专利名称：Pcr扩增引物,及试剂盒和在哺乳动物性别鉴别上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于一种PCR的检测方法及试剂盒及引物。
背景技术：
聚合酶链反应(Polymerarse Chain Reaction)简称PCR，又称体外扩增技术，是1985年美国Cetus公司人类遗传部、加利福尼亚大学和Howghes医学院等联合创建的一项体外酶促扩增DNA新技术，具有特异性强，敏感性高，操作简便，快速高效等特点。PCR技术问世后，立即引起广泛的兴趣与重视，很快在全世界范围内得到广泛的应用和发展，迅速进入遗传性疾病的基因诊断、传染病原体的检测、法医学、考古学和分子生物学的各个领域。
PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步①变性(denaturation)通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火(annealling)当温度突然和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；③延伸(extension)在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到2×106~7拷贝。
性别决定区Y基因(SRY)的发现将动物的性别控制及胚胎性别鉴定技术引入了一个新阶段。由于SRY是雄性高度特异性因子，是判断性别最可靠的依据，为胚胎性别鉴定提供了准确无误的技术途径，与PCR扩增技术相结合，可以应用于早期胚胎性别鉴定。由于Sry基因在哺乳动物中高度保守，因此在用PCR法进行性别鉴定时可以用相同的引物鉴别不同动物。PCR扩增法是一种模仿体内DNA复制的过程，主要是针对Sry基因的DNA序列设计特异引物，并通过PCR扩增胚胎SRY特异DNA序列来鉴定胚胎的性别，该方法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。
目前有研究人员建立了奶牛和山羊体外授精胚胎的性别鉴定的技术奶牛和山羊的卵母细胞经过体外成熟、体外受精和体外发育至桑椹期，在显微操作下，吸取4~6个胚胎细胞，应用Nest-PCR技术对其DNA进行SRY基因的测定以进行胚胎性别鉴定。对转有外源基因的试管牛胚胎和试管羊胚胎进行了SRY基因检测。并将经过性别鉴定的胚胎移植入受体牛和受体羊中，产下的羊羔和牛犊的性别与胚胎性别鉴定的结果完全相符。
但上述方法存在鉴别准确性不高，所需时间较长，用于动物胚胎性别检测方法和程序在生产实践中难以实施。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛羊胚胎性别快速鉴别和胚胎克隆性别的鉴定的PCR试剂盒，及PCR引物，应用PCR技术准确快速地进行哺乳动物胚胎性别鉴别。
本发明的技术内容如下1、PCR扩增引物设计与合成通过对Genbank中老鼠、猪、羊、山羊、牛等动物Sry基因的序列查询，用Clustal W程序软件对这几种动物Sry基因序列进行比对分析发现哺乳动物的Sry基因核酸序列有很高的同源性和保守性，按引物设计的一般原则，设计一对引物扩增Sry基因上163bp的区域。碱基序列如下5’端上游引物(SRY5)5’-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3’3’端上游引物(SRY3)5’-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3’以上引物用灭菌双蒸水1.23-1.24mL稀释，最终浓度为20μM，-20℃保存。
表1和表2列出了扩增Sry基因的引物序列及其在几种哺乳动物之间的同源性。
表1，性别鉴定所用SRY引物及其与几种哺乳动物Sry基因核酸序列的同源性SRY5 TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC猪 TGAACGCTTTCATTGTGTGGTCTCGTGATCAAAGGAGAAAAGTGGCTCTAGAGAAC
绵羊.C....................A.G...AC....G..............T山羊.C....................A.G...AC....G..............T牛 .C....................A.G...AC....G..............T鼠TGAATG.A..T..G........C....G.G.G...CAC..GT....C.AGC....T兔TGAACG.A.....G........C.AAC....G..AC.CC.G........GC....T猪CCTCAAATGCAAAACTCAGAGATCAGCAAGTGGCTGGGATGCAAGTGGAAAATGCT绵..CA..C.......................CA........A.G.........G...
山..AA..T.......................CA........A.G.........G...
牛..CA................C.........CA........ATG.........G...
鼠..CAGC........TA.............CA...........G........GC..
兔..CA......G.........C.........CA.......CA.C.........G...
SRY3猪TACAGAAGCCGAAAAGCGCCCATTCTTCGAGGAGGCACAGAGGCTACAGGCGGT绵......T..T.................T..............A....TA..TA.
山......T..T.................T..............A....TA..TA.
牛......T..T.................T..............A....TA..CA.
鼠...G...........ATTG.......................A....G...TA.
兔.T.......T.....AT.G.........C.......G..A..A..G.....CA.
表2，各种动物Sry基因151bp的同源性
含有上述引物的PCR试剂盒，其主要组成成分为(50 reaction)①DNA提取缓冲液(DNA extract buffer)1mL，其主要成分为胚胎处理液(10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/LMgCl2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K)；②Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)20μL共100IU；③PCR反应液(PCR reaction buffer)1500μL，内含2.533mmol/LMgCl2，0.337μmol/L引物，0.168mmol/L dNTPs；
④空白对照(negative contrast)250μL；⑤石蜡油(paraffin liquid)1mL；⑥上样缓冲液(loading buffer)100μL，内含0.2％溴酚蓝、50％蔗糖溶液。
所述试剂盒在PCR哺乳动物性别鉴定上的应用，包括以下步骤①样品处理，收集哺乳动物胚胎1~2个细胞，先用0.145mol/L NaCl冲冼2次，再加入胚胎处理液(10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K)，使总体积为20μL，将胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR反应的模板。
②扩增反应，按待扩样本数n(n＝胚胎处理样品数+2)取PCR反应液n×29.6μL、Taq DNA聚合酶n×0.4μL混于一离心管中，用手指敲几下使其混匀，将反应管标记好后，按每管30μL分装。将空白对照50μL加入一个反应管中，再取各胚胎处理样品(20μL)加入对应反应管中(反应体系为50μL)，每管加20μL灭菌石腊油，短暂离心后置扩增仪上进行扩增。反应参数95℃预变性5min后，按95℃1min，58℃1min，72℃1min程序进行35个循环，最后72℃廷伸9min，于4℃结束反应。
③产物检测，取PCR扩增产物10μL，加2μL上样缓冲液，充分混匀后点样，用PCR Marker作为分子量标准。用含EB染色的2％琼脂糖凝胶电泳1h(3-4V/cm)后结束电泳。将胶置于紫外灯下观察，出现特异带的为雄性，否则为雌性。
DNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)，是脱氧核糖核苷三磷酸。
本发明所设计的性别鉴定引物还能用来鉴定猪、兔等哺乳动物早期胚胎的性别。PCR反应采用扩增牛基因组DNA的最适扩增条件。
本发明应用引物SRY5，SRY3扩增牛的肝和肌肉基因组DNA样品，羊的基因组DNA样品，兔的基因组DNA样品，猪的基因组DNA样品，扩增产物的电泳分析结果均显示清晰的特异扩增带，大小为163bp，母猪样品和空白对照的扩增产物的电泳分析结果均无相应的特异扩增带。
本发明设计的一对性别鉴定引物，通过优化的胚胎DNA扩增条件配制成PCR性别鉴定试剂盒。所配制的PCR性别鉴定试剂盒的关键是Mg2+浓度，Mg2+浓度的大小对实验结果影响很大，本发明中Mg2+浓度最佳浓度为1.5mol/L，大于或小于该浓度均不能成功进行PCR扩增。而其它成分和反应参数与标准PCR反应要求基本一致。本发明试剂盒采用PCR技术对雄性特异性SRY基因中的保守核酸序列进行扩增，通过对扩增产物的检测来判断Y染色体特异性片段存在，同时可以避免不必要的污染，适用于生产实践中快速(1个小时左右)鉴别哺乳动物胚胎的性别，准确率达到100％。
图1是牛基因组DNA PCR扩增实验谱图。
图1中，(a)1，2，3公牛；4 PCR Marker；5，6，7母牛；8空白对照(b)1 PCR Marker；2，4，6，8公牛；3，5，7母牛；9空白对照(c)1，2，3，4-公牛；5 PCR Marker；6，7，8母牛；9空白对照图2是羊和兔基因组DNA PCR扩增实验谱图。
图2中，1-公羊；2，3，4-公兔；5-PCR Marker；6，7-母羊；8-母兔；9-空白对照图3是猪基因组DNA PCR扩增实验谱图。
图3中，1 PCR Marker；2，4，6，8公猪；3，5，7母猪；9空白对照具体实施方式
例1利用动物基因组DNA检测性别动物组织的基因组DNA的提取纯化及质量检测1、将0.5mg新鲜动物肌肉组织或肝脏组织切成碎片放在盛有4.5mL DNA提取缓冲液(10 mmol/LTris-HCl，0.1mol/LEDTA，20μg/mL RNA酶，0.5％SDSpH8.0)的匀浆管中，匀浆管置于有冰块的烧杯中，采用电动玻璃匀浆机中速匀浆约90sec。匀浆液全部倒入2支5mL离心管中，离心管置有冰块的烧杯中，用超声波细胞粉碎机(功率400W，超声时间3sec，间隙时间4sec，工作次数15次)粉碎。EDTA是指乙二胺四乙酸。
2、粉碎细胞后，将离心管快速置水浴恒温振荡器中37℃温育1 h。
3、向离心管中加入25μL蛋白酶K，至终浓度为100μg/mL，用一玻棒温和地将酶混入粘滞的溶液中。
4、将裂解细胞的悬液置于50℃水浴恒温振荡器中水浴3 h。将溶液冷至室温，加等体积Tris-HCl饱和酚(pH7.9±0.2)，缓慢地来回颠倒离心管约10min，小心地混合两相。离心10，000r/min，30min。
5、用大口径(3mm)移液器头将上层水相移至一洁净的离心管中。加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，缓慢地来回颠倒离心管约10min，小心地混合两相。离心10，000r/min，20min。
6、用大口径(3mm)移液器头将上层水相移至一洁净的离心管中。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，缓慢地来回颠倒离心管5min，以小心地混合两相。离心10，000r/min，10min。
7、用大口径(3mm)移液器头将上层水相全部移至一洁净的离心管中。于室温加0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，在桌面上滚动离心管使其充分混匀，DNA立即形成絮状沉淀。用玻棒挑取沉淀或室温离心5000r/min，5min收集沉淀。并用移液器头尽量除去液体。
8、用70％乙醇悬浮沉淀二次，室温离心5000r/min，5min收集DNA。尽可能除去70％的乙醇。(但不要使沉淀完全干燥，否则不易溶解。)9、TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH 8.0)溶解DNA沉淀，轻敲之，使DNA完全溶解后，-20℃保存。
10、紫外分光光度法检测DNA的纯度和含量在石英比色皿中加入15μL DNA样品，加水至3mL，混匀后分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A260/A280值。A260/A280应介于1.75-1.8之间，低于1.75则表明制备物中存留显著蛋白质，此时应加入SDS至终浓度为0.5％并重复上述2-10步；大于1.8则表明DNA样品中有RNA，此时应加入RNA酶，并重复上述2-10步。计算DNA浓度10×A260(μg/μL)11、琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。
①2％凝胶的制备准确称取0.18g琼脂糖溶入18mL的1×TAE(0.04mol/L Tris-HCl，0.02mol/LNaAC，2 mmol/LEDTA pH8.0)中，置电炉上加热并不时摇动至完全熔化，室温冷至50-60℃，加1μL的10mg/mL EB立即摇匀，迅速倒入已用灭过菌的防水胶带封好口的电泳槽中，室温下放置30min以上，拔出梳子。
②样品的制备在腊膜纸上点上2μL上样缓冲液和10μL DNA样品，充分混匀，并用PCRMarker作为分子量标准。
③电泳将凝胶浸入电泳缓冲液中，点样后，接上电源，3 V/cm，电泳1h以上。
④观察结果用手提式紫外灯观察结果，并拍照保存。
例2动物血清的基因组DNA的提取纯化及质量检测1、收集约6mL新鲜血液，加入装有1mL酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD溶液—柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，葡萄糖1.47g，加水至100mL)的离心管中。血液在制备DNA以前可于0℃保存数天或于-70℃长期保存。
a、新鲜血液(2mL)离心4500r/min，15min，弃上层血浆，用吸管小心将淡黄层移至一新离心管中，并再次离心4500r/min，15min。离心后将淡黄层重悬于1.5mLDNA提取缓冲液中，于37℃温育1h，随后步骤同例1的3-11步。
b、冷藏血液(2mL)，室温融化，移至一新离心管中，用等体积磷酸缓冲盐溶液PBS(8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，加水至1 L调pH值7.4)稀释，随后于室温离心7000r/min，15min。并弃去上清，用1.5mLDNA抽提缓冲液重悬沉淀物，于37℃温育1 h，随后步骤同例1的3-11步。
2、扩增反应按待扩样本数n(n＝胚胎处理样品数+2)取PCR反应液n×29.6μL、Taq DNA聚合酶n×0.4μL混于一离心管中，用手指敲几下使其混匀，将反应管标记好后，按每管30μL分装。将空白对照50μ加入一个反应管中，再取各胚胎处理样品(20μL)加入对应反应管中(反应体系为50μL)，每管加20μL灭菌石腊油，短暂离心后置扩增仪上进行扩增。反应参数95℃预变性5min后，按95℃1min，58℃1min，72℃1min程序进行35个循环，最后72℃廷伸9min，于4℃结束反应。
3、产物检测取PCR扩增产物10μL，加2μL上样缓冲液，充分混匀后点样，用PCR Marker作为分子量标准。用含EB染色的2％琼脂糖凝胶电泳1 h(3-4V/cm)后结束电泳。
将胶置于紫外灯下观察，出现特异带的为雄性，否则为雌性。
例3用胚胎鉴定性别的方法1、胚胎的评定和测定大小在实体显微镜下检到的胚胎，用PBS净冼3次置无菌室内，静置0.5h，在培养液中，评定其发育时期，胚龄及级别。
2、胚胎的处理收集哺乳动物胚胎的1~2个细胞，先用0.145mol/L NaCl冲冼2次，再加入胚胎处理液(10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K)，使总体积为20μL，将胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR反应的模板。
3、扩增反应按待扩样本数n(n＝胚胎处理样品数+2)取PCR反应液n×29.μL、Taq DNA聚合酶n×0.4μL混于一离心管中，用手指敲几下使其混匀，将反应管标记好后，按每管30μL分装。将空白对照50μL加入一个反应管中，再取各胚胎处理样品(20μL)加入对应反应管中(反应体系为50μL)，每管加20μL灭菌石腊油，短暂离心后置扩增仪上进行扩增。反应参数95℃预变性5min后，按95℃1min，58℃1min，72℃1min程序进行35个循环，最后72℃廷伸9min，于4℃结束反应。
4、物检测取PCR扩增产物10μL，加2μL上样缓冲液，充分混匀后点样，用PCR Marker作为分子量标准。用含EB染色的2％琼脂糖凝胶电泳1 h(3-4V/cm)后结束电泳。将胶置于紫外灯下观察，出现特异带的为雄性，否则为雌性。
例4可以用上述方法进行猪、狗、羊其它动物的性别鉴定，方法同例1或例2或例3。
权利要求
1.一种PCR扩增引物，是一对引物扩增Sry基因上163bp的区域，碱基序列如下5’端上游引物(SRY5)5’-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3’3’端上游引物(SRY3)5’-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3’。
2.含有权利要求1引物的试剂盒，其主要组成成分为(50 reaction)①DNA提取缓冲液(DNA extract buffer)1mL，其主要成分为胚胎处理液，胚胎处理液的成分为10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2mmol/LMgCl2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K；②Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)20μL共100IU；③PCR反应液(PCR reaction buffer)1500μL，内含2.533mmol/LMgCl2，0.337μmol/L引物，0.168mmol/L dNTPs；④空白对照(negative contrast)250μL；⑤石蜡油(paraffin liquid)1mL；⑥上样缓冲液(loading buffer)100μL，内含0.2％溴酚蓝、50％蔗糖溶液。
3.如权利要求所述试剂盒在PCR哺乳动物性别鉴定上的应用，包括以下步骤①样品处理，收集哺乳动物胚胎1~2个细胞，先用0.145mol/L NaCl冲冼2次，再加入胚胎处理液10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K，使总体积为20μL，将胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR反应的模板，②扩增反应，按待扩样本数n，n＝胚胎处理样品数+2，取PCR反应液n×29.6μL、Taq DNA聚合酶n×0.4μL混于一离心管中，用手指敲几下使其混匀，将反应管标记好后，按每管30μL分装。将空白对照50μL加入一个反应管中，再取各胚胎处理样品20μL加入对应反应管中，反应体系为50μL，每管加20μL灭菌石腊油，短暂离心后置扩增仪上进行扩增；反应参数95℃预变性5min后，按95℃1min，58℃1min，72℃1min程序进行35个循环，最后72℃廷伸9min，于4℃结束反应；③产物检测，取PCR扩增产物10μL，加2μL上样缓冲液，充分混匀后点样，用PCR Marker作为分子量标准；用含EB染色的2％琼脂糖凝胶电泳1h，3-4V/cm后结束电泳，将胶置于紫外灯下观察，出现特异带的为雄性，否则为雌性。
全文摘要
本发明涉及一种PCR扩增引物，及试剂盒和在哺乳动物性别鉴别上的应用，是一对引物扩增Sry基因上163bp的区域，碱基序列如下5’端上游引物(SRY5)5’－TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC－3’，3’端上游引物(SRY3)5’－GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT－3’。试剂盒主要组成成分为DNA提取缓冲液，Taq DNA聚合酶，PCR反应液，空白对照，石蜡油，上样缓冲液。试剂盒在PCR哺乳动物性别鉴定上的应用步骤为①样品处理；②扩增反应；③产物检测。本发明通过对扩增产物的检测来判断Y染色体特异性片段存在，同时可以避免不必要的污染，适用于生产实践中快速(1个小时左右)鉴别哺乳动物胚胎的性别，准确率达到100％。
文档编号C12Q1/68GK1664110SQ20041001422
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月3日 优先权日2004年3月3日
发明者陈宏权, 洪桂云, 章孝荣 申请人:安徽农业大学