专利名称：大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药品技术领域，具体地说是大黄素转化产物的大黄素-6-o-e -D-吡喃葡萄 糖苷制备(提取和分离方法)及应用。
背景技术：
大黄素(Emodin)化学名为1， 3， 8 —三羟基一6甲基蒽醌9， 10 — Anthrancenedione， 1， 3, 8—6—methyl—。分子式为dAA,相对分子质量为270. 23。为 橙色针状结晶(乙醇或减压升华)，熔点256 257"C。几乎不溶于乙醇及碱溶液。大黄素是 何首乌中的有效成分之一，资源丰富，来源十分广泛，可从蓼科植物何首乌Polygonum multiflonim Rheld.掌叶大黄欣謂 /^鹏toL.根茎、齿果酸模肠ex fite/ 加tAs L 根和叶、邹皮酸模《cri印^ L.等植物的根中提取得到，而且提取工艺、纯化十分简单。 现代研究表明大黄素具有抑菌、泻下、利尿、解痉、抗炎、止咳、抗肿瘤的作用。临床上 常用于糖尿病，肾病，胃肠功能衰竭，便秘，急性胰腺炎等。大黄素作用广泛，安全性高， 小鼠灌胃LDsu为56()mg/kg。但由于大黄素水溶性差，限制了大黄素的应用。以大黄素为基 本结构，进行结构修饰以增强大黄素活性，扩大应用范围是一项重要的研究工作。
以大黄素作为母体进行结构修饰，国内外做了许多研究工作。德国LarsTeich等人以 大黄素作为原料，用D旧进行结构修饰，获得8个衍生物，其中一个衍生物1， 3， 8三羟 基-6-甲基蒽醌具有很强的抗肿瘤活性。Demirezer等人发现大黄素及其衍生物，对多种肿 瘤细胞有抑制作用。赵蔡斌釆用量子化学的AMI算法计算了 12个大黄素衍生物的分子结 构参数,利用逐步回归分析建立构效关系模型，成功建立了大黄素衍生物抗肿瘤活性的构 效关系模型。大黄素衍生物抗肿瘤活性与分子体积「、极化率a及C环上净电荷QC相关。 张弘等人在实验室内以天然存在的大黄素(emodin)为原料合成了甲基化衍生物大黄素甲醚 (physcion)和三甲氧基大黄素(trimethoxyemodin)，并进行了杀菌和杀虫活性研究，发现 3个蒽醌类化合物对黄瓜白粉(幼々M加力eca M必/力朋)的活性有明显差异。谭嘉恒等人以大 黄素为母体，在其侧链上设计合成了一类新型含氮的大黄素衍生物，包括叠氮化合物、 甲基氨化合物和季铵盐化合物。生物活性研究表明，这类衍生物具有良好的抗肿瘤活性。 目前大黄的结构修饰主要采用化学方法，得到多个衍生物，目的是寻找更有效抗肿瘤活性的药物和杀虫剂，未见进行抗菌的实验研究。应用化学方法进行结构修饰存在选择性 不强，副产物多，后期分离困难，设备投资大，技术要求高，大量使用有机溶剂，存在环 境污染的隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种大黄素-6-0- e -D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，以及大黄素
-6-o- e -D-吡喃葡萄糖苷的应用。
本发明的技术方案为用米根霉^fe'幼/^s or_^ae、菌株XMS-OIO两个菌株对大黄素进 行转化、提取大黄素-6-o-e-D-吡喃葡萄糖苷、并通过硅胶柱层析和重结晶等方法对其中 成分进行分离的方法。具体如下
一、 大黄素转化产物的培养
用菌种米根霉欣iz叩"s orj^ae活化后接种到PDA斜面培养基，0-4卩保存；分别准 确称量大黄素25mg，放入50个洁净的500mL葡萄糖瓶中，再分别倒入丽培养液100mL， 12rC高压灭菌20min;灭菌后待培养液凉至室温，与无菌操作条件下分别将米根霉菌种接 入，放入恒温培养振荡器中，28°C， 180r/min振荡摇瓶培养，至培养液由桔红色混悬液变 透明时，再培养24 h将摇瓶从恒温培养振荡器取出培养液。
二、 大黄素转化产物的提取分离
1) 大黄素转化产物的提取将已发酵好的培养液合并收集，浓縮，用乙酸乙酯反复 萃取三次，萃取液浓缩干燥，得萃取物；
2) 大黄素转化产物的分离取柱层析硅胶(200-300目)用氯仿甲醇=30: l拌和 装柱，用氯仿甲醇30: 1洗脱液平衡柱体(一般2倍柱体积)；萃取物干法拌样上硅胶
柱层析，以洗脱液梯度洗脱，根据情况分别来收集各馏分，然后根据TLC分析结果进行各 馏分间的合并和浓縮；以氯仿甲醇=30 20:1多次洗脱，得组分A,经检测为大黄素；氯 仿甲醇10:1 6:1洗脱，得组分B，经检测为大黄素转化后的新产物。
三、 大黄素转化产物的鉴定 1.鉴定
l)光谱数据
黄色针状结晶(丙酮--水)，熔点237-238°C; Bornti^ger反应阳性，FAB/MS: 432 [M+]; 丽R (DMS0-gO S: 12.09 (1H， a-0H)， U.90(1H， a -0H) ， 7. 48 (1H， H-4), 7. 23 (1H， d， J=2. 2Hz, H-5) ， 7. 16 (1H， H-2), 6. 93 (1. 8H， d, J=l. Hz, H-7) ， 5. 53 (1H, d, J=4. 4Hzanomeric-H)， 3. 70-3. 18 (sugar-H), 2. 49(3H, s， Ar-CH3) 。 13C-讓(DMS0-cQ数据见表l。
表l 'H- and 13C陋R大黄素-6-0-e-D-吡喃葡萄糖苷光谱数据
position
1一164. 1 (s)
.27. 16 (IH， br s)124.3 (d)
3一148.8 (s)
47.23 (1H, br s)120.7 (d)
57.48 (IH， d, /= 1.8Hz)109.0 (d)
6一161.6 (s)
76.93 (1H, d， /= 1.8Hz)109.0 (d)
8163.9 (s)
9一190. 1 (s)
10—181.2 (s)
11—134.9 (s)
12—113.5 (s)
13一110.8 (s)
14-132.9 (s)
CH32.39 (3H, s)21.6 (q)
Glucose-1'5. 12 (IH， d, 8.4)鳳O (d)
2,3. 18-3, 47 (1H, m)73.2 (d)
3,3. 18-3. 47 (1H, m)76.3 (d)
4,3. 18-3. 47 (1H, m)69.6 (d)
5,3. 18-3. 47 (1H, m)77.3 (d)
6,3.31 (dd， J = 5.4， 10.6) 3. 68 (dd, J = 5. 4， 10. 6)60.6 (d)
C「0H11. 90
C「0H12.09
2)解谱过程
快原子轰击质谱(-)FAB-MS给出分子离子峰为历/z 432 [M]—，结合"C和DEPT核磁谱 (NMR)，给出其分子式为C2孔。(X。。此外，质谱上还给出脱掉一分子六碳糖的碎片离子峰，i 269 [M-C孔。05-H]—，相应的130醒1 谱给出该六碳糖的化学位移值分别为& 100.0， 73.2， 76.3, 69.6， 77.3， 60.6卯m，推测该糖为葡萄糖。'H-丽R (氢谱)显示该糖端基质子的 偶合常数(y)为8.4Hz，说明该糖为"-构型。扣除一分子葡萄糖，其余碳信号显示出典型 的蒽醌类化合物的特征，和文献比较该化合物的母核为大黄素(emodin)。葡萄糖有可能 连接在C-1， 6， 8的羟基上，和文献报道的大黄素-6-^y9-D-葡萄吡喃糖苷核磁(NMR)数 据比较基本一致，故该化合物鉴定为大黄素-6-^y9-葡萄吡喃糖苷(emodin-6-^ ;04) -glucoside)。3)组分A和组分B的结构式为:
OH 0 OH
大黄素
emodin-6-0-p-D-glucopymnoside
大
大黄素-6-0- 3 -D-吡喃葡萄糖苷
结论通过硅胶柱层析对大黄素转化产物进行分离和鉴定，分离得到两个化合物组分
A和组分B，其得率分别为7. 9%和5. 3% 。用HPLC和TLC分析绚分A为大黄素，波谱数据分析组分B为大黄素-6-0- 6 _D-毗喃葡萄糖苷。四、大黄素-6-O-P-D-吡喃葡萄糖苷的应用
大黄素对大肠埃希氏杆菌^sc力erj'c力j'a coJj'、月市炎链球菌5"treptococc"s p77eLffl o加'a、甲型、溶血f连球菌■SYrejDtococci/s / e/z oZ;^ic"5"、金黄色葡萄球菌5Ya/ 力j^ococc"s ai/re"s、白色念珠菌Ca/^iofe a^ica/AS、副伤寒沙门菌5"s^ o/7e^s /^rs化D力i "六菌种均无抑制作用。大黄素-6-0-e-D-吡喃葡萄糖苷对大肠埃希氏杆菌^c力eric/n'scWi、肺炎链球菌5"trept。cocGiAs p/7e"历oy5j'3、 甲型溶血链球菌5"trept。c。cc〃s / e历a/ytj'c"s1、金黄色葡萄球菌5tep力j^ococcy5 s"reiAS、白色念珠菌Cs/ 力Vs s^ic朋s五菌种均有不同程度的抑制作用，其中大黄素-6-0- e 吡喃葡萄糖苷对肺炎链球菌■ftrep&cocci/s p/7e咖0/7is的抑制效果最佳。可用于制备抑制上述病菌的药物。
以下为大黄素及大黄素-6-0- g -D-吡喃葡萄糖苷体外抑菌作用的实验情况。
通过体外抑菌实验，比较大黄素及大黄素-6-o-e -D-吡喃葡萄糖苷的抗菌作用强弱，
为生物转化提供实验依据。测定转化产物的抑菌活力可用牛津杯法(管碟法)，此方法是国内外测定抗生素效价通用方法，也是各国药典规定的方法。1、试验材料
1)受试药物大黄素，为黄色粉末，纯度为98.07% (大黄素购于西安中鑫生物技术有限公司，批号为060803);大黄素-6-0-D-吡喃葡萄糖苷，为黄色结晶，本发明自制，纯度>98%。
2) 阳性对照药阳性对照药选用氧氟沙星片(江西汇仁药业有限公司出品，批准文号为国药准字H20033100，批号0412037)。
3) 指示细菌菌株如表1:
表l供试菌株及其来源菌种编号及名称学名来源
YM1011大肠埃希氏杆菌
YM1019肺炎链球菌
YM1020甲型溶血链球菌Streptococcus /j柳o^"'ms云南省微生物研究
YM1031金黄色葡萄球菌所菌种保藏室提供
YM2005白色念珠菌
OTC 副伤寒沙门菌
4) 培养基营养琼脂培养基蛋白胨5克，牛肉膏3克，氯化钠5克，琼脂15克，加蒸馏水至1000毫升，15磅30分钟灭菌。
5) 主要仪器PYX-DHS-40x50隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，SCV-4A1型无菌工作台
(新加坡ESC0公司)；BCD-225E冰箱，青岛海尔冰箱厂，Sartorius Bs224s电子天平，测定抗生素效价用培养皿(直径90mm)，牛津杯。2、实验方法与结果
1) 受试药物的配制在电子天平上分别称取大黄素、大黄素-6-0-0-D-吡喃葡萄糖苷各100mg，用无菌水配至10mL，终浓度分别为10mg/mL，以此为最高浓度，依次倍比稀释为10mg/mL、 5mg/mL、 2. 5mg/mL、 1. 25mg/mL、 0. 625nig/mL。
2) 阳性对照药物配制将氧氟沙星片用研钵研细，在电子天平上分别称取10mg ，用无菌水配至10mL，终浓度分别为1. 0mg/mL
3) 菌悬液的制备把YM1011大肠埃希氏杆菌cWi， YM1019肺炎链球菌5Yreptococct/sp"e"迈o/iz'se， YM1020甲型溶血链球菌5Yreptococci/51力e迈aZ7t1cus， YM1031金黄色葡萄球菌Stap/u^ococeus auret^s， YM2005白色念珠菌Ca/7必cfe. s乃化朋s， OCC
MJ 5WW副伤寒沙门菌5^腳朋Ws/^s"。力i5菌种分别接种于普通营养琼脂培养基平板上，37。C培养18 25小时,用10ml灭菌生理盐水洗下菌苔，用灭菌生理盐水配制成每lmL约含9亿个细菌的浊浓度菌液(比浊法)。4) 含菌平板的制备取经消毒灭菌的直径为90mm的培养皿，将经高压蒸汽消毒灭菌后的营养琼脂培养基，冷却至40 45°C，无菌操作倾注于干热灭菌的培养皿内，每个平皿约15 20mL，即培养皿内培养基的厚度约为2 2.5mm，制备足够数量。待培养基凝固后，用灭菌吸管吸取上述各种菌液0. lmL注入平皿内，再用灭菌的涂布棒迅速将菌液涂抹均匀，制成含菌平板，以上操作均在无菌室进行。
5) 抑菌活性的测定采用牛津小杯定量扩散法，待培养基凝固后，在已凝固的平板上放上等距离放置经高压蒸汽灭菌的牛津杯六个，其中五个注入200yL的样品溶液，另一个注入200iiL的氧氟沙星对照品溶液，置37。C恒温培养箱中培养24h，按时取出，观察结果。用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小，取各样品的平均值作为最终结果。
3、试验结果
1)不同细菌浓度下，用牛津杯法测定大黄素的抑菌作用结果见表2:
表2大黄素抑菌作用测定结果(单位为mm)
菌种编号大黄素浓度(mg/mL)氧氟沙星浓度(mg/mL)
10 5 2.51. 250. 625 1
金黄色葡萄球菌一 — 一一—30.5
大肠埃希氏杆菌_ _ 一——38.0
副伤寒沙门菌— — 一一一 56.8
甲型溶血链球菌— — —一一58. 72
白色念珠菌— 一一一31.66
肺炎链球菌一 — 一一一55.63
注表中数据为抑菌圈直径(mm),大于等于14m判为有抑菌作用；"一"表示指示菌生长，无抑菌作用。2)不同细菌浓度下,用牛津杯法测定大黄素的抑菌作用结果见表3:
表3抑菌作用测定结果(单位为mm)_
菌种编号大黄素-6-o- e -D-吡喃葡萄糖苷浓度(mg/mU氧氟沙星浓度(mg/mL)
1052.51. 250. 6251
金黄色葡萄球菌21. 7921.9819.6113.03—30. 5
大肠埃希氏杆菌22. 7121. 1117. 0413. 32—38.0
副伤寒沙门菌——画一_56.8
甲型溶血链球菌26.9722.8319.99—一58. 72
白色念珠菌23. 6721. 7917. 6612. 06一31. 66
肺炎链球菌28. 8929. 1621. 1922.4419. 8655. 63
注表中数据为抑菌圈直径(mm)，大于等于14mm判为有抑菌作用；"一"表示指示菌生长，无抑菌作用。1)大黄素抑菌效果实验数据表明，六种不同浓度的大黄素对大肠埃希氏杆菌j&c力ei"J'c力is c。Ji、月市炎丰连球菌5Yrept。c。cciAS/OTeM7o"ia、甲型溶血f连球菌5Yre/^。c。cc〃51/ e/HO_/_KJ'cus、金黄色葡萄球菌5Yap力yJococcus aurei;s、 白色念珠菌副伤寒沙门菌5^历o/7eWs psj"s^7 力i S六菌种均无抑制作用，见表2。
2)大黄素-6-0-D-吡喃葡萄糖苷抑菌效果实验数据表明，六种不同浓度的大黄素-6-0- e -D-吡喃葡萄糖苷对大肠埃希氏杆菌^sc力eric/w's 、肺炎链球菌
6Yre/ t。c。cczA ; "ea/i7077is、 甲型溶血链球菌5Yrept。c。cc〃s力e历cJytic〃51、金黄色葡萄球菌5Ys/^/7ococc"s a,ei/s、白色念珠菌a^ica"s五菌种均有不同程度的抑制作用。但对副伤寒沙门菌fe^ OTe^spsrsti7^iS没有抑制作用，见表3。其中大黄素-6-0-e-D-吡喃葡萄糖苷对肺炎链球菌5Yr印tococc"s /wewMMis的抑制效果最佳，在其浓度0. 625mg/mL仍然具有抑菌效果；而在此浓度时大黄素-6-0- e -D-吡喃葡萄糖苷对其他五种菌种均已没有抑菌效果，见图4。其次大黄素-6-0-P-D-吡喃葡萄糖苷对甲型溶血链球菌5Yre/ t。c。cc〃s / e/z oZ/tic〃51大肠埃希氏杆菌^sc力eric力ia e。ii、 白色念珠菌Cs/ <iicfes7&'c朋s、甲型溶血链球菌5Yr印&coccus力e鹏&tJ'cw 四菌株有一定的抑菌效果，其最低抑菌浓度为2. 5mg/mL，见图4。
本发明与现有技术比较具有如下积极较果从中草药有效成分中找出有价值的新药和先导化合物,并对其进行结构改造是当今药物研究的方向之一，本发明利用微生物进行结构修饰与化学方法相比具有选择性高，副产物少；常温下可进行反应，安全性高，利于规模化生产，不使用大量有机溶剂，不会造成环境污染。
图1为本发明的大黄素转化产物的分离纯化流程图。图2为大黄素HPLC色谱图。
图3为本发明的大黄素-6-0-e-D-吡喃葡萄糖苷HPLC色谱图。图4为本发明的大黄素-6-0- 0 -D-吡喃葡萄糖苷抑菌作用。
具体实施方式
实施例1:
一、大黄素转化产物的培养1.实验材料1)药品与试剂
大黄素购于西安中鑫生物技术有限公司，纯度为98.07%，批号为060803。材料薄层层析板(硅胶G，青岛海洋化工厂)，层析硅胶G (200 — 300目，青岛美高
化工有限公司)。
试剂甲醇(分析纯，天津博迪化工有限公司)、三氯甲烷(分析纯，上海申博化工有限公司)、甲酸(分析纯，北京红星化工厂)、乙酸乙酯(分析纯，上海申博化工有限
公司)、丙酮(分析纯，天津博迪化工有限公司)。丽培养基(NH4)2S04 l.Og， K2HP047 . 0g，KH2P04 3 . 0g， MgS04.7H20 0. lg，柠檬酸钠0. 5g，葡萄糖30g，加蒸馏水至1000ml。2)主要仪器
质谱VGAutospec-3000型质谱仪。核磁共振DRX-500型超导核磁共振仪；DMSO (二甲基亚砜)作溶剂，TMS (四甲基硅烷)作内标；偶合常数J的单位为Hz。 YXQ-LS-50 SII型博讯立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯有限公司)、ZHWY-MB型恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)、HH-S数显恒温水浴锅(金坛市正基仪器有限)、SCV-4A1型无菌工作台(新加坡ESCO公司)、Laborata 4010型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。
2.大黄素转化产物的培养用菌种米根霉/PA/卵p"s ory幼e活化后接种到PDA斜面培养基，0-4'C保存；分别准确称量大黄素25mg，放入50个洁净的500mL葡萄糖瓶中，再分别倒入讓培养液100mL， 12rC高压灭菌20min;灭菌后待培养液凉至室温，在无菌操作条件下分别将米根霉菌种接入，放入恒温培养振荡器中，28°C， 180r/min振荡摇瓶培养，至培养液由桔红色混悬液变透明时，再培养24 h将摇瓶从恒温培养振荡器取出培养液。
二、大黄素转化产物的提取分离
1、 大黄素转化产物的提取将已发酵好的培养液合并收集，浓縮，用乙酸乙酯反复萃取三次，萃取液浓缩干燥，得2.4g萃取物。
2. 大黄素转化产物的分离取柱层析硅胶(200-300目)用氯仿甲醇=30:1拌和装
柱，装柱完毕后，用氯仿甲醇=30:1洗脱液平衡柱体(一般2倍柱体积)，萃取物(1.6g)
干法拌样上硅胶柱层析，以洗脱液梯度洗脱；根据情况分别来收集各馏分，然后根据TLC
分析结果进行各馏分间的合并和浓縮；以系统氯仿甲醇=30:1 20:1洗脱，得组分A
(127mg);以洗脱系统氯仿甲醇=10:1 6:1洗脱，得组分B(84mg)。
组分B的结构式为(大黄素-6-0- 0 -D-吡喃葡萄糖苷)
OH 0 OH三、大黄素-6-D-吡喃葡萄糖苷的应用
大黄素-6-0-e-D-吡喃葡萄糖苷对大肠埃希氏杆菌￡9cAerych'a co7厶肺炎链球菌 Streptococcus p"ei;7 70/ is、 甲型溶血f连球菌5Yreptoci9ccws力awo/7ticy51、金黄色葡萄球 菌5Y邻AF7ococcus aureus、白色念珠菌a乃j'cafls五菌种均有不同程度的抑制作 用，其中大黄素-6-0- P -D-吡喃葡萄糖苷对肺炎链球菌S&印tococc"s ，e咖如ia的抑制 效果最佳。
大黄素-6-D-吡喃葡萄糖苷可用于制备抑制上述病菌的药物肺宁康片，主要治 疗肺炎链球菌引起的感染性疾病(其制备方法和所用辅料可参照现有技术进行)。也可制 成妇炎康泡腾片，用于治疗女性阴道感染性疾病(其制备方法和所用辅料可参照现有技术 进行)。
权利要求
1、一种大黄素转化产物大黄素-6-0-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于按以下方法进行1)大黄素转化产物的培养用菌种米根霉活化后接种到PDA斜面培养基，0-4℃保存；将大黄素放入瓶中，倒入MM培养液，121℃高压灭菌20min；灭菌后待培养液凉至室温，在无菌操作条件下将米根霉菌种接入，放入恒温培养振荡器中，28℃，180r/min振荡摇瓶培养，至培养液由桔红色混悬液变透明时，再培养24h，取出培养液；2)大黄素转化产物的提取分离a. 大黄素转化产物的提取将上述培养液浓缩，用乙酸乙酯反复萃取三次，萃取液浓缩干燥，得萃取物；b. 大黄素转化产物的分离取柱层析硅胶200-300目，用氯仿:甲醇＝30:1拌和装柱，装柱完毕后，用氯仿:甲醇＝30:1洗脱液平衡柱体，萃取物干法拌样上硅胶柱层析，以洗脱液梯度洗脱，收集馏分、浓缩；以氯仿:甲醇＝30:1～20:1洗脱，得组分A；以氯仿:甲醇＝10:1～6:1洗脱，得组分B。
2、 按权利要求l的方法获得的大黄素转化产物的应用，其特征在于大黄素-6-0-|5-D-吡喃葡萄糖苷对大肠埃希氏杆菌￡sc/ e2^z'c力^^ co力'、肺炎链球菌分r印tococc"s jOTeLfflW/ ia、甲型、溶血链球菌5"tre/^ococcy51力(a77oZj^icus、金黄色葡萄球菌5Yap力j^oci9cc"s a"re"s、白色念珠菌C朋A'^ a^ic朋s五菌种均有不同程度的抑制作用，可用于制备抑制 上述病菌的药物。
全文摘要
本发明是一种大黄素转化产物大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备及应用。制备方法是通过大黄素转化产物的培养、大黄素转化产物的提取分离得到大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明利用微生物进行结构修饰与化学方法相比具有选择性高，副产物少；常温下可进行反应，安全性高，利于规模化生产，不使用大量有机溶剂，不会造成环境污染。大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对大肠埃希氏杆菌Escherichia coli、肺炎链球菌Streptococcus pneumonia、甲型溶血链球菌Streptococcus hemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、白色念珠菌Candida albicans五菌种均有不同程度的抑制作用，可用于制备抑制上述病菌的药物。
文档编号C12P19/00GK101457246SQ20081023377
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者赵荣华 申请人:云南中医学院