专利名称：一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养枯草芽孢杆菌 {Bacillus subtil is、的方法。
背景技术：
抗生素作为饲料添加剂，在畜禽防疫方面虽起到积极的作用，但抗生素的广泛使用带来了环境污染、残毒危害、病菌抗药、人畜安全受到威胁等一系列问题。另外，抗菌素会抑制和杀死肠道内的有益菌群，造成肠道正常菌群微生态失调，导致疫病的发生，出现二重感染，有害于人畜健康。1974年，Parker提出与“抗生素”相对的新概念——“益生菌”。 益生菌，源于希腊语“对生命有益”，是指能定植于宿主肠道内，产生确切健康功效的活的有益微生物的总称，是具有调节动物肠道微生态平衡，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和人的病原菌具有显著的拮抗作用，引起广大微生物和免疫学工作者的密切关注。芽孢杆菌的芽孢具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点，在西方国家芽孢杆菌已被开始应用于人的功能性食品和动物饲料添加剂。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性需氧菌，是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其无毒、无残留、无污染，同时具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，对改善动物消化道微环境、促进动物营养的消化吸收、提高动物饲料的转化率和增强畜禽免疫力起到重要作用，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂， 广泛应用于畜牧业、饲料等行业。目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、 以及枯草芽孢杆菌的产酶特性和在豆柏中的应用效果研究等，而在提高枯草芽孢杆菌菌体产量的发酵技术方面则报道较少。
发明内容
本发明提供了一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，以提高枯草芽孢杆菌的菌体产量。本发明提供的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，具体如下以枯草芽孢杆菌 {Bacillus subtil is)为菌种,经活化后接种到发酵培养基中培养。发酵培养基为可溶性淀粉12.5-17.5g/L、蛋白胨20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4 O. 25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8. 0 ;培养条件培养温度 35-45°C、转速 150-200r/min、装液量 60-100mL/250mL ;接种量为 5-10% (v/v)，培养时间 16-18h。更优选地，发酵培养基为可溶性淀粉15g/L、蛋白胨22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、 Na2HPO4 O. 5g/L、MgS04 O. 5g/L，pH7. 0 ;培养温度 37°C、转速 200r/min、装液量 80mL/250mL ； 接种量为5% (v/v)，培养时间16h。
所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂 15g-20g，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
经过以上条件优化，枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达4. 32X 109cfu/mL,比优化前 (I. 33X 108cfu/mL)提高了 31. 48 倍。本发明的显著优点枯草芽孢杆菌是一种非常有应用价值和市场前景的微生态制剂，但在实际应用过程中仍然存在一些问题。在自然条件下的枯草芽孢杆菌，作用效果常常不理想，因此，要对其进行改良，使其在加工工艺、剂型和贮藏技术等环节上有所突破。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。
图I枯草芽孢杆菌的生长曲线；图2不同碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响；图3可溶性淀粉添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响图4不同氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响；图5蛋白胨添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响；图6不同无机盐种类对枯草芽孢杆菌生长的影响；图7培养基初始PH值对枯草芽孢杆菌生长的影响;图8培养温度对枯草芽孢杆菌生长的影响；图9转速对枯草芽孢杆菌生长的影响；图10培养基装液量对枯草芽孢杆菌生长的影响；图11接种量对枯草芽孢杆菌生长的影响。
具体实施例方式以下实施例采用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌E菌株(参考文献赵莹等，枯草芽孢杆菌发酵蔗渣生产黄腐酸的工艺条件优化.福州大学学报(自然科学版)，2010，38
(2):290-296)，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例I
1.枯草芽孢杆菌生长曲线的测定
将枯草芽孢杆菌活化后，以5%(v/v)的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2)中，装液量 100mL/250mL，在 30°C、 200r/min下培养，分别采用分光光度法和平板菌落计数法测定不同培养时间时的0D_值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以0D_值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图(图I)。 由生长曲线确定枯草芽孢杆菌的最佳培养时间为16h。
2.枯草芽孢杆菌的培养基配方优化
以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基，研究不同碳源、氮源、无机盐对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响。培养条件接种量5%(v/v)，装液量100mL/250mL，在30°C、200r/min 下培养16h。
2.1碳源种类对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
分别以1% (表示g/100mL，以下类同)的蔗糖、环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、乙酸钠、葡萄糖为碳源，取代牛肉膏蛋白胨液体培养基中的牛肉膏，考察它们对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响，以碳源种类为横坐标，0D_增长量为纵坐标作图。图2显示，以可溶性淀粉为碳源时，枯草芽孢杆菌的OD6tltl增长量最大，为O. 798 (菌悬液稀释10倍测定)；而用乙酸钠和葡萄糖作为碳源时，0D_增长量较小。综合细胞生物量和培养基成本进行考虑，确定采用可溶性淀粉作为碳源。2.2碳源添加量对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
比较可溶性淀粉不同添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响，以碳源添加量为横坐标， 0D_增长量为纵坐标作图，将菌悬液稀释10倍后测定0D_ (图3)。结果表明，随着可溶性淀粉添加量的增加，0D_增长量也不断提高；当碳源添加量为I. 5%时，枯草芽孢杆菌的 OD600增长量达到最高，为O. 544 ;随之继续增加可溶性淀粉的添加量，OD600增长量下降。因此，确定枯草芽孢杆菌可溶性淀粉的最适添加量为I. 5%。2.3氮源种类对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
在碳源优化的基础上，分别以1%的蛋白胨、磷酸二氢铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠为氮源，考察它们对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响，以氮源种类为横坐标，OD600增长量为纵坐标作图(图4)。结果表明，枯草芽孢杆菌利用蛋白胨作为氮源时，OD6tltl增长量最高， 为1.475 ;而采用无机氮源时，细胞生物量相对较低，因此选取蛋白胨作为培养基的氮源。2.4氮源添加量对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
以蛋白胨添加量为横坐标，以OD6tltl增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定0D_ (图5)。结果表明，随着蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增长量也随之提高；当蛋白胨添加量为
2.25%时，枯草芽孢杆菌的0D_增长量达到最高，为O. 718 ;随后继续增加蛋白胨的添加量， OD600增长量有所下降。因此，确定枯草芽孢杆菌的蛋白胨最适添加量为2. 25%。2.5无机盐种类对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
在碳源、氮源优化的基础上，分别以O. 5%的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、钥酸钠、 硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁为无机盐添加到培养基中，以无机盐种类为横坐标，OD600 增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定0D_ (图6)，确定最佳无机盐。结果表明，当以NaCl、Na2HPO4, MgSO4作为无机盐时，枯草芽孢杆菌的OD6tltl增长量较大，分别为O. 751、
O.872,0. 758，因此选择NaCl、Na2HP04、MgS04作为枯草芽孢杆菌培养的最佳无机盐。在确定最佳无机盐种类的基础上，进一步深入研究无机盐的最适添加量及其相互作用。2.6无机盐添加量对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响
不同的微生物生长所需的无机盐种类和浓度不同。上述实验结果表明，NaCl, Na2HPO4 和MgSO4对枯草芽孢杆菌生长的影响较为明显，因此以这三种盐为考察因素设计正交试验 L9(34)，对无机盐配方进行优化。通过单因素试验，初步确定上述无机盐的较优水平分别为 NaCl 0%-0. 25%、Na2HPO4 0%-0. 1%, MgSO4 0%-0. 1%。表I枯草芽孢杆菌无机盐优化正交试验因素和水平表
权利要求
1.一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于以枯草芽孢杆菌OfeciJAz1S subti I is)为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养；发酵培养基为可溶性淀粉12.5-17. 5g/L、蛋白胨 20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4O.25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8.0 ;培养条件培养温度 35-45 °C、转速 150_200r/min、装液量 60-100mL/250mL ;接种量为 5-10% (v/v)，培养时间 16_18h。
2.根据权利要求I所述的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述发酵培养基为可溶性淀粉 15g/L、蛋白胨 22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、Na2HPO4 O. 5g/L、MgSO4 O. 5g/ L, ρΗ7· O0
3.根据权利要求I所述的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述培养条件为培养温度37°C、转速200r/min、装液量80mL/250mL ;接种量为5% (v/v)，培养时间 16h0
4.根据权利要求I所述的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g-20g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的方法，以提高枯草芽孢杆菌的菌体产量。本发明提供的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，该方法以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。经过优化，枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达4.32×109cfu/mL，比优化前(1.33×108cfu/mL)提高了31.48倍。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。
文档编号C12R1/125GK102586153SQ20121005629
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者严芬, 叶秀云, 李仁宽, 杨捷, 林娟, 陈江平 申请人:福州大学