专利名称：一种用于防治小麦全蚀病的芽孢杆菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域，涉及一种用于防治小麦全蚀病的新菌株， 特别涉及一种用于防治小麦全蚀病的芽孢杆菌及其制备方法。
背景技术：
小麦全蚀病是侵染小麦根部的一种毁灭性病害，是世界各大小麦产区的重 要病害，在我国北方冬麦区和西北春麦区发病较严重，给农业生产造成了巨大
的损失。陕西省80年代在咸阳彬县等地已有小麦全蚀病发生，'90年代以来在关 中地区渭北旱塬、洛河下游、秦岭北麓23个县区都有全蚀病田块，病区呈扩大 的趋势。目前，由于没有抗病品种和特别有效的化学农药，并且轮作倒茬在小 麦大面积种植区应用也存在一定的局限性，所以生物防治便成为防治小麦全蚀 病的一种有效措施。
小麦全蚀病生物防治研究较多，而且已经有商品制剂应用于生产，但是至 今仍存在一些亟待解决的问题(1)长期以来，土壤和根际微生物是小麦全蚀 病生防菌的最主要来源，但这些微生物易受外界条件的影响，不容易在植物体 内定殖，防治效果不稳定等。(2)用荧光假单孢菌来防治小麦全蚀病的研究比 较多，作用机理研究已达到分子水平，但应用于实际生产上的并不多，主要是 由于生防制剂本身受环境条件，包括温度、湿度、降雨、光照等气候条件、土 壤理化性质、作物栽培条件以及植物生长状况等的影响较大，所以生防菌的筛 选应该尽可能与将来应用的环境条件相一致。 ，
植物内生菌是一种能在植物组织中定殖与运转，对植物无害甚至有益的微
4生物，由于它在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或 相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病 性。近几年，内生菌因其独特的优点在生物防治方面比根围、叶围等微生物更 具有应用潜力，从而成为生物防治的研究热点，为生物防治的应用开辟了新的
天地。本发明将报道一株内生细菌——芽孢杆菌EDR4菌株的发现及其防病作 用。
芽孢杆菌是一种比较常见的细菌，在植物病害防治的应用上备受重视。这 是因为其能与病原菌竞争根系中的营养，进而成为优势菌株，降低病原菌的危 害；加上可以产生内生孢子，在逆境下容易存活；且在产孢过程中能产生对多 种病原菌有抑制作用的抗生物质，应用性极广。目前，对芽孢杆菌的研究很多， 但是对于植物内生芽孢杆菌的研究却甚少。
发明内容
本发明的目的旨在探寻生物农药的新来源，利用植物内生菌资源而开发一 种可以用于小麦全蚀病防治的高效、可产业化生产的生防菌菌株，提供芽孢杆 菌EDR4菌株的筛选、鉴定方法。
实现上述发明目的的技术方案具体如下
一种芽孢杆菌(5a"7/"s平)EDR4菌株(以下简称为EDR4菌株)，于2007 年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2133，保藏单位地址北京市 朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
本发明EDR4菌株的方法，具体方法包括下列步骤 1)将采自我国陕西省田间自然生长的小麦根系用自来水冲洗后展开晾千，每株取1/4根系剪碎，各植株的根段样品混合后称取lg进行表面消毒；
2)将表面彻底消毒后的样品材料在消毒研钵中加9mL无菌水研磨至糊状， 取原液、稀释100倍液和1000倍液，分别摇匀后取200pL涂在加有多菌灵的 PDA平板上，每个处理重复3皿，在27'C下培养1周后，即可分离到EDR4菌 株。
所述的表面消毒的条件是:样品先用70。/。酒精处理60s，接着在浓度为3.125 XNaC10中处理6min，再用70%酒精处理30s，最后用无菌水冲洗3 5次。 所述的多菌灵是浓度为50pg/mL的25%可湿性粉剂。
检测表面消毒是否彻底的方法是将消毒后的无菌水取20Cl^iL涂在PDA平板上。
本发明的EDR4菌株经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特 性实验以及16SrDNA序列分析，该菌株鉴定为的一个新菌株(EDR4)，具有以 下特征-
(A) 形态特征菌体为杆状，2x8miti，革兰氏染色阳性，芽孢中生，周生
鞭毛；
(B) 培养特征菌落呈现圆形，表面有皱褶，无光泽，不光滑，菌落边缘 不规则扩展；
(C) 生理生化特征生长温度15 5(TC，最适生长温度为30'C;在pH为5.7 的培养基中可以生长，可以耐受10。/。的NaCl;可使石蕊牛奶培养基变红、胨化； 甲基红试验、H2S产生试验和纤维素分解试验均为阴性；接触酶试验、吲哚产生 试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验和 柠檬酸盐试验均为阳性；可利用肌醇、甘露醇、木糖'、果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘油。
(D) 16SrDNA序列分析结果在GeneBank中进行最大同源性比较，发现 16s rDNA测序结果与芽孢杆菌16s rDNA序列同源性达到100^。
本发明还有一个目的是提供EDR4菌株的菌体，它是按照下列方法制备的 将-8(TC保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28。C培养两天后，将其单 菌落接种到100mLLB培养液中，于37。C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然 后按照1%的种子液接种到lOOmL的LB培养液中，于28°C、 150rpm黑暗振荡 培养48h，发酵液经8000rpm离心20min后，所得沉淀即为EDR4菌株的菌体。
所述的NA培养基由10g蛋白胨、5g NaCl、 3g酵母粉、14g琼脂粉和 1000mL蒸馏水组成；LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、 1000mL 蒸馏水组成，且pH值为7.2。
本发明还有一个目的是提供EDR4菌株的抗菌活性物质，它是按照下列方 法制备的将-80。C保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28。C培养48h 后，将其单菌落接种到100mLLB培养液中，于37°C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然后按照l。/。的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28。C、 150rpm黑 暗振荡培养40 48h，所得菌液经8000rpm离心20min后，所得的无菌上清液用 80%饱和度硫酸铵盐析，4匸过夜，经12000rpm离心30min所得沉淀进行透析 并浓缩的物质。
本发明的EDR4菌株的抗菌活性物质成分的分析通过盐析，电泳和层析技 术所得，经鉴定为多种抗菌蛋白质。
本发明还有一个目的是提供EDR4菌株在防治小麦全蚀病、促进小麦生长 中的应用。本发明还有一个目的是提供EDR4菌株的菌体在防治小麦全蚀病、促进小 麦生长中的应用。
本发明还有一个目的是提供EDR4菌株的抗菌活性物质在防治小麦全蚀病、 促进小麦生长中的应用。
本发明的EDR4菌株有较強的抗全蚀病菌活性，具备了芽孢杆菌和内生菌作 为生防因子的双重特性，是一种很有开发潜力的生物农药，可用于小麦全蚀病 的防治。
本发明的EDR4菌株具有稳定的天然原料来源，菌种来源于小麦根部，筛选 方法简单；芽孢杆菌菌体和抗菌活性物质制备简单，操作方便，产品质量稳定， 低毒，对人畜无毒害，对农作物无药害，绿色环保，防治小麦全蚀病害效果显 著。
图l EDR4菌株的菌体及其抗菌活性物质对小麦全蚀病菌的抑制作用的对照图。
图2 EDR4菌株的菌体对小麦全蚀病的盆栽防治作用的对照图。
图3 EDR4菌株的菌体对小麦生长的促生作用的对照图。
图4 EDR4菌株的抗菌活性物质进行PAGE聚丙烯酰胺凝胶电图。
具体实施例方式
下面通过发明人给出的制备实施例和使用效果试验例来进一步详述本发 明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例l: EDR4菌株的分离、鉴定
小麦根采自陕西长武县自然生长的麦田，用自来水冲洗后展开晾干，每株取1/4根系剪碎，所有植株的根段样品各称取lg进行表面消毒(70%酒精 60s—3.125%NaC10中处理6min—70。/^酒精30s—无菌水冲洗3 5次)。将最后 一次冲洗过的无菌水取200pL涂在PDA平板上，用于捡测表面消毒是否彻底。 将表面消毒后的样品材料在消毒研钵中加9mL无菌水研磨至糊状，取原液、稀 释100倍液和1000倍液，分另lj摇匀后取20(VL涂在加有多菌灵(5(Vg/mL， 25% 可湿性粉剂，浙江一帆农化厂生产)的PDA平板上，每个处理重复3皿，在27°C 下培养1周后，可分离到EDR4菌株，所得菌株采用甘油法保藏于-80。C冰箱。
将分离到的EDR4菌株在NA培养基上活化后，在100mL LB培养液 (Luria-Bertani: 10g蛋白胨；10g酵母粉；5gNaCl; lOOOmL蒸馏水，调pH=7.2) 中接种两环，于37°C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然后按照1%的种子液 接种到100mL的LB培养液中，于28t:、 150rpm黑暗振荡培养48h，发酵液经 8000rpm离心20min后，沉淀用无菌水制成孢子悬浮液，浓度为10S l()UcfU/mL。 将内生细菌的孢子悬浮液30mL同时浇灌于刚播种并接有全蚀病菌的花盆中，以 只接种全蚀菌接种体作为发病对照，每个处理3个重复。于15。C放置3 4周后， 用水冲去植株根部的沙土，调查每株的根长、株高、根鲜重、根干重、地上部 鲜重、地上部干重以及发病情况，用病根面积占总根面积的百分率作为严重度 指标，严重度分为5级。统计病株发病率，计算病情指数，并利用SAS分析软
件进行t测验。其中病情指数-i:(各级病株数x代表数值)/调查总株数x发病最重
级的代表数值xlOO
根据内生EDR4菌株对小麦全蚀病的活体试验调査结果，筛选到一种高效 防病的活性菌株，经形态、染色、生理生化和16SrDNA序列分析，鉴定为芽 孢杆菌EDR4菌株。实施例2: EDR4菌株菌体的制备方法
将-8(TC保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28'C培养2d后，挑取其单菌落到lOOmLLB培养液(Luria-Bertani: 10g蛋白胨；LOg酵母粉；5gNaCl;lOOOmL蒸馏水，调pH-7，2)中，于37。C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h,然后按照P/。的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28"C、 150卬m黑暗振荡培养48h，所得菌液经8000rpm离心20min后，所得沉淀即为EDR4菌株的菌体。
实施例3: EDR4菌株的抗菌活性物质的制备方法
将-8(TC保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28。C培养两天后，挑取其单菌落到lOOmLLB培养液(Luria-Bertani: 10g蛋白胨；10^酵母粉；5gNaCl;lOOOmL蒸馏水，调pH-7,2)中，于37。C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然后按照l。/。的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28'C、 150rpm黑暗振荡培养48h，所得菌液经8000rpm离心20min后，所得的无菌上清液用80%饱和度硫酸铵盐析，4'C过夜，经12000rpm离心30min所得沉淀进行透析并浓縮即为抗菌活性物质。
试验例l: EDR4菌株菌体和抗菌活性物质离体抑菌活性实验实施例2中所述的EDR4菌株菌体用无菌水悬浮后，取O. lmL接种于PDA平板边缘，全蚀病菌菌饼((1^4mm)置PDA平板中央，每个处理重复3皿。25'C培养3d后每天测量病原真菌直径，并计算抑菌率。对照不接种细菌菌体。
抑制率(％)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径><10()%，菌落直径单位(cm)
实施例3中所述的抗菌活性物质用细菌过滤器过滤，取滤液0.5mL加入到50mL放有2个小麦全蚀病菌菌饼(①-4mm )的PD培养液中，每处理重复三瓶，20°C、 100rpm黑暗振荡培养7d后，称量各瓶菌丝干重并计算抑制率。对照加入灭菌的LB培养液。
抑制率(％)=(对照菌丝干重一处理菌丝干重)/对照菌丝干重><100%，菌丝干重单位(g)
结果表明，EDR4菌株菌体和抗菌活性物质对小麦全蚀病菌生长的抑制作用显著(图1， A: EDR4菌株菌体对小麦全蚀病菌生长的抑制作用，B:抗菌活性物质对小麦全蚀病菌生长的抑制作用，a:清水对照，b:菌体或抗菌活性物质处理(浓度0.2mL/mL))，抑制率分别为71.42%和53.63%。
试验例2:活性物质的分析
实施例3中所述的抗菌活性物质进行PAGE聚丙烯酰胺凝胶电图(图4)，对其中几条明显的条带切胶回收进行抑菌活性实验，结果表明多种蛋白质具有抑制全蚀菌生长的活性。
试验例3: EDR4菌株菌体防治小麦全蚀病的盆栽实验
将内生细菌EDR4在KB培养基上活化后，在lOOmL LB培养液(Luria-Bertani: 10g蛋白胨；10g酵母粉；5gNaCl; lOOOmL蒸馏水，调pH=7.2)中接种两环，于37°0、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然后按照1%的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28'C、 150rpm黑暗振荡培养48h，发酵液经8000rpm离心20min后，沉淀用无菌水制成孢子悬浮液，浓度为108 109cfUAnL。将内生细菌的孢子悬浮液30mL同时浇灌于刚播种并接有全蚀病菌的花盆中，以只接种全蚀菌接种体作为发病对照，每个处理3个重复。于15'C放置3 4周后，用水冲去植株根部的沙土，调查每株的根长、株高、，根鲜重、根干重、地上部鲜重、地上部干重以及发病情况，用病根面积占总根面积的百分率作为严重度指标，严重度分为5级。以浇灌清水为空白对照，小麦种子量1%的25%多菌灵粉剂拌种处理为药剂对照，结果计算病情指数和防效，进行方差分析。
病情指数=2(各级病株数x代表数值)/(调査总株数x发病最重级的代表数值)xl00
防治效果(％)=(对照组病情指数一处理组病情指数)/对照组病情指数x100。/0结果表明，菌株EDR4菌体对小麦全蚀病的防治效果可达到57.33X，较药剂对照的防效高16.78%;根部、地上部重量以及病情指数与空白对照在0.05水平上差异显著，而与药剂对照间差异不显著(图2) a:清水+小麦全蚀病菌接种体；1):25%多菌灵可湿性粉剂(按照1%种子量拌种)+小麦全蚀病菌接种体;(:EDR4菌株菌体(浓度108 109cfU/mL) +小麦全蚀病菌接种体。
试验例4: EDR4菌株菌体防治小麦全蚀病的田间小区试验
采用随机区组分析，3个重复，每个小区面积为lm2，种5行，每行播种2.5g种子和5g小麦全蚀病菌接种体，同时浇灌EDR4菌株的菌体(用无菌水悬浮)500mL，浓度为108~109dWmL。以只接种全蚀病菌的为发病对照，不接种的为空白对照，只接种内生细菌的生防菌对照。分别在小麦苗期、拔节期和乳熟期，调查发病株数，计算发病率和防治效果。同时在小麦乳熟期，调査穗数、穗粒数、白穗数、计算产量、千粒重等。
在小麦播种后10d对试验小区麦田的出苗情况进行了调査，结果发现，没有接种Ggt的健康和生防菌对照出苗都很好，麦苗生长健壮，叶色较绿，接种全蚀病菌的出苗比健康对照稀疏，叶色有的发黄。
在小麦拔节期对植株的生长情况进行调査发现，没有接种Ggt的健康和生防菌对照明显比接种全蚀病菌的发病对照和生防菌处理长势好，植株健壮。只接种内生细菌的比健康对照略微高一些，但没有明显的差异。用生防菌处理的
小区发病率较发病对照要小，其中EDR4菌株菌体处理的防治效果达到21.73%
(表l)o
表l内生细菌EDR4菌株在小麦拔节期对植株的影响
处理 株高(cm)'发病率(％)病情指数 防治效果(％)
发病对照67.9383.3331.94—
EDR4+Ggt76.0777.7825.0021.73
健康对照70.8055.5615.28一
EDR474.7350.0019.44一
EDR4菌株的菌体在小麦乳熟期对植株的株高、平均穗粒数、千粒重和产量 都有不同的影响。内生细菌处理与发病对照相比，平均株高、平均穗粒数、千 粒重和产量都有不同程度的增加。只接种生防菌的对照和健康对照相比，平均 株高和千粒重也都有所增加，但是与对照差异不显著(表2)。
表2内生细菌EDR4菌株在小麦乳熟期对植株的影响处理株高(cm)平均穗粒数千粒重(g)产量(g)
发病对照61.934.931.8568.3
EDR4+Ggt 75.437.834.0616.7
健康对照70.439.333.6675.0
EDR475.339.134.7663.3
试验例5: EDR4菌株菌体对小麦生长的促进作用
盆栽方法同试验例3，处理仅用芽孢杆菌菌体(浓度108 109cfU/mL)，对 照不做任何处理。结果表明处理的小麦苗在根长、苗高、干重和湿重上都较对 照要生长得好(图3)。 a:清水对照；b: EDR4菌株菌伴(浓度108 109cfli/mL)处理。
权利要求
1. 芽孢杆菌(Bacillus sp.)EDR4 CGMCC No.2133。
2. 制备权利要求1所述的芽孢杆菌EDR4菌株的方法，其特征在于，具体包 括以下步骤1) 将来自我国陕西省田i司自然生长的小麦根系用自来水冲洗后展开晾干， 每株取1/4根系剪碎，各植株的根段样品混合后称取lg进行表面消毒；2) 将表面消毒后的样品材料在消毒研钵中加9mL无菌水研磨至糊状，取 原液、稀释100倍液和1000倍液，分别摇匀后取200jiL涂在加有多菌灵的PDA 平板上，每个处理重复3皿，在27"C下培养1周后，可分离到EDR4菌株，于 -80°(:保藏。
3. 根据权利要求2所述的制备芽孢杆菌EDR4菌株的方法，其特征在于， 所述的表面消毒的条件是样品先用70%酒精处理60s，接着在浓度为3.125% NaC10中处理6min，再用70%酒精处理30s，最后用无菌水冲洗3 5次。
4. 根据权利要求2所述的制备芽孢杆菌EDR4菌株的方法，其特征在于 所述的多菌灵是浓度为50|ig/mL的25%可湿性粉剂。
5. 权利要求l所述的芽孢杆菌EDR4菌体/其特征在于，它是按照下列方 法制备的将一80。C保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28。C培养2d 后，将其单菌落接种到lOOmLLB培养液中，于37°C、 150rpm黑暗振荡培养18 24h，然后按照lQ/。的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28。C、 150rpm黑 暗振荡培养48h，发酵液经8000rpm离心20min后，所得沉淀物即为芽孢杆菌 EDR4菌株的菌体。所述的LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、 1000mL蒸馏水组成，且pH值为7.2。
6. 权利要求1所述的芽孢杆菌EDR4的抗菌活性物质，其特征在于，它是 按照下列方法制备的将-8(TC保藏的EDR4菌株接种在NA培养基上，25 28°C 培养48h后，将其单菌落接种到100mLLB培养液中，于37"C、 150rpm黑暗振 荡培养18 24h，然后按照1%的种子液接种到lOOmL的LB培养液中，于28'C、 150rpm黑暗振荡培养40 48h，所得菌液经8000rpm离心20min后，所得的无 菌上清液用80%饱和度硫酸铵盐析，4'C过夜，经12000rpm离心30min所得沉 淀进行透析并浓缩的物质。
7. 权利要求1所述的芽孢杆菌EDR4在防治小麦全蚀病、促进小麦生长中 的应用。
8. 权利要求5所述的芽孢杆菌EDR4菌体在防治小麦全蚀病、促进小麦生 长中的应用。
9. 权利要求6所述的芽孢杆菌EDR4的抗菌活性物质在防治小麦全蚀病、 促进小麦生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)EDR4，该菌株于2007年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2133；本发明还公开了该菌株的分离与鉴定方法、菌体制备方法、抗菌活性物质的制备方法；还公开了EDR4菌株及其菌体和抗菌活性物质在防治小麦全蚀病、促进小麦生长中的应用。本发明的EDR4菌株具有稳定的天然原料来源，筛选方法简单，操作方便，产品质量稳定，无毒副作用，绿色环保，而且对防治小麦全蚀病害效果显著，便于推广应用。
文档编号C12N1/20GK101486983SQ20091002111
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者乔红萍, 冰 刘, 康振生, 黄丽丽 申请人:西北农林科技大学