专利名称：人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量pcr检测试剂盒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法和 用途。属于生物技术领域。
背景技术：
瞬时受体电位通道(简称TRPC)是一种非选择性阳离子通道家族(包含TRPCl TRPC7)，对钙离子具有通透性，该家族蛋白具有六个高度保守跨膜区，根据结构和功能的相 似性可以分为 4 个亚组TRPC1 ；TRPC2 ；TRPC3、TRPC6 和 TRPC7 ；TRPC4 和 TRPC5。TRPC 可通 过同源或异源四聚体方式组合构成功能性SOCC通道，后者介导产生SOCE引起细胞钙内流， TRPC表达异常引起SOCE的变化影响细胞生命活动，参与多种良恶性疾病，例如呼吸系统 疾病哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺动脉高压；心血管系统疾病心肌肥大、高血压、 脉管炎；泌尿系统疾病局灶性节段性肾小球硬化症；神经系统疾病神经退行性变、肌营 养不良；免疫系统疾病T/B细胞免疫反应(炎症反应)和肿瘤疾病肝癌、前列腺癌、乳腺 癌、卵巢癌、胃癌和食管癌等。尤其是TRPC基因表达在肿瘤发生发展中的作用开始受到广 泛关注。因此，阐明TRPC的分子机理对于各种疾病的诊断和治疗至关重要。实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基 团，实时收集累积荧光信号强度监测整个PCR进程，建立实时扩增曲线并确定Ct值，最后通 过标准曲线对未知模板进行始点定量分析的方法。具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、 操作简单等优点，可高通量的进行基因定量检测及相对表达分析。广泛应用于人类各种疾 病的基因快速检测、早期诊断、基因分型等方面。目前采用该方法进行基因定量分析首先需 要设计、合成基因特异性的引物，并反复对该引物进行效率和特异性的检测，最终筛选出合 适的引物。因此，过程相对繁琐、耗时、操作性低。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了提供一种人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检 测试剂盒。本发明的第二个目的，是为了提供一种人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检 测试剂盒的制备方法。本发明的第三个目的，是为了提供一种人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检 测试剂盒的用途。本发明的第一个目的可以通过如下措施达到人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒，它包括盒体，在盒体内设有 反应板和阳性对照品，其特征在于在反应板中设有若干反应孔，所述反应板包括荧光定量 PCR标准曲线反应板和荧光定量PCR待测样品反应板；在荧光定量PCR标准曲线反应板、荧 光定量PCR待测样品反应板中设有目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液，所述目的基因TRPCl TRPC7反应混合液包括TRPCl TRPC7基因引物序列、 SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液，所述内参基因IP08反应混合液包括IP08基 因引物序列、SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液；所述目的基因TRPCl TRPC7 反应混合液和内参基因IP08反应混合液设置在反应孔中。本发明以Gene Bank中瞬时受体电位通道(TRPC)基因转录产物(信使核糖核酸， mRNA)为模板，设计、合成人TRPC基因引物，通过标准化实时荧光定量聚合酶链反应技术， 筛选出高效、特异的TRPC基因引物，并将这些引物同其它PCR反应成分制作成的瞬时受体 电位通道(TRPC)基因荧光定量检测试剂盒。本发明的第一个目的还可以通过如下措施达到本发明第一个目的进一步实施方案是，其特征是1)所述TRPCl基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ IDNa 1所示；2)所述TRPC2基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 2所示；3)所述TRPC3基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 3所示；4)所述TRPC4基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 4所示；5)所述TRPC5基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 5所示；6)所述TRPC6基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 6所示；7)所述TRPC7基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 7所示；8)所述IP08基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 8所示。本发明第一个目的进一步实施方案，其特征是阳性对照品为人脑组织cDNA。本发明第一个目的进一步实施方案，其特征是所述荧光定量PCR标准曲线反应 板、荧光定量PCR待测样品反应板各设有96个反应孔，构成96孔板。本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括 如下步骤1)制备盒体和安置于盒体内的荧光定量PCR标准曲线反应板和荧光定量PCR待测 样品反应板，在所述的荧光定量PCR标准曲线反应板和荧光定量PCR待测样品反应板中按 区域设置目的基因TRPCl TRPC7和内参基因IP08的反应孔，每个样品设置一个重复孔； 每个基因设置两个无模板阴性对照-NTC ；2)设计目的基因TRPCl TRPC7及内参基因IP08引物，测定所述引物的效率与特 异性；3)将所测引物分别与SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液混合，分别构 成目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液；4)将目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液分别加于 在前述对应反应孔中，构成目的基因TRPCl TRPC7及内参基因IP08荧光定量PCR各反应 板；5)制备人脑组织cDNA为.TRPCl TRPC7基因阳性对照样品，检测时取该样品按 2倍倍比稀释成5个浓度梯度后加于标准曲线反应板的反应孔中，构成梯度反应孔。本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒的用途，其特征是可用于人
4类TRPC基因相关良恶性疾病的分析研究。本发明的有益效果是本发明提供一种人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒制 作、保存方便，操作性及重复性好，可以根据TRPC基因研究重点的不同进行多样化设计，能 够一次性完成多基因多样本的TRPC相对定量分析。归纳出如下有益效果1、高效、特异试剂盒反应板的混合液中含有特异的TRPCl TRPC7基因引物，可 高效的进行TRPC基因定量分析。解决了研究者设计、合成、筛选TRPC基因引物的困难问题。2、定量准确可靠各基因实际引物效率可通过试剂盒中人脑组织cDNA(阳性对 照)检测，避免了实际效率与参考效率之间差异所带来的计算误差。3、操作方便研究者在使用过程中，仅需加入推荐量的待测cDNA样品便可一次性 完成所有T RPC定量分析，简化了 PCR反应体系的制备。4、模块化设计反应板的制作(样品检测数量、焦点TRPC基因)可根据研究要求 进行变更。5、制作简单，操作性强，保存、运输方便，适用范围广。
图Ia是本发明试剂盒的阳性对照品的结构示意图。图Ib是本发明试剂盒的反应板的结构示意图。图Ic是本发明试剂盒的荧光定量PCR标准曲线反应板的结构示意图。图Id是本发明试剂盒的荧光定量PCR待测样品反应板的结构示意图。其中，图Ic中-1，-2，-3，-4，-5表示TRPC和IP08基因引物标准曲线5梯度等比稀释 孔；NTC表示无模板阴性对照。a、b、c、d、e、f、g和h分别对应为=TRPCU TRPC2、TRPC3、 TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7 禾口 IP08。图Id中:sl, s2, s3, s4, s5表示待测样品；NTC表示无模板阴性对照。a、b、c、 d、e、f、g 禾Π h 分别对应为TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7 和 IP08。图2a是本发明内参基因IP08荧光定量PCR标准曲线图。
图2b是本发明内参基因IP08荧光定量PCR扩增曲线图。
图2c是本发明内参基因IP08荧光定量PCR产物融解曲线图
图2d是本发明内参基因IP08荧光定量PCR产物序列测定图。
图2e是本发明内参基因IP08荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。
图3a是本发明目的基因TRPCl荧光定量PCR标准曲线图。
图3b是本发明目的基因TRPCl荧光定量PCR扩增曲线图。
图3c是本发明目的基因TRPCl荧光定量PCR产物融解曲线图。
图3d是本发明目的基因TRPCl荧光定量PCR产物序列测定图。
图3e是本发明目的基因TRPCl荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。
图4a是本发明目的基因TRPC2荧光定量PCR标准曲线图。
图4b是本发明目的基因TRPC2荧光定量PCR扩增曲线图。
图4c是本发明目的基因TRPC2荧光定量PCR产物融解曲线图。
图4d是本发明目的基因TRPC2荧光定量PCR产物序列测定图。图4e是本发明目的基因TRPC2荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图5a是本发明目的基因TRPC3荧光定量PCR标准曲线图。图5b是本发明目的基因TRPC3荧光定量PCR扩增曲线图。图5c是本发明目的基因TRPC3荧光定量PCR产物融解曲线图。图5d是本发明目的基因TRPC3荧光定量PCR产物序列测定图。图5e是本发明目的基因TRPC3荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图6a是本发明目的基因TRPC4荧光定量PCR标准曲线图。图6b是本发明目的基因TRPC4荧光定量PCR扩增曲线图。图6c是本发明目的基因TRPC4荧光定量PCR产物融解曲线图。图6d是本发明目的基因TRPC4荧光定量PCR产物序列测定图。图6e是本发明目的基因TRPC4荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图7a是本发明目的基因TRPC5荧光定量PCR标准曲线图。图7b是本发明目的基因TRPC5荧光定量PCR扩增曲线图。图7c是本发明目的基因TRPC5荧光定量PCR产物融解曲线图。图7d是本发明目的基因TRPC5荧光定量PCR产物序列测定图。图7e是本发明目的基因TRPC5荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图8a是本发明目的基因TRPC6荧光定量PCR标准曲线图。图8b是本发明目的基因TRPC6荧光定量PCR扩增曲线图。图8c是本发明目的基因TRPC6荧光定量PCR产物融解曲线图。图8d是本发明目的基因TRPC6荧光定量PCR产物序列测定图。图8e是本发明目的基因TRPC6荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图9a是本发明目的基因TRPC7荧光定量PCR标准曲线图。图9b是本发明目的基因TRPC7荧光定量PCR扩增曲线图。图9c是本发明目的基因TRPC7荧光定量PCR产物融解曲线图。图9d是本发明目的基因TRPC7荧光定量PCR产物序列测定图。图9e是本发明目的基因TRPC7荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳图。图IOa是本发明目的基因TRPCl和TRPC6在NSCLC组织中的表达示意图。图IOb是本发明目的基因TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC7在NSCLC组织中 的表达示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例、应用实施例及附图对本发明作进一步详细的描述具体实施例参照图la、图lb、图Ic和图ld，本实施例包括盒体，在盒体内设有反应板1和阳性 对照品2，在反应板1中设有六组反应孔3，反应板1包括荧光定量PCR标准曲线反应板11 和荧光定量PCR待测样品反应板12 ；在荧光定量PCR标准曲线反应板11、荧光定量PCR待 测样品反应板12中设有目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液， 目的基因TRPCl TRPC7反应混合液包括TRPCl TRPC7基因引物序列、SYBR荧光染料、
6DNA聚合酶和反应离子缓冲液，内参基因IP08反应混合液包括IP08基因引物序列、SYBR荧 光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液；所述目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基 因IP08反应混合液设置在反应孔3中。本实施例中，所述阳性对照品2为人脑组织cDNA。所述荧光定量PCR标准曲线反 应板11、荧光定量PCR待测样品反应板12均为96孔板，每个待测基因设置无模板阴性对照 NTC，每个样品设置重复反应孔3，可同时对5个样品进行TRPCl TRPC7和IP08基因的检 测。本实施例所述的人瞬时受体电位通道蛋白(TRPC)荧光定量PCR检测试剂盒主要 是通过以下技术方案来实现的1、TRPCl 7基因及内参基因IP08引物设计与合成；2、引 物效率与特异性测定3、目的基因TRPCl 7及内参基因IP08荧光定量PCR各反应板的制 备；4、TRPCl 7基因阳性对照(人脑组织cDNA)的制备。具体如下1. TRPCl 7基因及内参基因IP08引物设计与合成参照表1，以GeneBank目的基因TRPCl TRPC7及IP08内参基因转录产物(mRNA) 为模板设计相应引物，设计方法采用Primerf在线设计软件引物送大连TAKARA公司合成。表1人TRPC及IP08引物信息表
权利要求
人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒，它包括盒体，在盒体内设有反应板(1)和阳性对照品(2)，其特征是在反应板(1)中设有若干反应孔(3)，所述反应板(1)包括荧光定量PCR标准曲线反应板(11)和荧光定量PCR待测样品反应板(12)；在荧光定量PCR标准曲线反应板(11)、荧光定量PCR待测样品反应板(12)中设有目的基因TRPC1～TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液，所述目的基因TRPC1～TRPC7反应混合液包括TRPC1～TRPC7基因引物序列、SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液，所述内参基因IP08反应混合液包括IP08基因引物序列、SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液；所述目的基因TRPC1～TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液设置在反应孔(3)中。
2.根据权利要求1所述的人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是1)所述TRPCl基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNo 1所示；2)所述TRPC2基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 2所示；3)所述TRPC3基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 3所示；4)所述TRPC4基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID Na 4所示；5)所述TRPC5基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 5所示；6)所述TRPC6基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID Na 6所示；7)所述TRPC7基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 7所示；8)所述IP08基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No 8所示。
3.根据权利要求1或2所述的人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒，其 特征是所述荧光定量PCR标准曲线反应板(11)、荧光定量PCR待测样品反应板(12)各设 有96个反应孔(3)，构成96孔板。
4.人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如 下步骤1)制备盒体和安置于盒体内的荧光定量PCR标准曲线反应板(11)和荧光定量PCR待 测样品反应板(12)，在所述的荧光定量PCR标准曲线反应板(11)和荧光定量PCR待测样品 反应板(12)中按区域设置目的基因TRPCl TRPC7和内参基因IP08的反应孔(3)，每个样 品设置一个重复孔；每个基因设置两个无模板阴性对照-NTC ；2)设计目的基因TRPCl TRPC7及内参基因IP08引物，测定所述引物的效率与特异性；3)将所测引物分别与SYBR荧光染料、DNA聚合酶和反应离子缓冲液混合，分别构成目 的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液；4)将目的基因TRPCl TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液分别加于在前 述对应反应孔中，构成目的基因TRPCl TRPC7及内参基因IP08荧光定量PCR各反应板；5)制备人脑组织cDNA为.TRPCl TRPG7基因阳性对照样品，检测时取该样品按2倍 倍比稀释成5个浓度梯度后加于标准曲线反应板(11)的反应孔(3)中，构成梯度反应孔。
5.人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒的用途，其特征是用于人类 TRPC基因相关良恶性疾病的分析研究。
全文摘要
本发明涉及人瞬时受体电位通道蛋白荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法和用途，包括盒体，在盒体内设有反应板(1)和阳性对照品(2)，其特征是在反应板(1)中设有若干反应孔(3)，反应板(1)包括荧光定量PCR标准曲线反应板(11)和荧光定量PCR待测样品反应板(12)；在荧光定量PCR标准曲线反应板(11)、荧光定量PCR待测样品反应板(12)中设有目的基因TRPC1～TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液；所述目的基因TRPC1～TRPC7反应混合液和内参基因IP08反应混合液设置在反应孔(3)中。本发明具有制作、保存方便，操作性及重复性好的特点，可以根据TRPC基因研究重点的不同进行多样化设计，能够一次性完成多基因多样本的TRPC相对定量分析。
文档编号C12Q1/68GK101948912SQ20101019881
公开日2011年1月19日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者何建行, 卢文菊, 张奇, 张晨婷, 张雅洁, 王健 申请人:广州医学院第一附属医院;广州呼吸疾病研究所