重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和用于农药残留检测方法

专利名称：重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和用于农药残留检测方法
技术领域：
本发明涉及一种农药技术领域的重组酶及其制备方法和检测方法，具体涉及一种重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和用于农药残留检测方法。
背景技术：
我国是世界上农业生产和使用大国，目前我国现有农药生产定点企业2500多家，现已登记并可以生产的农药品种有600多个。我国农药生产能力约为76万吨，总产量约为48万吨，农药年生产量仅次于美国而排名第二。同时，我国是世界上农药施用量最大的国家，平均年施用量超过130万吨，单位面积用量是世界平均水平的2倍。
目前我国农药产品结构不合理，产品质量低，存在3个70％(1)是在各类农药产量中，杀虫剂占70％；(2)是杀虫剂中有机磷农药占70％；(3)是有机磷农药中高毒品种占70％。这些剧毒、高毒农药的大量使用给生态环境带来了日益突出的负面影响，并严重威胁着消费者的身体健康和生命安全。在《中国环境优先监测》报告中列出的一份有机污染物“黑名单”中，有机磷农药就占有7种。
随着人类生活水平和质量的大幅度提高，人们在吃饱的基础上对农产品及其加工食品的质量提出了更高的要求，特别是对农产品中的农药残留问题格外关注和重视。农产品中的农药残留超标可造成消费者急性中毒，出现头晕、呕吐等症状。长期食用农药残留超标的农产品或加工食品，会对消费者的身体造成慢性危害，并可能引发多种慢性疾病，如肿瘤、生育能力降低等。
农药残留超标带来的食品安全问题不仅影响到消费者的健康，还很大程度上影响了我国农产品出口贸易，进而影响到整个农业的发展。近年来，我国农产品因农药残留超标而被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和中止合同的事件时有发生。如2002年上海出口到韩国的紫菘因农药残留超标问题而遭到退货，造成直接经济损失达500多万元。一些国家更是利用国际贸易技术壁垒，人为地对我国农产品出口设置障碍。
如何快速、灵敏、准确地检测出农产品及其加工产品中的残留农药，是保障人民健康、控制农产品质量的关键环节。基于乙酰胆碱酯酶(AChE)受抑制原理的有机磷与氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法在我国应用范围广泛。作为国家技术标准与农业行业标准，快速检测法在我国农药残留检测工作发挥了一定的作用。但是目前我国用于农药检测的乙酰胆碱酯酶商品普遍存在敏感性低与稳定性差等不足，很大程度上限制了快速检测技术的发展，并影响农药残留检测单位的工作效率。获得高活性、稳定性强的乙酰胆碱酯酶在农药残留快速检测中十分重要。
自上世纪90年代起，多种来源(包括线虫、果蝇、电鳗、鼠类、人等)的乙酰胆碱酯酶基因在昆虫细胞、爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞甚至植物株系中成功获得了表达(Estrada-Mondaca，S.and Fournier，D.，1997；Morel，N.and Massoulie，J.，1997；Mor and Tsafrir，S.，2004；Simon，S.，1997；Tosado-AChEvedo，R.and Selkirk，M.E.，1998)。美国已有多项关于人源性AChE重组表达的专利报道(US Patent No.5248604；5595903；6770799)。研究者利用这些重组蛋白注射老鼠、豚鼠和灵长类，证明其在有机磷中毒事件中取得了良好的预防与治疗效果。除了为医疗提供新型药剂外，基因工程酶亦可在农药残留检测方面大显身手。在发达国家，为使农药残留检测易于在田间、农贸市场和家庭中进行，结合有乙酰胆碱酯酶的生物传感器已成为主要的快速检测工具，发明者也为它申请了专利保护(US Patent No.6406876)。在众多生物来源的乙酰胆碱酯酶当中，果蝇的乙酰胆碱酯酶发生磷酸化与甲氨酰化的速度相对较高，也就是说，它对有机磷和氨基甲酸酯类农药最为敏感。通过点突变技术及异源基因表达技术，酶在昆虫sf9细胞中获得表达，其对敌敌畏的敏感性比天然酶高300倍，而比电鳗的乙酰胆碱酯酶高288000倍(Estrada-Mondaca，S.and Fournier，D.，2002)，此外，基因工程酶对其它有机磷和氨基甲酸酯农药的敏感度也有不同程度的提高，可为农药残留快速检测提供优良的生物材料。
近十多年来，我国在酶抑制检测方法的研究方面取得了一些成果，国内一些企业已开发出了相应的试剂盒、速测卡和速测仪。目前采用的酶原料主要有两类，一是进口的乙酰胆碱酯酶纯酶制剂，如电鳗和牛血清来源的酶，价格普遍较高，而对有机磷及氨基甲酸酯类农药缺乏普遍敏感性；第二类是提取自昆虫的酶，首先以遗传育种法获得对农药敏感的家蝇，再提取其头部的AChE蛋白。该类酶产品的纯度及稳定性不尽如人意，影响了检测结果的重复性。目前重组乙酰胆碱酯酶在我国国内农药残留快速检测领域的应用还未见报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和用于农药残留检测方法。使其可通过简单发酵培养、分离纯化、大批量生产，其对我国主要施用有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感度超过现有同类产品10-100倍，为快速检测农药残留提供了优良的基因工程酶，为农残快速检测产品提供优质酶原材料。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及的重组乙酰胆碱酯酶，溶解于50mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液中4℃下保存22天具有75％的初始酶活；酶的米氏常数值为17.1±1.0μM；底物过量抑制常数Kss值为50.9±2.8mM；对敌敌畏、氧化乐果、对氧磷、甲基对氧磷、涕灭威、西维因、克百威、抗蚜威的抑制常数分别为4.4E6、2.2E4、1.1E6、4.2E5、4.8E4、5.9E5、5.1E6、2.3E5。
本发明涉及的重组乙酰胆碱酯酶的制备方法，具体包括以下步骤①通过基因克隆获得果蝇ACE蛋白核苷酸基因序列，将其构建在甲醇酵母表达载体上，再利用电转化技术筛选获得高活性的培养物，于25mL BMGY液中，振荡培养；②24小时后离心收集培养物，用250mL BMMY液悬浮，振荡培养；③每24小时向培养液中加入1250uL甲醇；④144小时后离心收集上清，上清用0.22μm滤膜过滤；⑤在冰上在40％-80％的磷酸铵浓度下沉淀蛋白，离心收集沉淀，沉淀用24mL含有1mM的EDTA亲和柱上样缓冲液重悬；⑥2mL Procainamide-Sepharose4B亲和柱用20mL上样缓冲液平衡，以0.25mL/min流速上样，以20mL含有1mM的EDTA以及0.2M的NaCl低盐缓冲液淋洗，以20mL含有1mM的EDTA以及1M的NaCl高盐缓冲液洗脱；⑦在4℃搅拌下0.1M Tris，pH 7.4透析液透析24小时；⑧透析后冷冻干燥成粉，获得重组乙酰胆碱酯酶，在-20℃下保存。
本发明涉及的重组乙酰胆碱酯酶用于农药残留检测方法，具体包括以下步骤1)检测试剂准备在A、B、C三个试剂瓶中加入缓冲溶液10mL，其中A为冻干乙酰胆碱酯酶；B为冻干显色剂(DTNB)；C为冻干底物(硫代丁酰胆碱)；待完全溶解，摇匀即可。注意复溶后试剂需在4℃冰箱中保存，保存期2周。
2)样品处理将十一种农药标准品以丙酮溶解成系列浓度梯度喷洒于4g被剪成1cm2左右的五种蔬果(生菜、菠菜、卷心菜、青椒、茄子)表面。待丙酮自然挥发后，加入20mL 0.25mM的磷酸钠溶液(pH 8.0)超声振荡(10min)，取4mL样品提取液于5mL离心管中离心(室温，3000rpm，3min)，收集上清2.4mL。另准备一试管，加入2.5mL缓冲液，作为空白管。在空白管和样品管中各加入A液和B液0.1mL，混匀，在37℃恒温水浴箱中放置15分钟以上。
3)样品检测测试空白在空白管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值ΔA0，作为空白。
测试样本在样本管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值ΔAt。
结果计算抑制率(％)＝[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100％。
本发明中所述具有可用于农残快速检测的重组乙酰胆碱酯酶是首先通过基因克隆获得果蝇ACE蛋白核苷酸基因序列，将其构建在酵母表达载体上，再利用电转化技术获得高活性的培养物，使其在酵母细胞中得到高效表达，并在甲醇诱导下表达后分泌到培养液中，然后通过硫酸铵分部沉淀、亲和层析纯化得到乙酰胆碱酯酶，最后用Native-PAGE染色验证其活性。进而系统分析纯化后重组乙酰胆碱酯酶的各种生化常数，主要包括米氏常数Km、底物过量抑制常数Kss、抑制常数Ki；通过乙酰胆碱酯酶在磷酸钠缓冲中活性的变化，确定在不同温度下，本发明中所述重组酶的稳定性。通过乙酰胆碱酯酶抑制法对农药标准品、蔬菜加标样品以及实际蔬菜样品的检测，并利用气相色谱法测试验证，确定本发明中重组乙酰胆碱酯酶在农残快速检测中的实际效果。
以下对本发明进一步说明1.甲醇酵母表达系统—诱导表达外源蛋白甲醇酵母体内，AOX1基因编码产生醇氧化酶(简称AOX)，这是甲醇代谢途径的关键酶。其中，AOX1基因启动子专一性受甲醇诱导，产生的AOX可达细胞可溶性蛋白的30％，含量很高，这使得甲醇酵母能在以甲醇为碳源的培养基中快速生长。AOX1启动子后接外源基因时，外源基因在甲醇以外的碳源(如葡萄糖、甘油或乙醇)中处于非表达状态，当在培养液中加入甲醇后，即被诱导表达。
2.Ellman法测定AChE酶活性AChE可水解乙酰硫代胆碱，生成硫代胆碱和乙酸盐。硫代胆碱还原二硫二硝基苯甲酸形成硝基苯甲酸盐，这种黄色物质在405nm具吸收峰值。这是AChE活性测定的通用方法，有机磷或氨基甲酸酯抑制了AChE活性，其抑制程度也可根据该方法计算出。1个酶活性单位(1U)定义为25℃，1min内水解1nmol底物需要的酶量。
3.Native-PAGE染色对重组乙酰胆碱酯酶进行非变性电泳后，将胶浸入含有酶底物—乙酰硫代胆碱的染色液使具有乙酰胆碱酯酶活性的条带显色。
4.重组酶的各种生化特性(1)米氏常数Km米氏常数即为反应速度达到最大反应速度一半时的作用物浓度。它是酶的特征性常数，表示酶与作用物的亲和力大小。Km越大，酶与作用物的亲和力越小。这个常数可以通过反应速度及作用物浓度的双倒数作图获得。
(2)底物过量抑制常数Kss酶在过量底物的环境中，酶活性会受到过高的底物浓度的抑制。
(3)抑制常数Ki酶抑制剂分为两类不可逆抑制剂与可逆性抑制剂。有机磷及氨基甲酸酯类农药被认为是AChE的不可逆抑制剂，它们使AChE活性中心的丝氨酸发生磷酸化或甲氨酰化。
(4)酶在缓冲溶液中的稳定性根据国家标准(GB/T 5009.199-2003)中规定，用于农药快速检测的胆碱酯酶的活性需要稳定保持4天。
5.乙酰胆碱酯酶抑制法酶抑制法其原理是乙酰胆碱酯酶的活性受有机磷类或氨基甲酸酯农药抑制，根据乙酰胆碱酯酶受抑制程度(抑制率)的多少来判定有机磷类或氨基甲酸酯农药的含量。用该方法检测农药残留时，蔬菜中的水份、碳水化合物、蛋白质、脂等物质不会对检测造成干扰，可省却分离去杂步骤，从而达到快速检测的目的。
本发明通过简单的发酵工艺使上海交通大学生命科学技术学院生物安全实验室通过基因克隆技术获得的AChE高表达的培养物在甲醇的诱导下，将重组果蝇AChE分泌到培养液中，而后运用40％-80％分部硫酸铵沉淀并结合抑制剂-Procainamide亲和层析的方法，获得了活性为0.307U/mg的重组果蝇AChE酶蛋白。
该酶具有以下几个特性(1)溶解于50mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液中4℃下保存22天仍具有75％的有效初始酶活；(2)酶的米氏常数值为17.1±1.0μM，与天然果蝇乙酰胆碱酯酶米氏常数(17.0±3μM)非常接近；(3)底物过量抑制常数Kss值为50.9±2.8mM。(4)相比国内外同类酶，本发明中得到的重组果蝇AChE具有更高的抑制常数Ki(如表1)，因此具有更高的灵敏度并且在实际样品的快速检测中显示较好的灵敏度(如表2)和出良好的检出率(如表3)。具体地，该酶可以检测出浓度在0.1～1ug/L之间的农药品种有敌敌畏、甲胺磷、克百威、灭线磷、甲基嘧啶磷、甲萘威、异丙威；浓度在1～2.5mg/L之间的农药品种有乐果、杀扑磷、氧化乐果；其它均在0.1～1mg/L之间；在生菜、鸡毛菜、米苋、茄子、青椒中分别添加16种农药标准品，配制浓度在0.1～1.5mg/L之间，试验结果表明除极少数样品呈阴性其余均呈阳性，其中敌敌畏、克百威等农药酶抑制效果显著，检出限均可达到0.01mg/kg；因此，该重组酶可以用于酶抑制法的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留快速检测。此外，还可以用于农药残留检测生物传感器、速测卡的研制和生产。
表1重组乙酰胆碱酯酶与其它来源AChE的抑制常数

表2.重组乙酰胆碱酯酶检测加标蔬菜样品



表3重组乙酰胆碱酯酶和GC法对实际蔬菜样品的检测



图1.本发明流程示意图。
图2.Native-PAGE分析乙酰胆碱酯酶活性。A.果蝇乙酰胆碱酯酶重组酶B.电鳗乙酰胆碱酯酶。
图3.溶解于50mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液中的重组乙酰胆碱酯酶分别保存在4℃(A)和25℃(B)时的稳定性分析图4.底物浓度[s]-反应速率v曲线与双倒数(1/[s]-1/v)曲线具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施方式作出详细具体的描述1.实验材料1.1甲醇酵母表达载体用于获得高活性分泌培养物的高表达甲醇酵母载体为pPIC9K，由上海交通大学生命科学技术学院生物安全实验室提供。
1.2试剂YNB购自上海普飞生物技术公司；Ellman试剂成分(AChEtylthiocholine iodide，DTNB)以及电鳗乙酰胆碱酯酶均购自美国Sigma公司；十一种农药标准品购自上海农药研究所；甲醇、各种氨基酸等生化试剂均为国产分析纯或进口分装。
2.操作过程2.1诱导甲醇酵母表达AChE蛋白首先利用位于AChE cDNA起始密码子端的正向引物及终止密码子端的反向引物，通过RT-PCR从果蝇中分离出AChE基因，进而获得了含改造后AChE基因的pPIC9K-AChE质粒；通过电转化筛选获得高表达的培养物；然后将其在MD平板上28℃培养48h。从上述MD平板上挑取培养物于25mL BMGY培养基中，于用两层牛皮纸封口的150mL三角瓶中振荡培养(28℃，200rpm以上)至OD600＝5(约24h)。取1mL上述培养液离心(8000rpm，5min)，弃上清，用1mL无菌水重悬细胞沉淀，以无菌水为空白管测定上述无菌水重悬液的OD600值，确定OD600值是否为5；如果OD600值低于标准则继续振荡培养。达到OD600＝5的标准后，将含培养物的25mL BMGY离心(4℃，7000rpm，10min)，弃取上清，用250mL BMMY培养基重悬细胞沉淀后在用两层牛皮纸封口的500mL三角瓶中振荡培养(28℃，200rpm以上)；每24h向培养液中加入1.25mL甲醇(总体积的0.5％)。144h后将上述BMMY培养液离心(4℃，13000rpm，10min)，收集上清。
2.2AChE粗酶液的获得将上步中收集的上清用0.22μm的滤膜过滤上清以除去残留的酵母细胞。在4℃冰浴搅拌下，向滤液中缓慢加入在-70℃预冷的无水硫酸铵至质量体积比40％，离心(4℃，13000rpm，10min)，收集上清。在4℃冰浴搅拌下，向上清中继续加入在-70℃预冷的无水硫酸铵至质量体积比80％，离心(4℃，13000rpm，10min)，弃去上清，用Tris缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬沉淀，获得AChE粗酶液。
2.3AChE蛋白的亲和纯化用20mL上样缓冲液(20mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA)以1mL/min的速度平衡柱体积为2mL Procainamide-Sepharose4B亲和柱。将粗酶粉溶解于上样缓冲液中，使每mL溶液中含有大约2000U，以0.25mL/min上样。用20mL上样缓冲液以0.5mL/min流速淋洗；后用20mL样品淋洗液(20mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA以及0.2M的NaCl)以1mL/min流速淋洗。用样品洗脱液(20mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA以及1M的NaCl)以1mL/min的流速将AChE从亲和柱中洗脱。在4℃搅拌条件下，用透析液透析洗脱液24h。将透析后的洗脱液冷冻干燥为AChE酶粉，于-20℃保存。
2.4Native-PAGE鉴定纯化后AChE蛋白按照《分子克隆指南》(第三版)配制聚丙烯酰胺凝胶(分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为4％)。使用Tris-Glycine，pH 8.0作为电泳缓冲液，在4℃下电泳分离R-DmAChE；电泳结束，用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)漂洗凝胶一次；然后将凝胶浸入50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)，25℃保温15min；倒去缓冲液，加入适量的染色液(1mM ATChI，5mM柠檬酸钠，3mM硫酸铜，0.5mM铁氰化钾，0.1M磷酸钠缓冲液，pH 8.0)，25℃温育，观察目的条带；待条带充分显色后，用0.1M Tris-HCl(pH 8.6)漂洗凝胶，保存在同一溶液中，4℃存放。
2.5AChE蛋白的稳定性将亲和纯化后的AChE蛋白溶解于50mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液中，分为同等的两份一份储存于4℃；另一份储存于25℃。每天用Ellman法测定其残余活性并与初始活性相比较，持续进行22天。
2.6计算重组AChE蛋白的米氏常数Km将六个浓度(0.05，0.1，1，5，10，50mM)的AsCh，分别与五个浓度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，25℃，测定酶的反应速度，计算得Km值。
2.7底物过量抑制常数Kss测定底物浓度在2.5μM-125mM的范围内。在25℃下，将100μl的底物、100μl的DTNB(2.5mM)与50μl的重组AChE蛋白(约5U)混合，测定1min内412nm吸光值得变化。根据朗伯-比耳定律，计算酶反应速率(v)；再根据Haldane方程v＝Vmax/(1+Km/[s]+Kss×[s])计算得到底物过量抑制常数Kss值。
2.8不同农药标准品对AChE抑制常数Ki的测定将九种不同浓度(10-6，10-8，10-10M)的抑制剂与五个不同浓度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，分别在两者反应的第15sec、1min、3min、5min，10min、15min、20min、30min时收集等量混合液，25℃，以1mM AsCh测定其残余酶的浓度，最后计算Ki值。
2.9重组AChE酶抑制法快速检测多种实际样品(1)检测试剂准备在A、B、C三个试剂瓶中加入缓冲溶液10mL，其中A为冻干乙酰胆碱酯酶；B为冻干显色剂(DTNB)；C为冻干底物(硫代丁酰胆碱)；待完全溶解，摇匀即可。注意复溶后试剂需在4℃冰箱中保存，保存期2周。
(2)样品处理将十一种农药标准品以丙酮溶解成系列浓度梯度喷洒于4g被剪成1cm2左右的五种蔬果(生菜、菠菜、卷心菜、青椒、茄子)表面。待丙酮自然挥发后，加入20mL 0.25mM的磷酸钠溶液(pH 8.0)超声振荡(10min)，取4mL样品提取液于5mL离心管中离心(室温，3000rpm，3min)，收集上清2.5mL。另准备一试管，加入2.5mL缓冲液，作为空白管。在空白管和样品管中各加入A液和B液0.1mL，混匀，在37℃恒温水浴箱中放置15分钟以上。
3.样品检测测试空白在空白管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值ΔA0，作为空白。
测试样本在样本管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值ΔAt。
结果计算抑制率(％)＝[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100％根据上述实验条件和具体技术进一步结合具体实施阐述本发明。这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量敌敌畏的抑制1.溶液、试剂(1)BMGY溶液在700mL水中溶解10g酵母提取物与20g蛋白胨，高压灭菌(20min)；溶液温度降至室温后，分别加入100mL磷酸钾缓冲液(1M，pH 6.0)、100mL10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×GY；溶液在4℃的保质期为两个月。
(2)BMMY溶液将BMGY溶液中的10×GY换为10×M，其余成分不变。溶液在4℃的保质期为两个月。
(3)敌敌畏溶液称量0.11g敌敌畏(MW＝220.98)晶体，溶于5mL丙酮中，此时敌敌畏浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
(4)Ellman试剂称量0.426g Na2HPO4(MW＝142)溶于30mL水中，调节pH＝7.0，配制成100mM磷酸钠溶液；称量0.0396g DTNB溶于10mL Na2HPO4溶液中，加入15mgNaHCO3，混匀后，用铝箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用时间不超过一天；称量0.0217g ACThI，溶于1mL水中，用铝箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用时间不超过一天。按15mL∶500μl∶200μl混合磷酸钠溶液、DTNB与ACThI溶液，即得Ellman试剂。
2.操作步骤(1)挑取分泌AChE的培养物，加入25mL BMGY液中，振荡培养(28℃，200rpm)。
(2)18h后，离心(室温，5000rpm，5min)，收集培养物，倒去上清，用50mL BMMY液悬浮培养物，用两层纱布封住三角瓶瓶口，振荡培养(28℃，250rpm)。每隔24h，向培养液中加入甲醇，终浓度为0.5％。在第144h，收集培养物，离心(4℃，12000rpm，10min)，将上清(45mL)转移至无菌三角瓶中，置于冰上。
(3)将上步中收集的上清用0.22μm的滤膜过滤上清以除去残留的酵母细胞。在4℃冰浴搅拌下，向滤液中缓慢加入在-70℃预冷的无水硫酸铵至质量体积比40％，离心(4℃，13000rpm，10min)，收集上清。在4℃冰浴搅拌下，向上清中继续加入在-70℃预冷的无水硫酸铵至质量体积比80％，离心(4℃，13000rpm，10min)，弃去上清，用Tris缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬沉淀，获得AChE粗酶液。
(4)用20mL上样缓冲液(20mMpH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA)以1mL/min的速度平衡柱体积为2mL Procainamide-Sepharose4B亲和柱。将粗酶粉溶解于上样缓冲液中，使每mL溶液中含有大约2000U，以0.25mL/min上样。用20mL上样缓冲液以0.5mL/min流速淋洗；后用20mL样品淋洗液(20mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA以及0.2M的NaCl)以1mL/min流速淋洗。用样品洗脱液(20mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA以及1M的NaCl)以1mL/min的流速将AChE从亲和柱中洗脱。在4℃搅拌条件下，用透析液透析洗脱液24h。将透析后的洗脱液冷冻干燥为AChE酶粉，于-20℃保存。
(5)将上述酶粉用0.25mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液溶解，用Ellman法确定溶液中的酶活大约为1U/μl。
(6)用丙酮溶解敌敌畏晶体，配制成浓度为10-5、10-6、10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的酶标板孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。
(7)按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受敌敌畏抑制的抑制率。其中，R1代表抑制率，ΔA0代表活性未受抑制的酶引起的吸光度变化值，ΔA代表酶受抑制后引起的吸光度变化值。
结果表明，低浓度的敌敌畏对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表4所示。
表4甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受敌敌畏抑制的抑制率(％)

实施例2——酵母表达的重组AChE蛋白的活性受微量毒死蜱的抑制1.溶液(1)毒死蜱溶液称量0.175g毒死蜱(MW＝350.6)晶体，溶于5mL丙酮中，此时毒死蜱浓度为0.1M。以10的倍数逐级稀释溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤操作与实施例1基本相同。用丙酮溶解毒死蜱晶体，配制成浓度为10-5、10-6、10-7M的溶液。分别取3μl与50μl的粗酶液混合，温育(25℃，15min)。同时设置对照组，由3μl丙酮与50μl的粗酶液混合而成。将混合液加入盛有250μl Ellman试剂的酶标板孔中，轻轻摇动以混匀，立即用酶标仪测定405nm处3min内样品的吸光度变化值，记为ΔA，ΔA0(对照组)，分别测定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0计算酶受毒死蜱抑制的抑制率。
结果表明，低浓度的毒死蜱对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表5所示。
表5甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受毒死蜱抑制的抑制率(％)

实施例3——-重组AChE蛋白检测菠菜中克百威1.溶液(1)克百威溶液将100mg/L的克百威标准溶液用丙酮稀释至0.5、0.25、0.05mg/L。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤将4g菠菜用剪刀剪成大约1cm2大小的小片至于烧杯中，加入某一浓度的克百威溶液4mL，待溶液中的溶剂—丙酮完全挥发后，加入20mL 0.25mM的磷酸钠溶液(pH 8.0)超声振荡(10min)，取4mL样品提取液于5mL离心管中离心(室温，3000rpm，3min)，收集上清2.4mL。在2.4mL上清中加入40μ1的酶液(约30U)于25℃水浴15min后，将混合液转移至比色皿中，加入100μ1的Ellman试剂(2.5mM)后立即放入分光光度计中，读取412nm的吸光值A0，3min后再次读取此处的吸光值A1，计算初始3min的吸光度表化值ΔA＝A1-A0，对比阴性对照溶液初始3min的吸光度变化值ΔA0。分别测三次，取平均值，根据如下公式计算菠菜样品中克百威对AChE酶的抑制率抑制率(％)＝[(ΔAn-ΔA)/ΔAn]×100其中ΔAn——阴性对照溶液测试初始3min的吸光度变化值；ΔA——样品溶液测试初始3min的吸光值的变化值。
结果表明，在实际样品—菠菜中低浓度的克百威对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表6所示。
表6甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受菠菜中克百威抑制的抑制率(％)

实施例4——-重组AChE蛋白检测青椒中甲基嘧啶磷
1.溶液(1)甲基嘧啶磷溶液将100mg/L的甲基嘧啶磷标准溶液用丙酮稀释至0.5、0.25、0.05mg/L。
其余溶液、试剂配方同实施例1。
2.操作步骤将4g青椒用剪刀剪成大约1cm2大小的小片至于烧杯中，加入某一浓度的甲基嘧啶磷溶液4mL，待溶液中的溶剂—丙酮完全挥发后，加入20mL 0.25mM的磷酸钠溶液(pH 8.0)超声振荡(10min)，取4mL样品提取液于5mL离心管中离心(室温，3000rpm，3min)，收集上清2.4mL。在2.4mL上清中加入40μl的酶液(约30U)于25℃水浴15min后，将混合液转移至比色皿中，加入100μl的Ellman试剂(2.5mM)后立即放入分光光度计中，读取412nm的吸光值A0，3min后再次读取此处的吸光值A1，计算初始3min的吸光度表化值ΔA＝A1-A0，对比阴性对照溶液初始3min的吸光度变化值ΔAn。分别测三次，取平均值，根据如下公式计算青椒样品中甲基嘧啶磷对AChE酶的抑制率抑制率(％)＝[(ΔAn-ΔA)/ΔAn]×100其中ΔAn——阴性对照溶液测试初始3min的吸光度变化值；ΔA——样品溶液测试初始3min的吸光值的变化值。
结果表明，在实际样品—青椒中低浓度的甲基嘧啶磷对AChE蛋白有明显的抑制效果，如表7所示。
表7甲醇酵母表达的重组AChE蛋白受菠菜中克百威抑制的抑制率(％)

权利要求
1.一种重组乙酰胆碱酯酶，其特征在于溶解磷酸钠缓冲液中，4℃下保存22天，具有75％的初始酶活，对敌敌畏、氧化乐果、对氧磷、甲基对氧磷、涕灭威、西维因、克百威、抗蚜威的抑制常数分别为4.4E6、2.2E4、1.1E6、4.2E5、4.8E4、5.9E5、5.1E6、2.3E5。
2.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶，其特征是，所述的磷酸钠缓冲液，其50mM pH8.0。
3.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶，其特征是，所述的酶，其米氏常数值为17.1±1.0μM；其底物过量抑制常数Kss值为50.9±2.8mM。
4.一种如权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤①通过基因克隆获得果蝇ACE蛋白核苷酸基因序列，将其构建在甲醇酵母表达载体上，再利用电转化技术筛选获得培养物，于25mL BMGY液中，振荡培养；②24小时后离心收集培养物，用250mL BMMY液悬浮，振荡培养；③每24小时向培养液中加入1250uL甲醇；④144小时后离心收集上清，上清用0.22μm滤膜过滤；⑤在冰上在40％-80％的磷酸铵浓度下沉淀蛋白，离心收集沉淀，沉淀用24mL含有1mM的EDTA亲和柱上样缓冲液重悬；⑥2mL Procainamide-Sepharose4B亲和柱用20mL上样缓冲液平衡，以0.25mL/min流速上样，以20mL含有1mM的EDTA以及0.2M的NaCl低盐缓冲液淋洗，以20mL含有1mM的EDTA以及1M的NaCl高盐缓冲液洗脱；⑦在4℃搅拌下0.1M Tris，pH7.4透析液透析24小时；⑧透析后冷冻干燥成粉，获得重组乙酰胆碱酯酶，在-20℃下保存。
5.根据权利要求4所述的重组乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征是，所述的振荡培养，是指在28℃，200rpm的条件下振荡培养。
6.根据权利要求4所述的重组乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征是，所述的亲和柱上样缓冲液，是指在20mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，含有1mM的EDTA条件下。
7.根据权利要求4所述的重组乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征是，所述的离心，步骤②中的离心是指在4℃，7000rpm，10min条件下离心；步骤④中的离心是指在4℃，13000rpm，10min条件下离心；步骤⑤中的离心是指在4℃，13000rpm，10min条件下离心。
8.一种如权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶用于农药残留检测方法，其特征在于具体包括以下步骤1)检测试剂准备在A、B、C三个试剂瓶中加入缓冲溶液10mL，其中A为冻干乙酰胆碱酯酶；B为DTNB冻干显色剂；C为硫代丁酰胆碱冻干底物；2)样品处理将十一种农药标准品以丙酮溶解成系列浓度梯度喷洒于4g被剪成1cm2左右的生菜、菠菜、卷心菜、青椒、茄子五种蔬果表面，待丙酮自然挥发后，加入20mL 0.25mM的磷酸钠溶液超声振荡10min，取4mL样品提取液于5mL离心管中离心收集上清2.4mL，2.5mL缓冲液加入一试管，作为空白管，在空白管和样品管中各加入A液和B液0.1mL，混匀，在37℃恒温水浴箱中放置15分钟以上；
3)样品检测测试空白在空白管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值ΔA0，作为空白，测试样本在样本管中加入C液0.1mL，摇匀，立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值Δat，结果计算抑制率(％)＝[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100％。
9.根据权利要求8所述的重组乙酰胆碱酯酶用于农药残留检测方法，其特征是，所述的步骤2)样品处理中的离心，是指在室温、3000rpm、3min的条件下。
全文摘要
本发明涉及一种农药技术领域的重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和检测方法。重组乙酰胆碱酯酶是溶解磷酸钠缓冲液中，4℃下保存22天，具有75％的初始酶活，对敌敌畏、氧化乐果、对氧磷、甲基对氧磷、涕灭威、西维因、克百威、抗蚜威的抑制常数分别为4.4E6、2.2E4、1.1E6、4.2E5、4.8E4、5.9E5、5.1E6、2.3E5。通过选种、振荡培养、离心、过滤、沉淀、淋洗、搅拌、透析、冷冻干燥成粉，获得重组乙酰胆碱酯酶，在－20℃下保存。检测方法通过试剂准备、样品处理、样品检测，进一步测试空白，测试样本，最后结果计算抑制率(％)＝[(ΔA
文档编号C12Q1/44GK1888059SQ20061002888
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者张大兵, 武爱波, 许诵辞, 陈浩德 申请人:上海交通大学