一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法

专利名称：一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用，该分子标记与尸A^/尸/ /^基因有关，利用本发明克隆的分子标记对猪与生产性状 进行关联分析。
背景技术：
养猪业是我国肉类产品来源的重要支撑产业，在我国畜牧业和国民经济中有着举足轻重的地位。猪的 分子遗传育种在近年来取得了很大的进展，许多影响猪生长性状、胴体性状与肉质性状的新基因被分离克 隆，为现代分子生物技术应用于猪育种提供了分子遗传基础。由肥胖而带来的心血管疾病严重影响人类的 健康，人们越来越关注肉类食品的脂肪含量，因此猪的育种目标由脂肪型向瘦肉型转变。所以分离克隆影 响猪的重要经济性状的新基因，为加速猪新品种的选育、加快我国养猪业的发展具有及其重要的意义。目前，将现代分子生物学与常规育种方法结合所应用最多的领域是标记辅助选择(MAS)与标记辅助导 入(MAI)，它们都是借助分子标记选择某一座位基因来改变该座位基因频率的过程。近几年来，分子标记 有了迅猛的发展，己经从第一代的限制性片段长度多态性标记和第二代的微卫星多态性标记发展到第三代 新型分子标记一单核苷酸多态性(SNP)。 SNP是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入、缺失等。在特定群体中，某一种碱基即某一等位基因出现 于特定位置的概率要大于1%,此位点才能称之为SNP位点，否则只能称为突变位点。根据SNP在基因组 内的位置可以人为地划分为三种形式第一种是基因编码区的功能突变，主要分布于基因编码区(cording region)，故又称之为cSNP:另外两种是遍布于基因组的大量单碱基变异，包括基因周边SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP, iSNP)。在SNP检测技术上， 一般常用的比较成熟的具有代表性的方法如下l.RFLP.限制性内切酶是一类能识 另ljDNA序列上的特异位点(通常为4 6bp的反向重复序列)，并在特异位点处切割的DNA酶类。对于一条DNA 分子来说会产生特定大小和数目的酶切片段。基因的突变会产生或消除某些酶切位点，从而改变酶切片段 的大小和数目，这些酶切片段可以通过电泳方法检测出来。因此RFLP只适于检测酶切位点处的SNPs，对于 酶切位点以外的SNPs则无法检测。2.SSCP.—定条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由 它的核苷酸序列决定的。由于基因突变，DNA分子单链的构像就会发生变化，从而在电场中具有不同的迁 移率，因此可以通过电泳方法检测出来。SSCP的简单易行，仪器要求低，但"差异灵敏度"较低。另外， DNA单链在一定温度下可能有多种热温定性相近的构型，那么电泳时同一条DNA分子就可能产生多个条带' 而且DNA构像对温度的改变非常敏感，所以还需要用别的方法对其进行矫正。随着SNP技术的研究的深入，SNP已经成为进行猪基因与基因组分析的一个重要研究手段，为猪重要经 济性状QTL位点的定位与优良性状的选育提供了强有力的工具，目前已经广泛应用于猪分子育种领域。对 于猪胴体和肉质性状的候选基因，目前已有多例报道。激素敏感脂肪酸(HSL)是动物体内脂肪分解的关键 酶，Harbitz等(1999)对8个梅山X大白祖代群体进行了HSL基因多态性分析表明第7内含子1167处有一个Alu多态性位点，第8外显子存在G—T的碱基变异，它引起谷氨酸一天冬氨酸的变化。胰岛素样生长因子 2 (IGF2)基因是影响猪瘦肉量的主要候选基因。Knoll等(2000)确定了IGF2基因内含子2中G—A的突变 产生了NciI酶切位点。氟烷敏感基因(Hal)是影响猪肉质的主效基因，Fujii等(1991)发现的Hal主要候 选基因I型兰尼定受体基ra (RYRI )存在18处SNPs，其中第1843位突变(C—T)导致蛋白受体第615位的 Arg变为Cys，是导致猪应激敏感综合征(PSS)的原因。猪肌内脂肪(IMF)基因影响肉质的嫩度、风味和 多汁性，心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因主要在心脏、骨骼肌细胞和乳腺细胞表达，可作为影响IMF 含量的候选基因，曹红鹤等(2002)在猪H-FABP基因内发现了3个SNPs: 5'上游区第1324位点T—C突变， 第2内含子1811位点C—G突变，1970位点T—C突变，它们引起了三个变异酶切位点。前人的研究表明，脂肪酶是水溶性的酶，能水解不能溶解的基质，例如甘油二酸酯，磷脂和胆固醇酯。 因此，脂肪酶在脂类代谢和运输中重要作用，同时它和一些严重的疾病例如肥胖，糖尿病和脂肪沉滞性动 脉硬化症等相关联。脂肪酶基肉家族包括肝酯酶，脂蛋白脂肪酶，内皮脂肪酶，磷脂酶A1，胰脂肪酶和 胰脂肪酶相关蛋白l、 2。胰脂酶在体内占优势，胰脂肪酶发挥作用与胰脂肪酶相关蛋白l和2紧密相关。有专家报道胰脂肪酶相关蛋白2 (PNLIPRP2)与酶原颗粒膜相关，这预示着这种酶有可能促进膜结构和 颗粒运输(M.J.Wishartetal 1993)。胰脂肪酶相关蛋白2在胰液中出现，它也参与肠内的脂解作用。当日 粮脂肪含量达到4%时，为了促进脂肪沉积，避免血糖过多而引起糖尿病，TH鼠表现出(一种研究II一糖 尿病的模型动物)选择性地减少PNLIPRP2的表达量(Brown et al 2005)。研究巳证实胰脂肪酶相关蛋白2 对鼠新生儿食物的三酸甘油酯消化起作用。不仅在鼠的小肠组织中能检测到胰脂肪酶相关蛋白2的mRNA， 而且在肠上皮细胞和帕内特细胞内也能检测到。胰脂肪酶相关蛋白2在帕内特细胞内的出现说明了这个酶 既有磷脂酶的活性，也有抗菌活性。对猪的胰脂肪酶相关蛋白2基因的研究在DNA水平上较少，主要集中在蛋白质水平上，而对胰脂肪酶基 因的多态性研究在人类上研究的较多。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因 功能的一个非常有力的手段。所以申请人对猪胰脂肪酶的部分内含子进行了多态研究和关联分析，以期能 够发现它在猪的选种选育方面的功能。发明内容本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆一种作为猪标记辅助选择的与生产性状(例如胴体性状与 肉质性状)相关的分子标记，并将该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。 本发明通过以下技术方案实现申请人克隆得到与猪生产性状(例如胴体性状与肉质性状)相关基因/^VL/P/ F2的DNA片段，它的 cDNA序列(包括全长CDS及部分3，-UTR和部分5'-UTR)如序列表SEQ ID NO: 1所述。同时本发明利用上述克隆的DNA片段克隆得到一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的 分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示。所述的分子标记，其特征在于序列表SEQ ID NO: 3所示序列的第190位碱基处有一个T190-C190的碱基突变'导致Ecol30 I -RFLP多态性。申请人制备了检测上述碱基突变的正、反向引物'该引物的DNA序列如下所示 正向引物5'-TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3'， 反向引物5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。制备上述分子标记的方法，按照以下步骤用人/W丄/尸/^2基W cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90n/。以上的表达序列标签(EST); 然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计引物获得猪的编码区全长，根据与人PW丄/iV F2基因的cDNA 序列的比对结果大致得出猪尸A^/尸M2基因的3、 4外显子，在第3、 4外显子上分别设计正反扩增引物， 提取猪血液中的DNA，利用设计的引物PCR扩增猪尸A^/W P2基因的第三内含子、PCR产物回收，克隆， 测序，获得如序列表SEQIDNO: 3所示的核苷酸序列。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》。


序列表SEQ ID NO: 1是本发明克隆的猪生产性状相关基因/W丄/ M2部分cDNA序列(包含CDS全长及部分3'-UTR和部分5'-UTR)。 序列表SEQ ID NO: 3是本发明克隆的第一头外来猪种"大白猪"(即为图3中的LI)尸A^/尸/2W基因包括第三内含子的核苷酸序列。 图1:本发明中猪尸W丄/尸W^基因第三内含子序列电泳图片，片段大小为1573bp(琼脂糖胶浓度为1.5%)。图中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。 图2:本发明中猪尸A^/尸i^2基因部分的扩增序列的电泳图谱(酶切片段)，片段大小为596bp (琼脂糖胶浓度为1.5°/。)。图中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。 图3:应用本发明的方法对2头"大白猪"和2头"梅山猪"包括第三内含子的核苷酸序列比对结果。图中M1、 M2代表"梅山猪"，Ll、 L2代表"大白猪"。 图4:本发明中猪PW丄/尸/ /^基因第三内含子的Ecol30l-RFLP的三种基因型(AAABBB)电泳图谱。(琼 脂糖胶浓度为2%)，图中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
具体实施方式
实施例1:(一)/Wi/ZW12基因CDS克隆及部分DNA序列扩增 (1)引物设计用人/W￡/P/ P2基因mRNA(GenBank收录号NM_005396 )为信息探针，利用NCBI中的BLAST工 具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90%以上的ESTs (片段长度大于 lOObp),将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ (http:〃www.ncbi,nlm.nih.govAVeb/ Search/index.html) 查询相应序列，然后用序列分析软件DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据与人/WiL/i^/>2 基因mRNA的同源比对初步确定起始与终止密码子位置，设计引物克隆得到如序列表SEQ ID NO: 1所示 的cDNA序列(包括CDS全长及部分3，-UTR和部分5'-UTR);根据与人iW丄/尸朋2基因的基因组全长DNA 序列的比对结果大致得出猪尸W丄/PM基因外显子的拼接位点，设计第三内含子的扩增引物，选取2头"大 白猪"和2头"梅山猪"的DNA做模板，进行PCR扩增、回收、克隆、测序，获得如序列表SEQIDNO: 3 (包括附图3中L2、 Ml、 M2所示的序列，该附图中的Ll序列已经包括在SEQ ID NO: 3所示的序列中) 所示的核苷酸序列。通过Cluster W比对发现存在4处SNP，其中190bp处的T/C碱基突变恰好能被内切 酶Eco130 I的识别。扩增iWL^i P2基因cDNA序列的引物如下所示(分3段扩增)第一段为部分5' UTR，第1-4外显子和部分第5外显子 正向引物5'ACATCCCGTGTGTGCTGAGG 3', 反向弓l物5'AGGCTGTGCCCGATGAGGTG3'。 第二段为部分3外显子,4-10外显子和部分11外显子 正向弓l物5' TCATAGACAAGGGGGAGGATA3'， 反向引物5' CCCAGTTCGGGGTGGAATAAG 3'。 第三段为部分6外显子,7-11外显子和部分3' UTR 正向弓l物5'ACGGACTCTGCTCCCTTCAT3', 反向引物5' TTCAACGTCAAACCACTGGC3'。 扩增的包含尸7VL/尸/^2基因第三内含子序列的引物如下所示 正向引物5' TGAGGCTTCAAACTTCC AAC3'， 反向弓I物5' TCTCCAGTCCACACAGATGC 3'。 检测T190-C190处碱基突变所用的引物序列如下所示 正向引物5'- TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3'' 反向引物5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。 (2) PCR产物的纯化、克隆和测序PCR扩增条件25uL的反应体系中加入DNA模板1hL，10xPCR buffer 2.5pL ， MgCl2(25mM) 2|_iL ，dNTP(10mM )0.5nL ,lOmM引物前后各lpL， Taq酶1U,双蒸水16nL， PCR反应条件为94。C预变性 4min、 94'C变性40s、退火温度见表1，退火时间45s; 72'C延伸时间见表1，共35个循环，最后72'C延 伸10min, 25'C保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。表l:扩增用途及退火温度和延伸时间扩增范围退火温度延仲时间为部分5' UTR,第1-4外显子和部分第5外显子60. 530s为部分3外显子,4-10外显子和部分11外显子58,6lmin为部分6外显子，7-ll外显子和部分3' UTR61.550s包含/Wi/尸i!K 第三内含子的序列57.6lmin30s检测T190-C190处碱基突变的酶切片段60.340sPCR产物的纯化具体操作步骤如下在紫外'J0"下从低熔点琼脂糖凝胶上^刃下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照该试剂盒 说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中加300nL的Sl液，于65'C温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA 混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500nL 的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500jiL的Wl液，静置lmin， 9200g离心30s，取下 Minicolumn装入1.5mlEpendor赠中，加入25 nL的灭菌水或者TE液，静置lmin之后，9200g离心l min，以 洗脱DNA存于Ependorff管中。连接反应将纯化PCR产物与PMD18-T Vector (购自TaKaRa公司)连接，连接反应总体积是10 u L,其中包括2X Rapid Ligation Bufer, 2. 5 u L; Vector (50ng)， 0.5uL;回收DNA， 7-8nL。稍微弹打 混合均匀，于16'C连接lh以上或者4'C连接过夜。感受态细胞的制备从37'C培养了 16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5a单菌落接种于2mLLB中， 于37'C振荡培养3 h,转接1 mL菌液于含有30 mL LB的盐水瓶中，继续在37'C振荡培养约4 h,待OD600 达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15 min，然后将菌液转入离心管中于4°C 4,000g离心10 min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30 min,重复4'C 4，000g离心10min—次，用4 ml冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4'C保存备用。转化在灭菌的1.5mL离心管中加入100"L感受态细胞，于冰上加入连接产物5nL，用移液枪吸打均 匀，冰浴30min;将离心管置于42'C的循环水浴中(勿震动)，热激90s后迅速冰浴2min;再往离心管中 加入400uLLB培养液，在37。C摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60rain;离心，去除部分上清液，取100uL 复苏后的菌液布于含A即的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37'C培养14-16小时，观察 有无菌落长出；阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取转化好的菌斑接入含lmL LB的1. 5mL离心管中并于37'C振摇培养约8h左右。以此菌液 为模板，选用原引物或M13 (上海生物工程有限公司提供)测序的通用引物(退火温度58-6(TC)进行PCR 扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。在本实施例中，PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物 回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的cDNA序列长度为1573bp，包括CDS全长1416bP及部分 3' HJTK和部分5' -UTR，(如序列表SEQ ID NO: 1所示);PCR得到的三内含子序列全长为1592bp,(如 图1和序列表SEQ ID NO: 3所示)，测序结果表明在该DNA序列的190bp处存在T190-C190突变。 (3) DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI， http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的己知生理功能基因进 行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。(二) PCR-RFLP诊断施建立RFLP检测:将PCR产物5jA， 10xBufferlnL，限制性内切酶Eco130 I为0.3nL(3U),加双蒸水补至 IOHL,将样品混匀后离心，37'C培养箱放置12h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在 紫外灯下拍照。用酶切引物扩增猪基因组DNA得到了 596bp特异性扩增片段(详见图2)，附图3的序列分析结果表 明在190bp处存在T190-C1卯突变，并导致Ecol30 I -RFLP多态性。该基因突变位点由两个等位基因控 制，其中C是没有形成酶切位点的等位基因，T是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种 基因型其中AA型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有596bp —条DNA带)，BB型为发生酶切的纯 合型(电泳检测时出现465bp和131bp两条DNA带)，AB为杂合型(电泳检测时出现596bp、 465bp和 131bp三条DNA带)。(三) PCR—Eco130 1 —RFLP多态性在各猪种中的分布情况的检测的应用利用PCR—Eco130 I —RFLP检测了 5个猪种其中属于中国地方血缘的猪种分别是八眉猪，淮南猪， 梅山猪，属于外来猪例如欧美血缘的猪种分别是长白猪和大白猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基 因频率如表2所示，结果显示在中国地方猪种中等位基因A和B所占比例差别较大，淮南猪以B等位基因 占优势，梅山猪均为A等位基因。而在国外猪种中A和B等位基因比例差别不大。表2:几个猪品种中7WL/W 尸2基因l卯位点多态性的基因型和基因频率品种个体数CC(AA〉基因型 TC(AB)TT卿C (A)等位基因频率 T(B)八眉猪2241260. 4550. 545淮南猪3828280. 1580. 842梅山猪34340010长白猪2171130. 5950. 405大白猪2578100. 4400, 560实施例2:用于统计分析的试验材料包括2003和2004年两批大白X梅山F2代总共223头猪，所分析的性状主要 为胴体性状和肉质性状。胴体性状包括皮率，骨率，肥肉率，瘦肉率，瘦肥肉比例，胴体重，屠宰率，内 脂率，至第一颈椎胴体长，至第一肋胸胴体长，6-7腰椎间背膘厚，肩部背膘厚，胸腰椎间背膘厚，臀部 背膘厚，眼肌高，眼肌宽，眼肌面积。肉质性状包括背最长肌pH，股二头肌pH，头半棘肌pH，失水率， 系水力，背最长肌色值，股二头肌色值，背最长肌大理石纹，股二头肌大理石纹，肌内脂肪，肌内水分。申请人采用采用SAS统计软件(SAS Institute Inc, Version 8.0) glm程序进行单标记方差分析， 同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为-J^为性状表型值，W为平均值，^为基因型效应；&、 K、巧为固定效应，分别为性别、年度、家系 效应，Z^w为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协 变量，生长不考虑协变量；e,力为残差效应。基因型检测结果表明在所检测的223头大白X梅山F2代个体中，AA基因型95头，AB基因型107头,BB基因型21头。不同基因型与胴体性状的统计结果总结于表3。不同基因型与肉质性状的统计结果总结于表4。 _表3: Eco130I-RFLP基因型与胴体性状的统计分析表_PNLIPRP2-Eco130 I -RFLP基因型_基因效应_性状 ~---AA基因型 AB基因型_BB基因型_加性效应_显性效应皮率(％) 0.094 ± 0.002 G.093土 0.002 0.090±0.004 0.002±0.002 -0.000±0.002骨率(％) 0. 125±0.002 0.124±0.002 0. 123±0.005 -0.005±0. 003 0.003±0.004肥肉率(％) 0.236± 0.005 0.242±0.005 0.245±0.010 0.006±0.003 0.002±0.004瘦肉率(％) 0.545 ± 0.004 0.542±0.004 0.544±0.008 0.115±0.049 -0.018±0.058瘦肥肉比例 2.478 ± 0.073 2.341±0.073 2.322± 0.148 -0.978±0.601 1.823±0.711胴体重(kg) 63.818±0.425 63.982±0.418 64.547±0.851 -0.415±0.421 -0.029±0.498屠宰率W 内脂率(%) 至第一颈椎胴体长(cm) 至第一肋胸胴体长(cm)肩部背膘厚(cm) 6-7腰椎间背膘厚(cm) 胸腰椎间背膘厚(cm) 臀部背膘厚(cm) 平均背膘厚(cm) 眼肌高(厘米) 眼肌宽(厘米)眼肌面积 注以上数值为最小0. 726±0. 0050. 032±0. 001 90. 865±0. 439 77. 979±0. 382 3. 563±0. 083 2. 801±0. 065* 2. 053±0. 0611. 932±0. 0812. 587±0. 061 7. 062士0. 130 6. 621土0, m 29. 360±0. 5270. 728±0. 005 0. 031±0. 001 91.926±0 432 77.970±0.375 3. 6160±. 082 2. 819±0. 064ab2.071±0. 060 2. 017±0. 080 2. 631±0. 060 6. 977±0. 127 6. 7f)7士0. 1350. 732± 0. 010 0. 033土0. 002 90. 716±0. 879 76, 927±0. 763 3. 728±0. 167 3, 091±0. 130b 2. 205±0. 121 2. 023±0. 163 2. 762±0. 122 7. 020±0. 259 6. 951±0. 274 31. 184±1.054-0. 003±0. 005 -0. OOO土O, 001 0. 039±0. 495 0.515±0. 428 -0. 065±0. 098 -0. 134±0. 075 -0. 066±0. 070 -0， 041±0. 092 -0. 076士0. 071 -0. 137±0. 298 -0. 036±0. 262 —0. 996±0. 606-0. OOO士O. 004 -0. OOO土O. 001 -0. 494±0. 372 -0. 235±0. 283 -0. 022土0. 064 0. 039±0. 050 0. 008±0. 046 -0. 029±0. 060 -0. OOO士O. 047 0. 361±0. 197 -0. 228±0. 173 0.棚±0. 40029. 645士0. 518:乘均值士标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母 表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示b等位基因降低性状表型值，其上标*表示 p<0. 05，林表示p〈0.0L由表3可以看出，pnliprp2基因型与6-7腰椎间背膘厚呈相关显著。在基因效应方面，痩肉率加性效 应达到显著水平，瘦肥肉比例显性效应达到显著水平。aa基因型个体6-7腰椎间背膘厚显著低于bb基w 型个体，在育种中如果选择aa基因型的个体可能在一定程度上改善胴体性状。表4: Eco130I-RFLP基因型与肉质性状的统计分析表PNLIPRP2—Eco130 I -RFLP基,基因效应性状AA基因型AB基因型BB基因型加性效应显性效应背最长肌pH6. 351±0.0136. 340±0.0136, 355±0. 025-0. 002±0.0140. 006±0.010股二头肌pH6. 405土0. 0096. 404±0. 0096, 410±0.017-0, 002±0. 0100. 002±0. 007头半棘肌pH6. 424±0. 0086. 420±0曙0086. 427±0. 016-0. 002±0. 0090. 003±0. 006失水率(％)6. 412±0. 175 a6， 979±0. 174 b6.鄉±0. 333ab0. 002±0. 189-0. 285±0. 129*系水率(％)91.284±0. 233 &90.533±0. 231b91.277±0. 444 &0. 004士0.2520. 374±0. m*背最长肌色值18. 709±0. 129&19. 082±0. 128 b18. 666士0. 245 ab0. 021±0.139-0. 197±0. 095*股二头肌色值18. 027±0. 06718. 164±0. 06618.010±0. 1270. 009士0. 072-O. 073±0. 049背最长肌大理石纹评分3. 548±0.0163. 545士0. 0163.567±0. 031-0. 009士0.0180. 006±0.012股二头肌大理石纹评分4. 048土0. 0164. 045±0.0164. 067±0. 031-0. 009±0. 0180. 006±0.012肌内脂肪(%)3. 667±0. 0503.631±0. 0503. 781±0. 095-0. 057±0. 0540. 047士0. 037肌内水分(%)73. 560士0. 06773.681+0, 06773.443士0. 1280. 058士0.073-0. 090±0. 049注以上数值为最小二乘均值士标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字 母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值，其上标*表 示p〈0. 05, *碌示p<0.01.由表4可以看出，失水率、系水力、背最长肌色值在不同基因型间的差异达到显著水平，且在基因效应方面均以显性作用为主。AA基因型的个体比AB基因型的个体具有更低的失水率、更高的系水力。因 此在育种中选择AA基因型的个体能改善肉质性状。_序列表_SEQUENCE LISTING<110>华中农业大学<120> —种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用 <130〉〈141〉 2008-03-12 <■ 3<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1573 <212> DNA<213> 猪(Sus scrofa) <220><221> CDS<222> (95).. (1510)<223〉<400> 1acatcccgtg tgtgctgagg gccaccttcc ctgtctgcca gcctcgtgcc tgtgcctctg 60 ggtctccatg cgcgtctctg cttcatccac gaag atg eta ccc tct tgg acc ate 115Met Leu Pro Ser Trp Thr lie1 5ggc ctt etc ctg ctg gcc aca gtc aga gga肪g gag 3tc tgc tat caa 163 Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Val Arg Gly Lys Glu lie Cys Tyr Gin10 15 20cct ttc ggc tgc ttc tec gat gaa aca cca tgg gcc鄉acc tgt cat 211 Pro Phe Gly Cys Phe Ser Asp Glu Thr Pro Trp Ala Arg Thr Cys His25 30 35tgg cct ttc卿tta ttt ccc tgg gcc ccc aag gac ate gac acc cat 259 Trp Pro Phe Lys Leu Phe Pro Trp Ala Pro Lys Asp lie Asp Thr His 40 45 50 55ttt ctt ctg tac act aat gag aat cca aat sac ttt caa ctg ate朋t 307Phe Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Asn Pro Asn Asn Phe Gin Leu lie Asn60 65 70ate act aac ctg gac acc att gag get tea aac ttc caa ctg gac cgc 355lie Thr Asn Leu Asp Thr lie Glu Ala Ser Asn Phe Gin Leu Asp Arg75 80 85aag aca cgc ttc ate ate cat ggc ttc ata gac aag ggg gag gat age 403Lys Thr Arg Phe lie lie His Gly Phe lie Asp Lys Gly Glu Asp Ser 90 95 100tgg CCC tCt g犯3tg tgC 33g 333 atg ttt 333 gtg gag朋g gtg sac 451Trp Pro Ser Glu Met Cys Lys Lys Met Phe Lys Val Glu Lys Val Asn105 110 115tgc ate tgt gtg gac tgg aga cgt ggg gcc ctg acg cga tac acc caa 499 Cys lie Cys Val Asp Trp Arg Arg Gly Ala Leu Thr Arg Tyr Thr Gin 120 125 130 135get gtg cac aac act egg gtc gtg gga gcc gag ata get ttc tta att 547 Ala Val His Asn Thr Arg Val Val Gly Ala Glu lie Ala Phe Leu lie140 145 150caa ggg ctg teg ace aag ttt gac tac aac cct gag aac gtg cac etc 595 Gin Gly Leu Ser Thr Lys Phe Asp Tyr Asn Pro Glu Asn Val His Leu155 160 165ate ggg cac 8gc ctg ggc gcg esc acg gcc gcg geig gcg ggc sgg agg 643 lie Gly His Ser Leu Gly Ala His Thr Ala Ala Glu Ala Gly Arg Arg170 175 180ctg ggg ggc cac gtg ggc agg etc aca ggg ctg gat cca get cag cca 691 Leu Gly Gly His Val Gly Arg Leu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gin Pro185 190 195tgc ttc cag aac aca ccc gag gaa gtt egg ctg gac ccg tec gat gcc 739 Cys Phe Gin Asn Thr Pro Glu Glu Val Arg Leu Asp Pro Ser Asp Ala 200 205 210 215atg ttt gtg gat gtg att cac acg gac tct get ccc ttc ate cct ttc 787 Met Phe Val Asp Val lie His Thr Asp Ser Ala Pro Phe lie Pro Phe220 225 230eta ggt ttc gga atg age caa aag gtg ggc cat ctg gat ttc tac cca 835 Leu Gly Phe Gly Met Ser Gin Lys Val Gly His Leu Asp Phe Tyr Pro 235 240 245肌t gg3 gga犯g gaa 3tg cct ggs tgt cag ass aat sec ctg tea acc 883 Asn Gly Gly Lys Glu Met Pro Gly Cys Gin Lys Asn Thr Leu Ser Thr250 255 260ate gtt gat gta gat gga ata tgg gaa ggc ate gaa gac ttt gca get 931 lie Val A印Val Asp Gly lie Trp Glu Gly lie Glu Asp Phe Ala Ala265 270 275tgc aat cac ctg 3ga age tac aag tat tac tea age agt ate ttc age 979 Cys Asn His Leu Arg Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ser Ser Ser lie Phe Ser 280 285 290 295ccc gat ggc ttc eta ggc tac cca tgt gcc tec tac gat gag ttc cag 1027 Pro Asp Gly Phe Leu Gly Tyr Pro Cys Ala Ser Tyr Asp Glu Phe Gin300 305 310gag gag gag aat aaa tgt ttt cct tgt cca get gaa gga tgc ccc aaa 1075 Glu Glu Glu Asn Lys Cys Phe Pro Cys Pro Ala Glu Gly Cys Pro Lys315 320 325atg ggg cac tat get gac caa ttt cag ggg aaa acc agt gcc gtg gga 1123 Met Gly His Tyr Ala Asp Gin Phe Gin Gly Lys Thr Ser Ala Val Gly330 335 340caa acg ttt ttc ctg aac aca gga gac agt ggt aac ttt act cgt tgg 1171 Gin Thr Phe Phe Leu Asn Thr Gly Asp Ser Gly Asn Phe Thr Arg Trp345 350 355aga tac agg gta tct gtc acc ctg get gga aaa agg aac gtg cat gga 1219 Arg Tyr Arg Val Ser Val Thr Leu Ala Gly Lys Arg Asn Val His Gly 360 365 370 375tac ate agg att get ttg tat gga agt aat gca aac tea aaa cag tat 1267 Tyr lie Arg lie Ala Leu Tyr Gly Ser Asn Ala Asn Ser Lys Gin Tyr380 385 390aat att ttc aag ggt tec etc caa cca aat gca aga tat aca cat gac 1315 Asn lie Phe Lys Gly Ser Leu Gin Pro Asn Ala Arg Tyr Thr His Asp395 400 405ate gat gtg gac etc aat gtt gga aaa gtc cag aag gtc aag ttc etc 1363 lie Asp Val Asp Leu Asn Val Gly Lys Val Gin Lys Val Lys Phe Leu410 415 420tgg tac犯c cat ata ata gac tta ttc cac ccc gaa ctg ggg get tec 1411Trp Tyr Asn His lie lie Asp Leu Phe His Pro Glu Leu Gly Ala Ser425 430 435caa gtg atg gtg caa agt ggt gaa gac aag act gag cat aag ttt tgc 1459 Gin Val Met Val Gin Ser Gly Glu Asp Lys Thr Glu His Lys Phe Cys 440 445 450 455ggc age gac acg gtg cga gag aac att tta caa acc etc aac ccc tgt 1507 Gly Ser Asp Thr Val Arg Glu Asn lie Leu Gin Thr l>eu Asn Pro Cys460 465 470taa a组gaggtg tcctcctcat ctttgaggta ataaeitttta atggccagtg 1560 gtttgacgtt gaa 1573<210> 2<211> 471<212〉 PRT<213> 猪(Sus scrofa)<400> 2Met Leu Pro Ser Trp Thr lie Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Val Arg15 10 15Gly Lys Glu lie Cys Tyr Gin Pro Phe Gly Cys Phe Ser Asp Glu Thr20 25 30Pro Trp Ala Arg Thr Cys His Trp Pro Phe Lys Leu Phe Pro Trp Ala35 40 45Pro Lys Asp lie Asp Thr His Phe Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Asn Pro50 55 60Asn Asn Phe Gin Leu lie Asn lie Thr Asn Leu Asp Thr lie Glu Ala 65 70 75 80Ser Asn Phe Gin Leu Asp Arg Lys Thr Arg Phe lie lie His Gly Phe85 90 95lie Asp Lys Gly Glu Asp Ser Trp Pro Ser Glu Met Cys Lys Lys Met100 105 110Phe Lys Val Glu Lys Val Asn Cys lie Cys Val Asp Trp Arg Arg Gly 115 120 125Leu Thr Arg Tyr Thr Gin Ala Val His Asn Thr Arg Val Val Gly 130 135 140AlaAla Glu lie Ala Phe Leu lie Gin Gly Leu Ser Thr Lys Phe Asp Tyr 145 150 155 160Asn Pro Glu Asn Val His Leu lie Gly His Ser Leu Gly Ala His Thr165 170 175Ala Ala Glu Ala Gly Arg Arg Leu Gly Gly His Val Gly Arg Leu Thr180 185 190Gly Leu Asp Pro Ala Gin Pro Cys Phe Gin Asn Thr Pro Glu Glu Val 195Asp Pro Ser AspArg Leu 210Ser Ala Pro Phe lie Pro Phe Leu Gly Phe 225 230 Gly His Leu Asp Phe Tyr Pro AsnPro Cys Phe Gin Asn Thr Pro 200 205 Ala Met Phe Val Asp Val lie His Thr Asp 215Gin Lys Gly lieAsnPhe 245Leu Ser Thr lieGly GlyVal 220Met Ser Gin LysGly 235Lys Glu Met ProThr 260Asp Phe Ala AlaGly 250Asp Val Asp GlyGlu 275Ser Ser lie PheVal 265Asn His LeuTyr Ser 290Ala Ser Tyr Asp Glu 305Pro Ala Glu GlyCys 280Pro Asp Gly PheSer 295Gin Glu Glu GluPhe 310Pro Lys Met GlyAspArgLeu 300 LysGly 255 TrpVal 240 CysGlulie 270Tyr Lys TyrSer 285Gly Tyr Pro CysGly Lys Ser GlyCys 325Ala Val Gly GinAsn 315His Tyr Ala Asp Gin Phe 330 335 Phe Phe Leu Asn Thr GlyCys Phe Pro AspThr Ser 340Phe Thr Arg TrpAsn 355Arg Asn Val HisThr 345Tyr Arg Val SerCys 320 GinAspGly Lys 370Asn Ala Asn Ser Lys 385Asn Ala Arg TyrArg 360Tyr lie Arg lieThr 350Thr Leu AlaGly 375Tyr Asn lie PheVal 365Leu Tyr Gly SerThr 405 LysGin 390His Asp lie AspAla 380Gly Ser Leu GinLys 395Asp Leu Asn ValVal 410Val Gin Lys Val Lys Phe Leu Trp Tyr Asn His lie lie Asp Leu PheGly 415 LeuPro 400 Lys420 425 430His Pro Glu Leu Gly Ala Ser Gin Val Met Val Gin Ser Gly Glu Asp435 440 445Lys Thr Glu His Lys Phe Cys Gly Ser Asp Thr Val Arg Glu Asn lie450 455 460Leu Gin Thr Leu Asn Pro Cys 465 470<210> <211> <212〉 〈213><220> <221> <222> <223><220> <221> <222> <223><220〉 <221〉 <222> 〈223><220〉 〈221> <222> <223>31592 腿猪(Sus scrofa)gene(l).. (1592)primer—bind (1573).. (1592)primer—bind (l).. (20)mutation (190).. (190)〈400〉 3tg鄉cttcaaacttccaactggaccgc犯gacacgcttcatcatccatggcttcettaga60caagggggaggatagctggccctctgaaatgtgC肌ggt3ggtgccc犯cctcctggcct120ggtg柳ctagcacccagca犯tgccacagcccctgacgc180taacctccatggggagatgggtccttcttaa犯ccactgaggaaactcagcttctcaggg240gcacccagcgtcaagttctccc犯cccax:caacctctagccaieieLceitctcCttaLggSLSLgC300tg犯犯gatctagcatcc^tcaga犯gtcctggaggtggag3ctacagaa肪ttacctg360gcatctgtctctgatggtttatagaaatcctctaggcaacgteLa肌肌tELcttaaaacgt420tataccctacagcactgccagacccctagcctgggaacttccacgtgctgc鄉tgcggc480cct犯犯ggac犯aagacaacaaacaaacaaac aaac aaaa犯acac3gt540tcgatacttgcct訪3gttg犯tCC8g3ggtgg组gt犯aeiccaggccttctgcccaca6002Lgatgccax;aatcctgtgtgtctacagatttagcctgt犯gagatgcccacgcatggctt660ttgg娜ctt3CgCtgCCC8gggt3gaccg鄉gcagcttctgcccataggctctctgct720cctcttggatctgggtgttc3C3ggtgCCCtctgagtccc卿鄉aggctgtgtggacc780t卿犯cagg犯3gCC3gggC3tgtggCCCaccatgatgccctgccctcctgccagcttc840tcccgacctcccagggcttccccggatgaaca犯ggctataaggcagccc900tttctgatgcttcttttctc卿gggCC3gtatctgcgcctgggccacac9606L犯agatgcctgtatctgagcctagcaccgtctaaattttatcttsttga1020acttttccctt犯tactgtctatcacccatcaaagcattgctgggaacct犯犯3CggCg1080tctctgaggcttcaattctagt3t犯gggtctgtaaacgttcctgtagaagagc犯gg犯1140tacatatttt鄉atttgtgggtcatacggtttcaacttatcatcgaatcagacaatccg1200gatetggccgaactttataa犯gcaggtggatttggcact1260ctggat犯ccaacgtcatctttctggcctggttgtgtcaa1320tgaccatctgt犯gtcacgccattcctggcctcagtgtccacatctgcta1380ga犯ttcacagttggtagc3tggtgg,g3gtggg鄉3ctatt犯agc1440tctgacaccagctggac组tgatggstgtg犯ttcctatctctgcagtgtgccacctgt1500ggctgttaatcagttggtttctccctcttgtctgtcttcctttaaaigtgg1560ctgcatctgtgtgg3Ctgg3gs159权利要求
1、一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。
2、 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，序列表SEQIDNO: 3所示序列的第190 位碱基处有一个T190-C190的碱基突变，导致Eco130 I -RFLP多态性。
3、 检测权利要求2所述碱基突变的正、反向引物的DNA序列如下所示正向5，- TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3，， 反向5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。
4、 一种实现权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，其特征按照以下步骤用人/W丄/尸i 尸2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90°/。以上的表达 序列标签(EST);然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计引物获得猪的编码区全长，根 据与人/W丄/尸i 尸2基因的cDNA序列的比对结果大致得出猪/Wi:/尸i 尸2基因的3、 4外显子， 在第3、 4外显子上分别设计正反向扩增引物，提取猪血液中的DNA，利用设计的引物PCR 扩增猪/WZJP/ P2基因的第三内含子、PCR产物回收，克隆，测序，获得如序列表SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
5、权利要求1或2所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪生产性状分子标记的克隆及其应用。本发明克隆得到如序列表SEQ ID NO3所示的与猪生产性状相关的基因片段，其中在SEQ ID NO3的第190bp处有一个T190-C190的碱基突变，导致Eco130I-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记、引物的制备方法以及利用本发明克隆的分子标记进行猪生产性状关联分析的方法。本发明为猪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK101245348SQ200810047038
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者付亚原, 任竹青, 波 左, 徐德全, 熊远著, 蕾 程 申请人:华中农业大学