专利名称：一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及布鲁菌的检测分析技术，尤其公开了公开一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
布鲁菌病是由布鲁菌(Brucella)引起的一种全世界范围的人兽共患传染病，被 世界动物卫生组织(0IE)列为B类动物疫病。主要引起许多家畜和野生动物流产，人类通 过食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接与感染动物或尸体接触而感染，临床上表现为发 热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍、关节炎等非特异性症状。布鲁 氏菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌，传统上可分为6个种，即羊种布鲁菌(B. melitensis)， 牛种布鲁菌(B. abortus)，猪种布鲁菌(B. suis)，绵羊附睾种布鲁菌(B. ovis)，沙林鼠种布 鲁菌(B. neotomae)和犬种布鲁菌(B. canis)。其中，羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌 是直接危害人类健康，严重困扰畜牧业发展的主要病原菌，给奶牛业造成巨大的经济损失。目前，布鲁菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试 管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等，用常规方法 分离鉴定病原条件要求苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。RBT和SAT特异性不高、敏 感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR方法是这些方 法中特异性最强、敏感性最高。在欧美的一些发达国家已经把PCR作为布鲁菌病病原诊断 的一种工具。国内对于布鲁菌病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还 是空白，对该病的检测仍然采用RBT、SAT和CFT，远不能满足实际需要。因此，开发简便易 行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。
发明内容
本发明公开了一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，适用于牛粪便样 品中布鲁菌定性检测。本发明提供的快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒包括由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁菌BCSP31基因特异性引物对和阴 性质控标准品组成；其中，正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘；反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘；标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因的301个碱基的核苷酸片段构成的 pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5ci中增殖。PCR 反应液由正反向引物 FBCSP31 和 RBCSP31，10 XPCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及无 菌双蒸水组成。布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatcca gaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagagga ctggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggag cgagctttgc-3'本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)DNA 提取液包括如下组分PBS(137mM Nacl，2. 7mM Kcl, lOmM Na2HP04, 2mMKH2P04, PH7. 4)，10XTE (0. 1M Tris_HCl，0. 1M EDTA, pH 8. 0)；2)PCR 反应液由正反向引物 FBCSP31 和 RBCSP31，10XPCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及 无菌双蒸水组成；3)标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片 段构成的PMD-18重组质粒；4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘5)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。本发明定性检测布鲁菌的方法，包括以下步骤1)样本的预处理，提取DNA ；2)将DNA和阳性标准品分别加入到反应液的PCR反应体系中，进行PCR检测；取 PCR产物，以琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察301bp的扩增条带。以下实验表明试剂盒可以快速检测布鲁菌1)取0. 5g牛粪便样品于2mL离心管中，加lmL PBS缓冲液(137mM Nacl, 2. 7mMKcl, 10mM Na2HP04, 2mM KH2P04, PH7. 4)，充分振荡摇勻 5min，500r/m 离心 5min，收集 上清液于另一 2mL离心管中，此步骤重复2次。上清液13，000r/m离心2min，弃上清，收集 沉淀，用 lOOiiL 10XTE(0. 1M Tris-HCl，0. 1M EDTA PH8. 0)悬浮沉淀，先冰浴 5min，然后 100°C煮沸lOmin, 13,000r/m离心2min，取上清1 u L，用于PCR扩增。2)分别取PCR反应液各49 u L，取第(1)步所得布鲁菌DNA和布鲁菌阳性标准模 板各IP L，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在PCR仪上平行做PCR检测。循环 条件为95°C预变性5min，94°C变性30sec、65°C退火30sec、72°C延伸30sec，扩增31个循 环。最后72°C延伸5min。3)取L PCR产物，以1 %琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察 301bp的扩增条带。重复试验3次，所得检测结果都相同，说明不同批次之间的检测结果具有可比性 和良好的重复性。见图1。从上述实例可以说明，PCR方法重复性好，而且PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检 测仅需3 5个小时就能完成。本发明与现有技术相比其积极效果在于该PCR检测试剂盒实用性强，可直接检测牛粪便样品中的布鲁菌，3 5小时内快 速出结果、灵敏度高达10pg基因组，装配成试剂盒使用安全，特异性好，使用步骤简单，可 重复性好，可以对牛粪便样品中的布鲁菌进行定性检测，可以替代传统的病原学和血清学
4方法。
图1为布鲁菌标准阳性模板PCR扩增图；图中，1是DL2000DNA marker，2 5分别为牛种布鲁菌544A、牛种布鲁菌104M、羊 种布鲁菌16M、猪种布鲁菌S2pMD-18重组质粒的PCR扩增结果。图2为PCR试剂盒的特异性鉴定图；图中，1是DL2000DNA Marker ;2是牛种布鲁菌544A ;3是牛种布鲁菌104M ;4是羊 种布鲁菌16M ；5是猪种布鲁菌S2 ；6是鼠伤寒沙门氏菌；7是金黄色葡萄球菌；8是铜绿假 单胞菌；9是猪链球菌；10是大肠杆菌；11是肺炎克雷伯氏菌；12是变形杆菌；13是多杀性 巴氏杆菌；14是小肠结肠炎耶尔森菌；15是蜡样芽胞杆菌；16是猪胸膜肺炎放线杆菌血清 1型；17是猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型；18是猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型；19是猪胸 膜肺炎放线杆菌血清5型；20是大肠杆菌0157 :H7 ；21是纯水对照。图3为PCR试剂盒的敏感性鉴定图；图中，1是DL2000DNA Marker ；2 5是倍比稀释牛种布鲁菌544A基因组DNAPCR 扩增图，2 的浓度为 lX104pg ；3 是 lX103pg ；4 是 lX102pg ；5 是 lXlObg。图4为临床牛粪便样品的PCR检测结果；1是DL2000 DNA Marker ；2是阳性对照； 3 17是临床牛粪便样品，18是纯水对照。
具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实验材料牛种布鲁菌544A(B. abortus 544A)、牛种布鲁菌104M(B. abortusl04M)、羊种布鲁菌 16M(B. melitensis 16M)、猪种布鲁菌 S2 (B. suis S2)灭活 菌液由中国地方病第一研究所提供，限制性内切酶、PMD18T克隆载体购自Takara公司， 鼠伤寒沙门氏菌(CVCC541)、猪链球菌(CVCC606)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型 (CVCC259)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型(CVCC260)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 血清3型(CVCC261)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型(CVCC263)均购自中国兽药监察 所，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠杆菌(ATCC35218)、蜡 样芽胞杆菌(CMCC(B)63301)、变形杆菌(CMCC (B) 45103)均购自由中国药品生物制品检定 所，小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC9610)、大肠杆菌0157 :H7 (912981)、肺炎克雷伯氏菌(临床 分离株，猪)、多杀性巴氏杆菌(临床分离株，猪)由本室保存。实施例1 试剂盒组成与配制1) DNA提取液配制缓冲液，包括如下组分PBS (137mM Nacl，2. 7mM Kcl， 10mMNa2HP04, 2mM KH2P04, PH7. 4) 10XTE (0. 1M Tris_HCl，0. 1M EDTA PH8. 0)。2) PCR 反应液配制反应液 10 X PCR Buffer (含 Mg2+) 10 u L、dNTPs (2. 5mmol/ L) 5 ii L、正向引物和反向引物各2 ii L (10 ii mol/L)、Taq酶(5U/ u L)0. 5u L、无菌双蒸水29. 5u L ；3)标准阳性模板标准阳性模板为含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个 碱基的核苷酸片段构成的PMD-18重组质粒。布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggtttt gggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatcca gaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagagga ctggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggag cgagctttgc-3'4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列正向引物FBCSP31 5 ‘ -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘；反向引物RBCSP31 5 ‘ -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘5)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。实施例2 试剂盒的特异性试验用经过DNA有效性验证鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球 菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽 胞杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆 菌血清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌0157 :H7等15种对照，阳性样品各 1 u L为模板进行PCR反应，同时设阴性对照。PCR扩增条件为循环条件为95°C预变性5min，94°C变性30sec、65°C退火30sec、 72°C延伸30sec，扩增31个循环，最后72°C延伸5min。结果只有牛种布鲁菌544A、牛种布鲁菌104M、羊种布鲁菌16M、猪种布鲁菌S2扩增 出301bp特异性目的片段，而鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球菌、 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆 菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆菌血 清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌0157 :H7和阴性对照无条带(见图2)。上 述结果说明试剂盒具有较好的特异性。实施例3试剂盒的敏感性试验将牛种布鲁菌基因组DNA的浓度调整为10ng/ u L，然后进行10倍系列稀释，每个 稀释度取1 P L作为模板，分别用所建立的PCR方法进行扩增。以出现阳性条带所用模板的 最高稀释度为该方法的最低检出限。PCR扩增条件为循环条件为95°C预变性5min，94°C变性30sec、65°C退火30sec、 72°C延伸30sec，扩增31个循环，最后72°C延伸5min。通过试验结果确定试剂盒的敏感性为10pg基因组(见图3)。实施例4试剂盒对临床牛粪便样品的检测用试剂盒检测106份牛粪便样品，并于虎红平板凝集试验结果进行比较。结果试剂盒能从106份牛粪便样品中检出9份布鲁菌感染阳性样品，与虎红平板凝集试验的阳性 符合率为100%。部分临床牛粪便样品的PCR检测结果见图4。
权利要求
一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，其特征在于由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品组成；正向引物FBCSP315′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′；反向引物RBCSP315′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′；标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因的301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是PCR反应液由正反向引物Fbcsp31和Rbcsp31，10XPCR Buffer (含Mg2+)，dNTPs及无菌双 蒸水组成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因 的核苷酸序列为5 ‘ -ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggc tgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaat aatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactgg tattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagc tttgc-3‘ ο
4.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)DNA提取液包括如下组分PBS(137mM Nacl, 2. 7mM Kcl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, PH7. 4) ,10XTE (0. IM Tris_HCl，0. IMEDTA, pH 8.0)；2)PCR 反应液由正反向引物 Fbcsp31 和 Rbcsp31，10 X PCR Buffer (含 Mg2+)，dNTPs 及无菌 双蒸水组成；3)标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片段构 成的pMD-18重组质粒；4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列正向引物 FBCSP31:5' -GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3 ‘反向引物 RBCSP31:5' -GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3 ‘。5)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
5.一种定性检测布鲁菌的方法，包括以下步骤1)样本的预处理，提取DNA;2)将DNA和阳性标准品分别加入到反应液的PCR反应体系中，进行PCR检测；取PCR产 物，以琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察301bp的扩增条带。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于布鲁菌定性检测。本发明由标准阳性模板、PCR反应液、布鲁菌BCSP31基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以替代传统的病原学检测方法。
文档编号C12Q1/04GK101851679SQ201010188839
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者冮森林, 孙长江, 李铁峰, 杜崇涛, 杜涛峰, 王大力, 雷连成, 韩文瑜 申请人:吉林大学