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人AR-ACHE核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人AR-ACHE的表达水平或者抑制人AR-ACHE的过度表达。本发明的人AR-ACHE蛋白或其活性多肽片段可以施用于肿瘤病人，以治疗或减轻因人AR-ACHE缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。根据人的乙酰胆碱酯酶的cDNA序列表达的人AR-ACHE蛋白质，并利用此蛋白质产生的多克隆抗体和单克隆抗体，使用此多克隆或单克隆抗体可以特异性地和AR-ACHE结合，因此在与AR-ACHE产生有关的各种疾病中可以特异性地检测到此蛋白质的存在，亦可在疾病早期或愈后检测蛋白质的存在。
由于本发明的人AR-ACHE蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
人AR-ACHE多肽的制备和提纯在该实施例中，将全长的人AR-ACHE编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
将人AR-ACHE多肽以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌。根据人AR-ACHE的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5′和3′端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的产物为模板，经PCR扩增后，将人AR-ACHE基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5-α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-AR-ACHE表达载体的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE。
表达GST-AR-ACHE重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE于3ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)中培养约3小时，至OD 600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2XSDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-AR-ACHE融合蛋白的工程菌。
GST-AR-ACHE融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达GST-AR-ACHE融合表达蛋白的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-AR-ACHE的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升起声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在58kDa处的蛋白质条带即为人AR-ACHE蛋白(见图2)。
人的乙酰胆碱酯酶基因位于7号染色体上(7q22)，目前发现有3种不同的剪切形式神经肌肉型、红细胞型和通读型。本发明是克隆到乙酰胆碱酯酶的异构体(AR-ACHE)。使乙酰胆碱酯酶有了第4种类型。它在人任何有核细胞凋亡时表达，在细胞凋亡中起重要作用，为治疗AD等退行病的药物设计，和肿瘤药物设计提供新思路和方法，在世界上都是首次。
本发明具有如下优点1.利用AR-ACHE作为该乙酰胆碱酯酶家族的一员可用于进一步功能研究。
2. AR-ACHE可与该家族其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，可望获得活性更高并具有新特性蛋白。
3.本发明AR-ACHE核酸可被引入细胞，以提高人AR-ACHE的表达水平或抑制人AR-ACHE的过度表达。
4.为治疗AD等病的药物设计和肿瘤药物设计提供新思路和方法。
图1，AR-ACHE与人脑型ACHE氨基酸序列比较，AR-ACHE少88个氨基酸残基。
图2. SDS-PAGE电泳，Western blot，ECL染色。1 lane是凋亡SK-N-SH细胞裂解样品；2 lane是正常SK-N-SH细胞裂解样品。正常SK-N-SH细胞表达脑型乙酰胆碱酯酶，其单体分子量约65Kda；凋亡SK-N-SH细胞表达的AR-ACHE单体分子量小于58Kda。
本发明通过以下的附图和实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆》实验室手册(NeW YorkCold Sprng Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例11.总RNA提取；将SK-N-SH细胞在1640培养基中(Gibco BRL公司)于不换液的条件下培养至细胞凋外亡状态，然后用Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取细胞总RNA。约106细胞加入1ml Trizol，吹打均匀后室温放置5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置3分钟。然后4℃12000g离心15分钟，吸出上层无色水相，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃12000g离心10分钟。再用75％乙醇洗沉淀，7500g，4℃离心5分钟。待干燥后溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
mRNA的分离先将总RNA定量，再使用Qiagen公司的Oligotex mini mRNA Kit按Kit产品的操作手册分离mRNA，溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
2.基因的全长克隆(1).RT-PCR根据人类ACHE基因的序列，设计5′和3′引物，引物序列为R1(SEQ IDNo.3)5′-cttccacggcctgcagctggct-3′，(正向)，R2(SEQ ID No.4)5′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′(反向)。用SK-N-SH细胞的mRNA进行RT-PCR扩增。条件为96℃ 3分钟后，以95℃30秒，72℃ 2分钟做5个循环，再以95℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 1分钟做39个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测PCR产物为527bp长度，将产物克隆测序，发现存在一种与人类正常ACHE基因不同的拼接形式。
(2).cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)根据已经测得的序列，设计5’和3’引物，用SK-N-SH细胞mRNA的RT产物分别扩增上游和下游序列，将PCR产物克隆测序。通过使用以上两种方法，获得了人类AR-ACHE的全长(见SEQ ID No.1)。
实施例2 人AR-ACHE基因的序列信息与同源性分析本发明新的人AR-ACHE全长cDNA(GenBank AccessionNo.AF334270)的长度为1936bp；其中开放读框位于106-1686位核苷酸。根据全长cDNA推导出人AR-ACHE的氨基酸序列，共526个氨基酸残基(见SEQ ID No.2)，分子量58352.30 D，PI为6.44.将AR-ACHE的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人的ACHE基因至少存在85.7％的同源性。但AR-ACHE是一种人ACHE基因的异常拼接形式基因。在核苷酸水平上，它是人ACHE基因的mRNA全编码序列(GenBank Accession No.M.55040)在Exon3中从第一到第264个碱基发生缺失后形成的一种拼接体。在氨基酸水平上，它是人ACHE蛋白(GenProt Accession No.AAA68151)的第357-444位氨基酸残基缺失后形成的一种新的拼接体蛋白(见图1)。
本发明的人AR-ACHE除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明的人AR-ACHE还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明的人AR-ACHE蛋白的N端与人ACHE蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。针对本发明人AR-ACHE的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人AR-ACHE核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人AR-ACHE的表达水平或者抑制人AR-ACHE的过度表达。本发明的人AR-ACHE蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人AR-ACHE缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
由于本发明的人AR-ACHE蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
实施例3人AR-ACHE蛋白的结构和功能研究1.将人AR-ACHE蛋白的氨基酸序列输入数据库，并且利用数据库的软件分析比较(网址为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到以下结果1)我们输入的氨基酸序列1 MRPPQCLLHTPSLASPLLLLLLWLLGGGVGAEGREDAELLVTVRGGRLRGIRLKTPGGPV61 SAFLGIPFAEPPMGPRRFLPPEPKQPWSGVVDATTFQSVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPN121 RELSEDCLYLNVWTPYPRPTSPTPVLVWIYGGGFYSGASSLDVYDGRFLVQAERTVLVSM181 NYRVGAFGFLALPGSREAPGNVGLLDQRLALQWVQENVAAFGGDPTSVTLFGESAGAASV241 GMHLLSPPSRGLFHRAVLQSGAPNGPWATVGMGEARRRATQLAHLVGCPPGGTGGNDTEL301 VACLRTRPAQVLVNHEWHVLPQESVFRFSFVPVVDGDFLSDTPEALINAGDFHGLQLAGR361 LAAQGARVYAYVFEHRASTLSWPLWMGVPHGYEIEFIFGIPLDPSRNYTAEEKIFAQRLM421 RYWANFARTGDPNEPRDPKAPQWPPYTAGAQQYVSLDLRPLEVRRGLRAQACAFWNRFLP481 KLLSATDTLDEAERQWKAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL2)分析后的结果processing.
QueryIDUNKNOW为本发明序列QueryLength长度526aaMost Probable ProSite Patterns最可能的作用位点模式PS00122 CARBOXYLESTERASE_B_1羧酸酯酶B1型EC3。1。1。1PS00941 CARBOXYLESTERASE_B_2羧酸酯酶B2型EC3。1。1。7PS00014 ER_TARGETGLOBAL MOTIF BKID KLEN BLAST SKID ％IDN RATIO PSFLAG9.0 10.0 ACES_HUMAN 614 0.0 ACES_HUMAN 85.7 1.17 T-PS001229.0 10.0 ACES_HUMAN 614 0.0 ACES_HUMAN 85.7 1.17 T-PS009416.5 0.0 EST4_RAT 561 1e-46 EST4_RAT 32.6 1.06 ？-PS000143)Most Probable PIR Superfamilies最可能的大家族SFA00837 cholinesterase胆碱酯酶SFA01749 thyroglobulinSFA05547 juvenile-hormone esteraseSFA00831 triacylglycerol lipaseGL0BAL BKID KLEN BSF# BLAST SKID SSF# ％IDN RATIO9.0 ACES_HUMAN 614 SFA00837 0.0 ACES_HUMAN SFA00837 85.7 1.176.5 THYG_BOVIN 2769 SFA01749 2e-44 THYG_BOVIN SFA01749 31.9 1.035.0 ESTJ_HELVI 564 SFA05547 8e-40 ESTJ_HELVI SFA05547 34.7 0.605.0 LIP2_CANRU 548 SFA00831 8e-38 LIP2_CANRU SFA00831 36.7 0.604)ProSite Pattern Match and Clustal W Multiple Motif Alignment匹配多位点如下AC PS00122ID CARBOXYLESTERASE_B_1；PATTERN.DE Carboxylesterases type-B serine active site.PA F-[GR]-G-x(4)-[LIVN]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-GACES_BOVIN+S10712 PST 190 FGGDPTSVTLFGESAGACES_HUMAN+A39256 PST 221 FGGDPTSVTLFGESAGQueryID GFT 221 FGGDPTSVTLFGESAGACES_RAT+JH0811 PST 221 FGGDPMSVTLFGESAGLIP2_CANRU+S32615 PST 210 FGGDPSKVTIYGESAGESTJ_HELVI+A34325 PST 207 FGGDPSDITIAGQSAG***** .:*: *:***5)胆碱酯酶类似位点AC PS00941ID CARBOXYLESTERASE_B_2；PATTEPN.DE Carboxylesterases type-B signature 2.PA [ED]-D-C-L-[YT]-[LIV]-[DNS]-[LIV]-[LIVFYW]-x-[PQR]
ACES_HUMAN+A39256 PST 125 EDCLYLNVWTPACES_MOUSE+JH0314 PST 125 EDCLYLNVWTPACES_RAT+JH0811 PST 125 EDCLYLNVWTPQueryID GFT 125 EDCLYLNVWTPLIP2_CANRU+S32615 PST 109 EDCLTINVIRPTHYG_BOVIN+UIB0 PST 2280 EDCLYLNVFVPESTJ_HELVI+A34325 PSn 107 EACIYANIHVP*: *: *实施例4人AR-ACHE多肽的制备和提纯将全长的人AR-ACHE编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
1.将人AR-ACHE多肽以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据人AR-ACHE的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约2O个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的产物为模板，经PCR扩增后，将人AR-ACHE基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5-α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-AR-ACHE表达载体的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE。
表达GST-AR-ACHE重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的工程菌DH5-α-pGEX-2T-AR-ACHE于3ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)中培养约3小时，至OD 600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2XSDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-AR-ACHE融合蛋白的工程菌。
GST-AR-ACHE融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达GST-AR-ACHE融合表达蛋白的工程菌DHS-α-pGEX-2T-AR-ACHE诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-AR-ACHE的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升起声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10ul还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在58kDa处的蛋白质条带即为人AR-ACHE蛋白(见图2)。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度1936bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1SequenceNewSequence1 CAGAGTCGGC TCAGCCTGCG CCGGGGAACA TCGGCCGCCT CCAGCTCCCG GCGCGGCCCG GCCCGGCCCG71 GCTCGGCCGC CTCAGACGCC GCCTGCCCTG CAGCCATGAG GCCCCCGCAG TGTCTGCTGC ACACGCCTTC141 CCTGGCTTCC CCACTCCTTC TCCTCCTCCT CTGGCTCCTG GGTGGAGGAG TGGGGGCTGA GGGCCGGGAG211 GATGCAGAGC TGCTGGTGAC GGTGCGTGGG GGCCGGCTGC GGGGCATTCG CCTGAAGACC CCCGGGGGCC281 CTGTCTCTGC TTTCCTGGGC ATCCCCTTTG CGGAGCCACC CATGGGACCC CGTCGCTTTC TGCCACCGGA351 GCCCAAGCAG CCTTGGTCAG GGGTGGTAGA CGCTACAACC TTCCAGAGTG TCTGCTACCA ATATGTGGAC421 ACCCTATACC CAGGTTTTGA GGGCACCGAG ATGTGGAACC CCAACCGTGA GCTGAGCGAG GACTGCCTGT491 ACCTCAACGT GTGGACACCA TACCCCCGGC CTACATCCCC CACCCCTGTC CTCGTCTGGA TCTATGGGGG561 TGGCTTCTAC AGTGGGGCCT CCTCCTTGGA CGTGTACGAT GGCCGCTTCT TGGTACAGGC CGAGAGGACT631 GTGCTGGTGT CCATGAACTA CCGGGTGGGA GCCTTTGGCT TCCTGGCCCT GCCGGGGAGC CGAGAGGCCC701 CGGGCAATGT GGGTCTCCTG GATCAGAGGC TGGCCCTGCA GTGGGTGCAG GAGAACGTGG CAGCCTTCGG771 GGGTGACCCG ACATCAGTGA CGCTGTTTGG GGAGAGCGCG GGAGCCGCCT CGGTGGGCAT GCACCTGCTG841 TCCCCGCCCA GCCGGGGCCT GTTCCACAGG GCCGTGCTGC AGAGCGGTGC CCCCAATGGA CCCTGGGCCA911 CGGTGGGCAT GGGAGAGGCC CGTCGCAGGG CCACGCAGCT GGCCCACCTT GTGGGCTGTC CTCCAGGCGG981 CACTGGTGGG AATGACACAG AGCTGGTAGC CTGCCTTCGG ACACGACCAG CGCAGGTCCT GGTGAACCAC1051 GAATGGCACG TGCTGCCTCA AGAAAGCGTC TTCCGGTTCT CCTTCGTGCC TGTGGTAGAT GGAGACTTCC1121 TCAGTGACAC CCCAGAGGCC CTCATCAACG CGGGAGACTT CCACGGCCTG CAGCTGGCTG GGCGACTGGC1191 TGCCCAGGGT GCCCGGGTCT ACGCCTACGT CTTTGAACAC CGTGCTTCCA CGCTCTCCTG GCCCCTGTGG1261 ATGGGGGTGC CCCACGGCTA CGAGATCGAG TTCATCTTTG GGATCCCCCT GGACCCCTCT CGAAACTACA1331 CGGCAGAGGA GAAAATCTTC GCCCAGCGAC TGATGCGATA CTGGGCCAAC TTTGCCCGCA CAGGGGATCC1401 CAATGAGCCC CGAGACCCCA AGGCCCCACA ATGGCCCCCG TACACGGCGG GGGCTCAGCA GTACGTTAGT1471 CTGGACCTGC GGCCGCTGGA GGTGCGGCGG GGGCTGCGCG CCCAGGCCTG CGCCTTCTGG AACCGCTTCC1541 TCCCCAAATT GCTCAGCGCC ACCGACACGC TCGACGAGGC GGAGCGCCAG TGGAAGGCCG AGTTCCACCG1611 CTGGAGCTCC TACATGGTGC ACTGGAAGAA CCAGTTCGAC CACTACAGCA AGCAGGATCG CTGCTCAGAC1681 CTGTGACCCC GGCGGGACCC CCATGTCCTC CGCTCCGCCC GGCCCCCTAG CTGTATATAC TATTTATTTC1751 AGGGCTGGGC TATAACACAG ACGAGCCCCA GACTCTGCCC ATCCCCACCC CACCCCGACG TCCCCCGGGG1821 CTCCCGGTCC TCTGGCATGT CTTCAGGCTG AGGTCCTCCC CGCGTGCCTT CGCCCTCTGG CTGCAAATAA1891 ACTGTTACAG GCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度526aa(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 MRPPQCLLHTPSLASPLLLLLLWLLGGGVGAEGREDAELLVTVRGGRLRGIRLKTPGGPV61 SAFLGIPFAEPPMGPRRFLPPEPKQPWSGVVDATTFQSVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPN121 RELSEDCLYLNVWTPYPRPTSPTPVLVWIYGGGFYSGASSLDVYDGRFLVQAERTVLVSM181 NYRVGAFGFLALPGSREAPGNVGLLDQRLALQWVQENVAAFGGDPTSVTLFGESAGAASV241 GMHLLSPPSRGLFHRAVLQSGAPNGPWATVGMGEARRRATQLAHLVGCPPGGTGGNDTEL301 VACLRTRPAQVLVNHEWHVLPQESVFRFSFVPVVDGDFLSDTPEALINAGDFHGLQLAGR361 LAAQGARVYAYVFEHRASTLSWPLWMGVPHGYEIEFIFGIPLDPSRNYTAEEKIFAQRLM421 RYWANFARTGDPNEPRDPKAPQWPPYTAGAQQYVSLDLRPLEVRRGLRAQACAFWNRFLP481 KLLSATDTLDEAERQWKAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.35′-cttccacggcctgcagctggct-3′(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度37bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.45′-gacaagcttacaggtctgagcagcgatcctgcttgct-3′
权利要求
1.一种分离出的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于，它包括有SEQ ID No.1所示的cDNA序列的人乙酰胆碱酯酶异构体。
2.根据权利要求
1所述的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于，所述人乙酰胆碱酯酶异构体的cDNA与人的乙酰胆碱酯酶所示cDNA序列至少85.7％的同源性，且为人ACHE基因Exon3中从第一到第264碱基缺失所形成的新的乙酰胆碱酯酶DNA分子。
3.根据权利要求
1所述的人乙酰胆碱酯酶的DNA分子，其特征在于它包含有SEQ ID No.2所示的多肽氨基酸序列的人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白多肽。
4.一种产生具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白质的方法，特征在于它的步骤如下；(1)将编码具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白的重组细胞；(3)在适合表达人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白活性的多肽。
5.根据权利要求
4所述的人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白质的方法，其特征在于根据人AR-ACHE的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框引物，在正反引物上分别引入限制性内切酶位点，以扩增产物为模板，经PCR扩增后将人AR-ACHE基因在保证阅读框正确的前提下克隆至PGEX-2T载体。
6.一种包含SEQ ID No.1所示的cDNA序列的人乙酰胆碱酯酶异构体的应用，其特征在于根据SEQ ID No.1的cDNA序列表达的人AR-ACHE蛋白质，并利用此蛋白质产生的多克隆抗体和单克隆抗体，使用此多克隆或单克隆抗体可以特异性地和AR-ACHE结合，因此在与AR-ACHE产生有关的各种疾病中可以特异性地检测到此蛋白质的存在，亦可在疾病早期或愈后检测蛋白质的存在。
7.根据权利要求
6所述包含SEQ ID No.1所示cDNA序列的人乙酰胆碱酯酶异构体应用，其特征在于应用于提高人AR-ACHE的表达水平或抑制人AR-ACHE的过度表达。
8.根据权利要求
6所述包含SEQ ID No.1所示cDNA序列的人乙酰胆碱酯酶异构体应用，其特征在于利用AR-ACHE与该家族其他成员进行融合或交换片段，获得活性更高并具有新特性的蛋白。
专利摘要
本发明提供了一种人各种组织细胞发生凋亡时表达的新的人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR－ACHE)及基因编码序列。它的cDNA长度为1936bp,蛋白质由526个氨基酸残基组成。本发明还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法、在样品中检测人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR－AChE)核酸序列和多肽的方法以及用该蛋白质或基因促使细胞凋亡,或者用该基因反义核酸或抗体阻止细胞凋亡的方法。
文档编号C12N15/55GKCN1376798SQ01105781
公开日2002年10月30日 申请日期2001年3月23日
发明者张学军, 杨磊, 贺恒益 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan