专利名称：一种高产d-核糖且联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一种高产D-核糖且联产乙偶 姻的枯草芽孢杆菌。
背景技术：
D-核糖是一种具有重要生理生化功能的五碳糖，对于生理活性物质ATP，RNA, NAD+,NADPjFAD和CoA来说，以核糖基团形式存在的D-核糖是一种重要组成部分。D-核糖 广泛的应用于食品、医疗和制药领域，具有巨大的经济价值。D-核糖可以用来生产增味剂 (5' _核苷酸)和核黄素(维生素B2)、药物制剂、饲料、化妆品和食品的添加剂。最近更多 的研究，致力于将其化学转化为抗病毒和抗癌症药物。最新研究发现对于纤维肌痛和慢性 疲劳的病人而言，D-核糖有益于精神平静从而可以维持睡眠。乙偶姻(Acetoin)，即3_羟基丁酮(3-Hydroxybutanone)、乙酰甲基甲醇 (Acetylmethylcarbinol)，天然存在于玉米、葡萄、可可、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，是 一种应用广泛的食用香料，其主要应用是用于奶油、乳品、酸奶等香料的生产。作为一种食 用香料，我国GB2760-86规定为允许食用，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。此 外，乙偶姻作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、化工和IT等行业。D-核糖和乙偶姻的生产方法主要有三种酶法、化学合成法和微生物发酵法。酶 法水解酵母RNA得到D-核糖，酶法转化丁二酮生成乙偶姻。化学合成D-核糖主要是通过 阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖酸化学合成，合成乙偶姻主要采用两种方法一种是通过 丁二酮部分加氢还原；另一种是通过2-3 丁二醇选择性氧化。但是，这些方法都伴随很多问 题，例如回收率低、产率低、高消耗、高污染，而且产品质量很难达到目前3-羟基丁酮的最 大消费领域——食用香料的要求，尤其化学合成工艺的原料来源都是不可再生资源石油， 这些都严重制约了其更大规模的发展。发酵法高产D-核糖及联产乙偶姻避免了这些问题， 以期待减轻资源与环境压力，提高产品质量。1966年开始用微生物生产D-核糖。从1970年 开始，就通过转酮醇酶缺陷型芽孢杆菌来发酵产D-核糖。80年代，Kishimoto等在专利JP 01/157，369中报道利用短小芽孢杆菌转酮醇酶缺陷型菌株，在添加芳香族氨基酸的情况下 摇瓶培养55小时，D-核糖的积累量可达92. lg/L。De wulf等在(J. Appl. Microbiol.，83， 25-30，1997)文献中报道利用转酮酶缺陷型的枯草芽孢杆菌ATCC 21951，以100g/L葡萄糖 和50g/L的葡萄糖酸为混合碳源进行发酵，得到45g/L的D-核糖。邓崇亮等人于1997年利 用紫外法和化学诱变法得到枯草芽孢杆菌SM-18，选育得到莽草酸缺陷型菌株JSIM-1018 高产菌，摇瓶发酵产D-核糖达92g/L。而无论是化学合成法还是酶转化法生产乙偶姻都是 以丁二酮或2，3_ 丁二醇等为原料，这两种物质也是合成香料而非大宗化工产品，原料来源 及价格都受到限制，这可能也是目前3-羟基丁酮没有得到较好研究开发的原因之一，因此 积极开发以糖质为原料利用微生物发酵生产3-羟基丁酮有望改变这一局面。综上所述，现有的技术都是利用枯草芽孢杆菌培养来单独生产D-核糖，涉及到的 乙偶姻都是作为副产物进行代谢调控理论方面的研究，或者是单独生产乙偶姻，都存在原料利用率低、成本高等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产D-核糖且联产乙偶姻的枯草芽孢杆 菌，该菌株能在高产D-核糖的同时乙偶姻的产量也能达到较高的水平。本发明还要解决的技术问题是提供利用上述菌株进行发酵生产D-核糖且联产乙 偶姻的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下本发明人实验室将一株转酮酶缺陷型枯草芽孢杆菌野生菌经低能离子束后筛选 出一株高产D-核糖且联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)FT-1507,目前该 菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记入册的编号是CGMCC No. 3720，保藏日期是2010年04月08日。以此菌作为生产菌株。CGMCC No. 3720菌株具有下述性质1、菌落形态学特征在营养琼脂上，30°C培养48h出现小菌落(Φ = 0.8 Imm)，菌落呈圆形，表面粗 糙、干燥，中央凸起，不透明，边缘不整齐。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化 很小。2、生理与生化特性a.革兰氏染色阳性，好氧；b.丧失转酮酶活性；c.具有较高的葡萄糖脱氢酶或葡萄糖酸激酶活性；d.丧失孢子形成能力；e.耐高浓度的D-葡萄糖、D-核糖；f.培养温度28 37°C，最适温度为37°C ；g.在pH6. 5 7. 2范围内生长。3、营养特征枯草芽孢杆菌FT-1507的培养基可以利用多种化合物作为碳源，这些物质可以单 独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中 各组分用量配比按各组分与培养基重量体积百分比计为碳源用量为培养基的1 22%， 氮源用量为培养基的0. 1 4%，无机盐用量为培养基的0.001 2%，其余为水。碳源一 般采用葡萄糖、木糖、蔗糖和糖蜜等，氮源可采用玉米浆、酵母粉、(NH4)2SO4、酵母膏、蛋白胨 和尿素等，培养基中还包括钾盐、钠盐、硫酸盐和碳酸盐等常用的无机盐类。利用上述的枯草芽孢杆菌CGMCC No. 3720发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法， 在包含碳源、氮源和无机盐的发酵培养基中添加山梨酸或草酸，将保藏号为CGMCC No. 3720 的菌株接种于上述发酵培养基中发酵生产D-核糖且联产乙偶姻。其中，所述的碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖和糖蜜中的任意一种或几种，浓度为10 220g/L，优选浓度为50 200g/L。其中，所述的氮源为玉米浆、酵母粉、(NH4)2SO4、酵母膏蛋白胨和尿素中的任意一种或几种，浓度为1 40g/L，优选浓度为3 20g/L。其中，所述的无机盐为钾盐、钠盐、硫酸盐和碳酸盐中的任意一种或几种，浓度为 0. 01 20g/L，优选氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，硫酸锰、碳酸钙，优选浓度为0. 05 10g/L。其中，所述的山梨酸的浓度为0. 1 4. Og/L，优选0. 21 3. Og/L。其中，所述的草酸的浓度为0. 5 10. Og/L，优选2 8. Og/L。其中，上述的发酵生产条件为接种量5 30% (ν/ν)，初始pH为5. 5 7. 5，温度 25 40°C，培养时间为58 80h。优选范围为接种量10 20% (ν/ν)，初始pH为6. 8 7. 2，温度30 37°C，培养时间为65 72h。有机酸调控原理有机酸的酸分子在发酵过程中可以在细菌细胞内得到溶解，酸 分子释放羧基的质子，这会影响胞内PH的动态平衡，为了重新达到pH的中性，细菌就会释 放积累的质子，在ATP酶的作用下ATP水解，加速这个释放过程，于是细胞内对ATP的需求 急剧增加。为了满足对ATP的需求，D-葡萄糖会迅速的进入PPC途径的氧化阶段，因为在 D-核糖-5-磷酸去磷酸的过程中会产生ATP。因此，大量的D-核糖-5-磷酸会积累在TKT 转化的节点上。在去磷酸化后，D-核糖的产量高于培养基中未加入外源有机酸的产量。有益效果本发明具有如下优势(1)与传统的辐射法及化学诱变剂相比，离子束诱变具有损伤轻、突变率高、突变 谱广、遗传稳定、易于获得理想新品种等特点。(2)本发明筛选到一株高产D-核糖联产乙偶姻的生产菌，该菌能利用多种碳源很 氮源发酵生产D-核糖并联产乙偶姻，操作方便简单，培养条件粗放。(3)采用本发明方法选育出的高产D-核糖联产乙偶姻的菌种，具有高产性状稳 定，不易丢失的优点，经过30代以上转接，产物产量保持稳定。(4)本发明中通过在发酵培养基中添加有机酸，例如山梨酸或草酸，使D-核糖的 产量比出发菌提高了 64. 5g/L，乙偶姻提高了 17. 3g/L。该菌具有较高的合成D-核糖和乙 偶姻的能力，其中乙偶姻的还原态副产物2，3_ 丁二醇的产量很低，为4. 2g/L左右。(5)本发明筛选到的D-核糖高产菌还能副产高价值的乙偶姻，提高了产品生产效率。(6)对发酵代谢过程的控制简单易行，易于产业化。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例使用的分析方法如下发酵液中的产物D-核糖、乙偶姻以及各种副产物如乙酸、乳酸和2，3- 丁二醇等 采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定。色谱柱为Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)，柱温 为65°C，检测器为Agilent G1362A折光示差检测器，流动相为0. 005mol/L H2SO4,流速为 0. 4mL/min，进样量为20 μ L。重蒸水配制不同浓度的各种产物标准溶液，根据峰面积和各种 产物标准溶液的浓度关系制作标准曲线，发酵样品经离心稀释后根据峰面积和标准品计算
5各种产物的含量。实施例1 斜面培养基5g/L D-山梨醇，10g/L蛋白胨，2g/L酵母膏，2g/LNaCl，20g/L琼脂， pH 6. 9。种子培养基20g/L葡萄糖，20g/L玉米浆，3g/LK2HP04，lg/LKH2P04, lg/L酵母膏，pH 6. 9。发酵培养基200g/L葡萄糖，8g/L 玉米浆，4g/L 酵母粉，7g/L (NH4) 2S04，0. 05g/ LMnSO4, 3g/LCaC03,1. 5g/L山梨酸，pH 6. 9 ；5L发酵罐中装发酵培养液3L，121°C灭菌15分钟。将枯草芽孢杆菌CGMCC No. 3720接两环于种子培养基中，36°C培养18小时，获得 成熟的种子液，将种子液按发酵液体积的10% (ν/ν)的接种量接入冷却后的发酵培养液 中，溶氧控制为1. lvvm, 600rpm, 37°C下发酵72h，最后得到的发酵液中D-核糖含量为113g/ L，乙偶姻含量为30. 5g/L，分别比仅利用普通培养基(即不添加山梨酸，但其它组分相同) 时的产量提高了 29. 57%和35. 56%。对比例1 与实施例1的方法相同，所不同的是生产菌株为未经诱变的原始出发菌株，所用 的培养基为未添加山梨酸的普通培养基，D-核糖产量为48. 5g/L，乙偶姻产量为13. 2g/L。对比例2:与实施例1的方法相同，所不同的是生产菌株为未经诱变的原始出发菌株。结果 D-核糖产量为56g/L，乙偶姻产量为15. 12g/L，分别比仅利用普通培养基时(即不添加山梨 酸，但其它成分相同)的产量提高了 15. 46%和14.55%。实施例2 发酵培养基150g/L葡萄糖，50g/L木糖，5g/L玉米浆，6g/L酵母膏，5g/ L(NH4)2SO4jO. 05g/L MnSO4, 2g/LCaC03，0. 4g/L 山梨酸，pH 6. 9 ;5L 发酵罐中装发酵培养液 3L，121°C灭菌15分钟。配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10% (ν/ ν)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，溶氧控制为lVVm，500rpm，37°C下发酵72h，最后 得到的发酵液中D-核糖含量为98. 51g/L，乙偶姻含量为29. lg/L，分别比仅利用普通培养 基(即不添加山梨酸，但其它组分相同)时的产量提高了 12. 95%和29.33%。实施例3 发酵培养基20g/L葡萄糖，20g/L糖蜜，lg/L玉米浆，0. 5g/L蛋白胨，0. 5g/L酵母 粉，0. 5g/L (NH4)2SO4jO. 02g/L MnSO4,0. 01g/LMgS04,0. 01g/LCaC03, 3. 5g/L 山梨酸，pH 6. 9 ； 5L发酵罐中装发酵培养液3L，121°C灭菌15分钟。配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10% (ν/ ν)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，溶氧控制为lVVm，550rpm，37°C下发酵70h，最后 得到的发酵液中D-核糖含量为91. 4g/L，乙偶姻含量为25. 5g/L，分别比仅利用普通培养基 (即不添加山梨酸，但其它组分相同)时的产量提高了 4. 80%和13. 33%。实施例4 发酵培养基100g/L葡萄糖，50g/L糖蜜，50g/L木糖，7g/L玉米浆，5g/L酵母粉，
67g/L (NH4)2SO4jO. 05g/L MnSO4, 3g/LCaC03,4g/L 的草酸，pH 6. 9 ；5L 发酵罐中装发酵培养液 3L，121°C灭菌15分钟。配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10% (ν/ ν)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，溶氧控制为1. lVVm，500rpm，37°C下发酵68h，最 后得到的发酵液中D-核糖含量为103. 2g/L，乙偶姻含量为26g/L，分别比仅利用普通培养 基(即不添加草酸，但其它组分相同)时的产量提高了 18. 34%和15. 56%。实施例5 发酵培养基200g/L葡萄糖，15g/L木糖、10g/L玉米浆，6g/L酵母粉，4g/L尿素， 5g/L (NH4)2SO4jO. 02g/L MnSO4,0. 01g/L MgSO4,0. 01g/LCaC03,8. 6g/L 草酸，pH 6. 9 ；5L 发酵 罐中装发酵培养液3L，121°C灭菌15分钟。配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10% (ν/ ν)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，溶氧控制为1.3料111，55011)111，371下发酵7211，最 后得到的发酵液中D-核糖含量为95. 5g/L，乙偶姻含量为24. 2g/L，分别比仅利用普通培养 基(即不添加草酸，但其它组分相同)时的产量提高了 9. 5%和7. 56%。
权利要求
一株高产D 核糖且联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCC No.3720，保藏日期是2010年04月08日。
2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其具 体的步骤为在包含碳源、氮源和无机盐的发酵培养基中添加山梨酸或草酸，将保藏号为 CGMCC No. 3720的菌株接种于上述发酵培养基中发酵生产D-核糖且联产乙偶姻。
3.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其 特征在于所述的碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖和糖蜜中的任意一种或几种，浓度为10 220g/ L0
4.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其 特征在于所述的氮源为玉米浆、酵母粉、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨和尿素中的任意一种或几 种，浓度为1 40g/L。
5.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方 法，其特征在于所述的无机盐为钾盐、钠盐、硫酸盐和碳酸盐中的任意一种或几种，浓度为 0. 01 20g/L。
6.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其 特征在于所述的山梨酸的浓度为0. 1 4. Og/L。
7.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其 特征在于所述的草酸的浓度为0. 5 10. Og/L。
8.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法，其 特征在于所述的发酵生产条件为接种量5 30% (ν/ν)，初始ρΗ为5. 5 7. 5，温度25 40°C，培养时间为58 80h。
全文摘要
本发明公开了一株高产D-核糖且联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCC No.3720，保藏日2010年04月08日。本发明还公开了利用上述的枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖且联产乙偶姻的方法。本发明筛选到的菌株能利用多种碳源和氮源发酵生产D-核糖并联产乙偶姻，操作方便简单，培养条件粗放，易于产业化。本发明通过在发酵培养基中添加有机酸，使D-核糖的产量比出发菌提高了64.5g/L，乙偶姻提高了17.3g/L。该菌具有较高的合成D-核糖和乙偶姻的能力，其中乙偶姻的还原态副产物2，3-丁二醇的产量很低。
文档编号C12P7/26GK101974444SQ20101017137
公开日2011年2月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者应汉杰, 房婷, 柏建新, 熊健, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学