专利名称：甲酸诊断/测定试剂盒及甲酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种甲酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甲酸浓 度的方法，属于医学/食品/环境/工业检验测定技术领域。
技术背景甲酸(HCOOH)在室温下有自然分解的特性，同时，测试过程中不可 避免地有一部分水分混入甲酸，甲酸是无色透明和发烟的液体.有浓烈的 刺激性酸味。 一般在工业及环境监测中使用气相色谱法；在医药及农业上使用酶法分析，酶法分析已被多个国际权威组织或机构采纳如IFU (国 际果汁生产者协会)，AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK， OICC， VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原 型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甲 酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的甲酸诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪 上进行甲酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的 推广应用。本发明甲酸浓度测定方法原理如下4甲酸+高铁细胞色素 甲酸脱氢酶 二氧化碳+亚铁细胞色素 二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)L-苹果酸+辅酶这种方法应用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase; EC 1.2.2.1; EC 1.2.2.3)偶联苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1丄1.40; EC 1丄1.83)酶促反应连续监测法/终点比色法。甲酸脱氢酶 酶解甲酸反应产生二氧化碳，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，最终将还 原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量 340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算甲酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甲酸诊断/测定试剂盒 较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L高铁细胞色素 10 mmol/L丙酮酸 30 mmol/L甲酸脱氢酶 10000 U/L苹果酸脱氢酶 16000 U/L酶、苹果酸脱氢酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸。试剂2缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶。 还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶。还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶在试 剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甲酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的甲酸诊断/测定试剂为单试剂，包括100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 30 mmol/L三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 高铁细胞色素 丙酮酸甲酸脱氢酶 10000 U/L苹果酸脱氢酶 16000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甲酸样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甲酸的浓度 大小。 实施例二本实施例的甲酸诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L高铁细胞色素丙酮I10 mmol/L30 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂甲酸脱氢酶苹果酸脱氢酶100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L16000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甲酸样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甲酸的浓度大小。实施例三本实施例的甲酸诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶高铁细胞色素丙酮酸试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 30 mmol/L苹果酸脱氢 100 mmol/L 500 mmol/L 16000 U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂甲酸脱氢酶廳mmol/L500 mmol/L10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定甲酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测甲酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向 为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终辨反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甲酸的浓度 大小。申请人经过实验验证，釆用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的甲酸浓度测定方法，其方法原理如下甲酸+高铁细胞色素甲酸脱氢酶二氧化碳+亚铁细胞色素二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化) L-苹果酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出甲酸的浓度大小测定结果。
2. —种甲酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L高铁细胞色素 1——50 mmol/L丙酮酸 1——50mmol/L甲酸脱氢酶 . 1000——80000 U/L苹果酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述甲酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述甲酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 高铁细胞色素、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述甲酸诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 高铁细胞色素、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢 酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶组成。还原型辅酶、 高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶在试剂l、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述甲酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂l一OOO mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的甲酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甲酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境/工业检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、高铁细胞色素、丙酮酸、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出甲酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/26GK101324516SQ200710023388
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司