专利名称：从哺乳类细胞中获得脑型乙酰胆碱酯酶的方法
技术领域：
本发明涉及从生物细胞中分离纯化酶的方法，尤其是关于从非神经、非红细胞源的哺乳类细胞中分离纯化脑型乙酰胆碱酯酶的方法。
乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，AChE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut H，et al.J-Clin-Invest.1990，86(3)900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches tocholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。乙酰胆碱酯酶以所在位置可分为神经肌肉型和红细胞型。按照分子结构可分为‘不同亚单位多聚体型’(heteromeric class)和‘相同亚单位多聚体型’(homomeric class)。不同亚单位多聚体型的催化亚单位与三螺旋胶原亚单位连接或与脂类连接。相同亚单位多聚体型又分为亲水性(hydrophilic)和亲脂性(glycophospholipid-linked)等亚型。红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶四聚体分子量约260KDa。乙酰胆碱酯酶的功能，在胆碱能神经系统是水解神经递质乙酰胆碱，使之生成胆碱和乙酸。也有报道认为乙酰胆碱酯酶具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性。近年来，由于体外培养的肿瘤细胞株也检测到AChE mRNA的转录和化疗后的卵巢癌患者的血清检测到乙酰胆碱酯酶活性，有作者认为乙酰胆碱酯酶与肿瘤发生有关(Lev-LehmanE，et al.Blood.1997，89(10)3644-53)。
目前世界上商品化的乙酰胆碱酯酶，主要从人红细胞，牛红细胞，血清和电鳐等放电鱼类的电器官分离得到的，没有人脑的乙酰胆碱酯酶，究其原因，就是很难获得人脑用以分离纯化乙酰胆碱酯酶，因此，就人脑乙酰胆碱酯酶而言，市场供应是空白。
乙酰胆碱酯酶是哺乳动物体内重要的酶，除了作为神经递质乙酰胆碱的水解酶之外，其它细胞表达的乙酰胆碱酯酶的功能和意义仍然不清楚，研究人类乙酰胆碱酯酶，必需要以人类细胞产生的酶为对象，因此，对该酶的需要量很大。以人脑为来源分离得到乙酰胆碱酯酶的途径是有限的。如果有一个来源广泛易得，简单可靠的方法得到这种酶，就为研究开了方便之门。
另外，研究证明老年性痴呆患者病灶处有大量的乙酰胆碱酯酶存在，而且，与神经递质降解功能无关，那么它的出现意义是什么？如何研究它们？还有，已经证明老年性痴呆患者病灶处有凋亡细胞存在，那么二者有什么关系？这些都不清楚。要得到大量人脑来源的乙酰胆碱酯酶又很困难。本发明人多年来一直致力于在这领域中从事研究工作，从凋亡细胞中分离到脑型乙酰胆碱酯酶，用这种酶替代从人脑分离纯化的乙酰胆碱酯酶，其意义十分重大。
本发明目的是提供从哺乳动物包括人类的细胞株，除了已知的神经和红细胞外，正常状态下并不表达乙酰胆碱酯酶的细胞经过诱导凋亡后得到乙酰胆碱酯酶的方法。
本发明是一种从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，是从哺乳动物包括人类的一切细胞株(神经细胞和红细胞除外)经过诱导细胞凋亡，使之表达乙酰胆碱酯酶，再经过裂解细胞，tacrine亲和柱层析分离纯化，获得脑型乙酰胆碱酯酶的方法。
本发明从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，在科学研究中是一个崭新创举。其原理是正常情况下不表达乙酰胆碱酯酶的细胞在细胞凋亡过程中表达脑型乙酰胆碱酯酶。因此，本方法首先是要获得凋亡细胞，然后收集经过诱导凋亡的细胞，分别抽提mRNA，DNA和蛋白质，可分别得到大量的乙酰胆碱酯酶AChE mRNA及其反转录RT-PCR产物、梯形DNA片断和有活性的乙酰胆碱酯酶。
本方法使用了非肿瘤细胞株和肿瘤细胞株，非肿瘤细胞株包括人肺成纤维细胞(HLF)、人脐静脉内皮细胞、小鼠内皮细胞(SIEC)、小鼠成纤维细胞株(NIH/3T3)、大鼠肝细胞株(BRL)、大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)。肿瘤细胞株包括HELA和PC-3、HL-60、M07e、HEL、DAMI等等。
诱导细胞凋亡可以采用多种方法，其中有物理(辐射)、化学(化疗药物)和生物(加或减细胞因子)方法和自然衰老法。自然衰老法最简单和廉价。
自然衰老法培养贴壁生长的细胞，如HLF和PC-3细胞株，3-4天不换培养液，这时，部分细胞失去贴壁能力，进入了凋亡过程，收集这时的悬浮细胞可得到大量的乙酰胆碱酯酶。如果是悬浮生长细胞，如HL-60在不换培养液的情况下，部分细胞开始凝聚成团，少数细胞已经到了凋亡后期(参见图4，出现DNA断裂)，呈现出棉絮状小球，收集这时的细胞也可得到大量的乙酰胆碱酯酶。
化疗药物诱导法用抗肿瘤药物柔红霉素加入到HELA细胞培养液中，一定时间后细胞大量凋亡，收集这时的细胞可得到大量乙酰胆碱酯酶。
去细胞因子诱导细胞凋亡方法对于细胞因子依赖的细胞株，如人M07e巨核细胞株，只要在培养液中不加入GM-CSF，2-3天后，大量细胞发生凋亡，收集这时的细胞可得到大量的乙酰胆碱酯酶。
辐射诱导细胞凋亡方法5Gyγ-射线照射培养的细胞，4小时后收集细胞可得到大量乙酰胆碱酯酶。
例如从凋亡HLF和凋亡HL-60细胞分别抽提DNA，进行琼脂糖电泳，可见200bp以上不同大小的DNA片断(图4)，证明这些细胞的确发生了凋亡，梯形DNA片断电泳图是目前鉴别细胞凋亡的最可靠的证据。从没有凋亡的细胞中检测不到AChE活性，而从凋亡细胞中检测出AChE活性，表明凋亡细胞能表达乙酰胆碱酯酶。
得到了含有乙酰胆碱酯酶的凋亡细胞，然后进行乙酰胆碱酯酶分离与鉴定。鉴定脑型乙酰胆碱酯酶可从两个层次进行，一是在转录水平，即用RT-PCR的方法，检测细胞是否AChE mRNA的转录。二是翻译后的蛋白质水平，即通过检测该酶的活性和分离到该酶。
人的乙酰胆碱酯酶在基因组中的全序列已经清楚，共10段，其中含有6个外显子(Extron)和4个内含子(Intron)，转录后有不同的剪切形式。常见的有三种，E1-E2-E3-E4-E6型(亲水型也即脑型或“突触型”)；E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型，也即红细胞型)和E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)。
1.转录水平检测PCR引物设计及RT-PCR步骤，PCR引物设计序列如下(1)1522(+)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTrGAACACCGTGCTTC-3’(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’引物1和引物2分别位于AChE基因的E3及E6内，用以检测脑型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以检测通读型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)；引物1和引物4用以检测红细胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型)。本实验中未检测到红细胞型和通读型。
RT-PCR步骤总RNA抽提后进行逆转录，步骤按照该试剂的操作程序。PCR扩增产物于1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测。例如从失去贴壁能力的凋亡PC-3细胞抽提mRNA，用RT-PCR方法可追踪到大量AChE mRNA的转录(图1)，而贴壁的生长状态良好的PC-3细胞则很难检测到AChE mRNA的转录，也检测不到乙酰胆碱酯酶的活性。引物如上所述，结果检测到的是脑型AChE mRNA(E1-E2-E3-E4-E6)。(该引物扩增的范围在AChE基因1522到2003之间，PCR产物应该是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型，也即红细胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)。
2.蛋白质水平检测，可用下列步骤检测蛋白质水平的乙酰胆碱酯酶的特征。
第一步裂解细胞参照《分子克隆》一书配制裂解液，将裂解液加入细胞中裂解细胞，1000g离心5分钟，去除未裂解的细胞碎片。
第二步tacrine亲和柱分离凋亡细胞的乙酰胆碱酯酶参照文献(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)。
第三步乙酰胆碱酯酶活性鉴定活性鉴定和活性抑制实验可在细胞水平和电泳凝胶上进行。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液。检测细胞或凝胶乙酰胆碱酯酶活性，使细胞在反应液中室温孵化4-12小时，如果有酶存在则出现黄褐色为阳性反应(见图2)。抑制实验是在反应液中加入乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂BW284c51(Sigma公司)。如果活性反应被抑制，证明该活性是由乙酰胆碱酯酶催化所至。
SDS-PAGE进行分子量鉴定测定分子量使用目前国际通用的SDS-PAGE电泳方法。图3就是SDS-PAGE电泳图，图中第5泳道是蛋白质分子量标记物，其中最大的一条带是牛血清白蛋白，分子量约67KDa，第4泳道是牛血清白蛋白(从Sigma公司购买)，第3泳道是人红细胞乙酰胆碱酯酶(从Sigma公司购买)，第2泳道是本发明人从DAMI细胞株分离得的乙酰胆碱酯酶及第1泳道是本发明人从PC-3细胞株分离得的乙酰胆碱酯酶，分子量都是66KDa，与人神经乙酰胆碱酯酶相似，是脑型乙酰胆碱酯酶。
综合上述内容，本发明人首次在国际上证明神经和红细胞以外的平时不表达乙酰胆碱酯酶的哺乳动物细胞在发生细胞凋亡时，表达乙酰胆碱酯酶的重要现象.证明1.哺乳动物，如人，小鼠和大鼠细胞，一旦发生了凋亡，均表达乙酰胆碱酯酶，而且都是脑型，说明其进化过程的保守性；2.肿瘤细胞株和原代培养的正常二倍体细胞，一旦发生了凋亡，就表达乙酰胆碱酯酶，说明乙酰胆碱酯酶的表达与肿瘤发生关系不大，而与细胞凋亡有关。有报道原发性肿瘤的组织活检的材料未见乙酰胆碱酯酶的表达(Karpel R，et al.Experimental CellResearch，210268-277，1994)和原发性肿瘤化疗前血清中检测不到乙酰胆碱酯酶活性以及治疗后多数患者血清中检测到乙酰胆碱酯酶活性增高(Zakut H，et al.Cancer61727-737，1988)，这两例报道对本发明的证明是一个很有力的支持。
本发明从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，可用作从凋亡细胞得到乙酰胆碱酯酶制备各种抗体用于商业。并在研究细胞凋亡与乙酰胆碱酯酶的表达有关的基础上，用抗乙酰胆碱酯酶的方法，治疗老年性痴呆症过程中的进行性细胞凋亡，可能有一定的意义。
本发明优点本发明从哺乳动物包括人类，除了已知的神经和红细胞外的一切细胞株，经过诱导凋亡后得到脑型乙酰胆碱酯酶，在世界上是首次的。人类的老年性痴呆患者脑组织中存在乙酰胆碱酯酶，从人脑得到乙酰胆碱酯酶很不容易。用本发明的方法，任何一个能进行细胞培养的实验条件，就有能力并能方便地分离到这种酶。
本发明通过以下的附图和实施例作进一步阐述，但不限止本发明的范围。
图1.是PC-3细胞的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
1 PCR标记(bp)1，543 994 695 515 377；2使用引物1和引物3的RT-PCR产物电泳图谱，证明产物不是通读型；3使用引物1和引物2的RT-PCR产物电泳图谱，PCR产物是482bp，证明凋亡过程中的PC-3转录的是脑型乙酰胆碱酯酶mRNA；4使用引物1和引物4的RT-PCR产物电泳图谱，证明产物不是红细胞型。
图2.从PC-3凋亡细胞中分离得到的乙酰胆碱酯酶活性反应带非变性PAGE电泳图。
图3.从PC-3和DAMI凋亡细胞分离得到的乙酰胆碱酯酶的SDS-PAGE电泳图。
1从PC-3凋亡细胞分离得到的乙酰胆碱酯酶，分子量66KDa；2从DAMI凋亡细胞分离得到的乙酰胆碱酯酶，分子量66KDa；3人红细胞乙酰胆碱酯酶，分子量66KDa；4牛血清白蛋白；5蛋白质分子量标记物，其中最大的一条带是牛血清白蛋白，分子量67KDa.
图4.HLF和HL-60细胞凋亡的DNA梯形片段琼脂糖电泳图。
1 123 DNA标记，(从Sigma公司购买)；2 人肺成纤维细胞株(HLF)，经过诱导后的凋亡细胞，显示DNA梯形片段；3 人白血病细胞株(HL-60)，经过诱导后的凋亡细胞，显示DNA梯形片段；4 人白血病细胞株(HL-60)，生长良好，无DNA梯形片段，证明没有发生细胞凋亡。
实施例1 从人前列腺癌细胞株(PC-3)获得乙酰胆碱酯酶(特点人，肿瘤，化疗药物诱导凋亡)培养人PC-3细胞，贴壁生长。培养液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。对照组不加诱导药物，诱导实验组加入2μM柔红霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小时后收集细胞。
鉴定脑型乙酰胆碱酯酶从两个层次进行，一是在转录水平，即用RT-PCR的方法，检测细胞是否AChE mRNA的转录。二是翻译后的蛋白质水平，即通过检测该酶的活性和分离到该酶。
1.转录水平PC-3细胞核酸抽提后，获得mRNA，反转录到达cDNA，以该cDNA为模板作PCR。PCR引物及RT-PCR步骤PCR引物设计序列如下(1)1522(+)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3’(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’引物1和引物2分别位于AChE基因的E3及E6内，用以检测脑型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以检测通读型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)；引物1和引物4用以检测红细胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型。本实验中未检测到红细胞型和通读型。
RT-PCR步骤总RNA抽提使用Boehringer，Mannheim公司的TripureTM分离试剂。cDNA合成使用Promega公司的随机六引物，逆转录使用Boehringer，Mannheim公司的ExpendTM逆转录酶，方法按照该试剂的操作程序。PCR扩增使用Perkin-Elmer公司的480扩增仪，条件如下变性，94℃，1分钟；退火65℃，1分钟；延伸，72℃，1分钟(最后一个循环5分钟)；循环数，39次。PCR扩增产物于1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测。
检测到凋亡细胞中有大量AChEmRNA，其剪切形式是E1-E2-E3-E4-E6型(亲水型也即脑型)见图1，(该引物扩增的范围在1522到2003之间，PCR产物应该是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型，也即红细胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)。
2.蛋白质水平检测第一步裂解细胞参照《分子克隆》一书配制裂解液(50mmol/Tris，Cl Ph8.0，150mmol/lNaCl，0.02μg叠氮钠，1μg/ml抑蛋白酶肽(Aprotinin)，1％曲通(Triton X-100)。将裂解液加入细胞中裂解细胞，1000g离心5分钟，去除未裂解的细胞碎片。
第二步tacrine亲和柱分离凋亡细胞的乙酰胆碱酯酶参照文献(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)，用环氧活化琼脂糖凝胶6B(Epoxy-activated Sepharose 6B)10g，“Sigma公司，E-6754”，和13g9-aminoacridine HCl，“Aldrich公司No.A3840-1”制备Tacrine亲和柱，首先用0.2M NaCl 50mMTris-HCl Ph8.0缓冲液平衡柱，样品放在平衡液中上样，流速0.3ml/分钟。洗脱用10mM Tacrine，50mMTris-HClPh8.0洗脱液，洗脱的乙酰胆碱酯酶，再用10mMTris-HCl Ph8.0透析，换透析液三次，透析24小时。冷冻干燥。
第三步乙酰胆碱酯酶活性鉴定参照文献(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)。
活性鉴定和活性抑制实验可在细胞水平和电泳凝胶上进行。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph6.0150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)。本实验中使用了Bio-RAD mini-PROTEIN II电泳仪，6％PAGE凝胶，取细胞裂解液，加入0.2％曲通X-100，进行非变性电泳，电压20伏，12小时，电泳后取出凝胶，放置在配制的乙酰胆碱酯酶底物反应液中反应4小时.结果有乙酰胆碱酯酶的地方出现黄褐色阳性带(图2)，而其它蛋白质则没有阳性反应。抑制实验是在反应液中加入10μMBW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。
SDS-PAGE进行分子量鉴定使用SDS-PAGE电泳方法测定分子量，证明从凋亡的PC-3细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa(图3中的第一泳道)，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例2从人脐静脉内皮细胞获得乙酰胆碱酯酶(特点人，非肿瘤，因子诱导凋亡)原代培养人脐静脉内皮细胞，贴壁生长。培养液M199(Gibco)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。对照组不加因子，诱导实验组加入5μg/ml TGF-β，18-20小时后收集细胞。
蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的人脐带内皮细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例3从人肺成纤维细胞获得乙酰胆碱酯酶(特点人，非肿瘤，自然衰老细胞凋亡)贴壁生长的人肺成纤维细胞，培养液RPMI1640(Gibco)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。不加因子，4天不换培养液，4天后收集细胞。
1.核酸水平检测同实施例1，凋亡细胞用RT-PCR可追踪到脑型AChEmRNA表达，而贴壁的正常细胞则无脑型AChE mRNA表达。2.蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的人肺成纤维细胞获得乙酰胆碱酯酶中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例4从人白血病细胞株(HL-60)获得乙酰胆碱酯酶(特点人，肿瘤，化疗药物诱导凋亡)悬浮培养人白血病细胞株(HL-60)，培养液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。对照组不加诱导药物，诱导实验组加入2μM柔红霉素(daunombicin，Italy)，18-20小时后收集细胞。
1.核酸水平检测同实施例1，凋亡细胞用RT-PCR可追踪到脑型AChEmRNA表达，而正常细胞则无脑型AChE mRNA表达。
2.蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的HL-60细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例5从人巨核细胞株(M07e)获得乙酰胆碱酯酶(特点人，肿瘤细胞，去细胞因子诱导凋亡)培养人M07e细胞，悬浮生长。培养液α-Medium，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。由于该细胞株是细胞因子GM-CSF依赖型的，因此对照组加GM-CSF 2.5ng/ml，诱导实验组不加入GM-CSF，18-20小时后收集细胞。
蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的M07e细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶.
实施例6从人巨核细胞株(DAMI)获得乙酰胆碱酯酶(特点人，肿瘤细胞，自然衰老细胞凋亡)培养人DAMI细胞，悬浮生长。培养液RPMI Medium 1640，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。4天不换培养液，4天后收集凋亡细胞。
蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的DAMI细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶.
实施例7从小鼠成纤维细胞株(NIH/3T3)获得乙酰胆碱酯酶(特点小鼠，非肿瘤，自然衰老细胞凋亡)贴壁生长的NIH/3T3细胞，培养液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。不加因子，3-4天不换培养液，第四天收集细胞。
蛋白质水平检测，所有步骤同实施例1，凋亡的细胞乙酰胆碱酯酶活性反应阳性。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的NIH/3T3细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例8从大鼠主动脉平滑肌细胞株获得乙酰胆碱酯酶(特点大鼠，非肿瘤，因子诱导凋亡)贴壁生长大鼠主动脉平滑肌细胞，培养液M199(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。对照组不加因子，诱导实验组加入5μg/ml TGF-β，18-20小时后收集细胞。
蛋白质水平检测，所有步骤同施例1。凋亡的大鼠主动脉平滑肌细胞中乙酰胆碱酯酶活性反应阳性。
SDS-PAGE电泳方法进行分子量鉴定，证明从凋亡的大鼠主动脉平滑肌细胞中分离的有活性的蛋白质是66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。
实施例9检测HLF凋亡细胞的实验HLF细胞的DNA抽提方法参见文献(Jaffrezou JP，et al.The EMBOJournal，152417-2424，1996)，正常及衰老的细胞(2-3×106)分别离心，沉淀用PBS洗涤，再离心后沉淀用40μl的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸(1928)重悬，室温放置60分钟。然后2000g离心30分钟，上清转入1.5mlEppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μlRNaseA(10mg/ml)，37℃温育60分钟，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃温育30分钟。反应完毕加入5μl加样缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳。见图4中的2，显示DNA片段呈梯形，这是细胞凋亡最可靠的证据。
实施例10检测HL-60凋亡细胞的实验HL-60细胞的DNA抽提方法参见文献(Jaffrezou JP，et al.The EMBOJournal，152417-2424，1996)，正常及衰老的细胞(2-3×106)分别离心，沉淀用PBS洗涤，再离心后沉淀用40μl的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸(192∶8)重悬，室温放置60分钟。然后2000g离心30分钟，上清转入1.5mlEppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μl RNaseA(10mg/ml)，37℃温育60分钟，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃温育30分钟。反应完毕加入5μl加样缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳。见图4中的3，显示DNA片段呈梯形，这是细胞凋亡最可靠的证据。
权利要求
1.一种从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于该法是从哺乳动物包括人类的一切细胞(除神经细胞和红细胞外)经过诱导细胞凋亡，使之表达乙酰胆碱酯酶，再经过裂解细胞，tacrine亲和柱层析，分离纯化得到乙酰胆碱酯酶。
2.如权利要求1所述的从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于所述诱导细胞凋亡可以采用自然衰老法、化疗药物诱导法、去细胞因子诱导法或辐射诱导法。
3.如权利要求1所述的从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于得到的乙酰胆碱酯酶是分子量66KDa的脑型乙酰胆碱酯酶。
全文摘要
本发明在世界上首次证明凋亡的哺乳细胞表达乙酰胆碱酯酶,提出从哺乳动物的一切细胞(除神经细胞和红细胞外),经过诱导细胞凋亡,使之表达乙酰胆碱酯酶,再经过裂解细胞,tacrine亲和柱层析,分离纯化获得纯度较高的分子量66KDa的脑型乙酰胆碱酯酶的方法。
文档编号C12N5/00GK1186117SQ9712521
公开日1998年7月1日 申请日期1997年12月30日 优先权日1997年12月30日
发明者张学军, 赵倩, 贺恒益, 莫彤惟, 郭礼和 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所