专利名称：一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法。
背景技术：
天然酶的稳定性以及可回收利用性，是酶作为生物催化剂工业应用的主要限制性因素。目前，化学添加剂方法、固定化方法、基因工程等方法能够提高酶分子的稳定性，但是，添加剂方法需要加入大量的添加剂，同时会对体系带来新的杂质和干扰；传统固定化方法引入较高的传质阻力，带来酶催化活性的显著下降；而基因工程方法较为复杂、成本较高、对稳定性提高效果有限、无法解决大量廉价生产的问题。现阶段纳米级催化颗粒制剂因其传质阻力低，催化活性高，稳定性好的特点受到关注。制备纳米级酶制剂的方法包括酶分子与纳米粒子的化学交联法以及原位聚合法生成单分子酶纳米粒子或纳米凝胶。化学交联法依赖于纳米粒子与酶分子的共价结合，往往导致蛋白分子的二级结构被破坏，底物对活性位点的空间阻碍增大或酶催化过程必须的中间体无法形成，总体催化活性降低。原位聚合法往往依赖目标蛋白的表面氨基酸残基实现可聚合集团修饰，大量研究在特定蛋白或特定高分子，存在无法推广至所有工业用酶的问题。因此开发一种具有普适性的，可以推广到多种工业用酶的制备具有高稳定性、高生物催化活性、易于实施、粒径可控的具有良好市场和重大价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性酶纳米凝胶颗粒，以解决现有的天然酶热稳定性差、无法回收利用的问题，对于进一步开拓酶的应用具有重要意义。本发明所提供的磁性酶纳米凝胶颗粒，其为核壳结构，核芯为表面吸附酶分子的磁性纳米粒子，酶分子与磁性纳米粒子以静电力相互作用；外壳为交联的高分子材料层； 所述磁性纳米粒子的表面修饰有可与所述交联的高分子材料层反应的基团，所述核壳之间通过化学键连接。本发明中，所述磁性酶纳米凝胶颗粒的粒径可为150_250nm，所述交联的高分子材料层的厚度为100-200nm。所述磁性纳米粒子具有磁性金属(如Fe, Ni, Co)或合金纳米粒子(如Fe-Pt, Fe-Co),过渡族金属氧化物纳米粒子(Fe3O4, y -Fe2O3, MnO, FeCoO)。所述磁性纳米粒子的粒径可为5-20nm，其在水溶液中以小聚集体的形式存在，粒径为50nm。所述酶具体可为脂肪酶、胰蛋白酶、细胞色素丙等。本发明还提供了上述磁性酶纳米凝胶颗粒普适性的制备方法，以解决现有固定化酶引入化学修饰剂或交联剂常导致蛋白质分子构象改变以及酶催化活性较低的问题。采用该制备方法可以实现在保持酶催化活性的同时显著改善酶的热稳定性和具有易回收利用的特性。本发明所提供的制备磁性酶纳米凝胶颗粒的方法，是以下述质量份的物质为原料制备得到的表面修饰的磁性纳米粒子40份、酶10份、形成壳层高分子材料的单体200 400份、交联剂O. 5 5份和引发剂O. 5 20份，所述表面修饰的磁性纳米粒子其表面具有可聚合基团以及对所述酶分子具有静电吸附作用的基团；所述方法包括下述步骤I)将表面修饰的磁性纳米粒子与酶加入pH值为5 10的缓冲溶液中，在O 50°C条件下反应O. 5 6小时，得到酶-纳米粒子复合物，即所述磁性酶纳米凝胶颗粒的核
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心;2)将所述酶-纳米粒子复合物加入到有机溶剂水溶液中，再加入单体、引发剂和交联剂，在O 50°C下反应O. 5 6小时，得到所述磁性酶纳米凝胶颗粒。上述表面修饰的磁性纳米粒子可根据具体所选用的酶，按照下述三种方法中的任意一种制备得到的方法一将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12 小时，即得表面修饰的磁性纳米粒子；其中，所述硅烷偶联剂为至少两种硅烷偶联剂的混合物，所述硅烷偶联剂的结构式为Y (CH2) SiX3, X代表可水解基团，如氯基、甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇，从而与磁性纳米粒子表面的羟基结合形成硅氧烷，Y代表有机功能基团，此处Y具体指对所述酶分子具有静电吸附作用的基团以及可聚合基团，当在制备条件下，酶分子带负电荷，此处Y则为带正电荷的基团如氨基等，当在制备条件下，酶分子带正电荷，此处Y则为带负电荷的基团如环氧基、巯基、氯基或脲基；所述可聚合基团具体可为乙烯基等。所述对所述酶分子具有静电吸附作用的基团和可聚合基团的摩尔比为90 10到 50 50 ;所述磁性纳米粒子与所述硅烷偶联剂的质量份数比为200 2 40。方法二I)将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12小时；其中，所述硅烷偶联剂的结构式为Y(CH2)SiX3,X代表可水解基团和Y代表带氨基；2)将步骤I)修饰后的磁性纳米粒子加入到pH值为8 9的缓冲液中，再加入粒子修饰剂A,在O 50°C条件下反应O. 5 6小时，即得表面修饰的磁性纳米粒子；所述粒子修饰剂A是分子结构中至少含有一个可聚合基团且可与氨基发生反应形成化学键连接的物质；所述磁性纳米粒子、所述硅烷偶联剂与所述粒子修饰剂A的质量份数比为 200 2-40 O.2-20 ；方法三I)将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12小时；其中，所述硅烷偶联剂的结构式为Y(CH2)SiX3, X代表可水解基团和Y代表氨基；2)将步骤I)修饰后的磁性纳米粒子加入到pH值为8 9的缓冲液中，再加入粒子修饰剂A，在O 50°C条件下反应O. 5 6小时；所述粒子修饰剂A是分子结构中至少含有一个可聚合基团且可与氨基发生反应形成化学键连接的物质；3)将步骤2)修饰后的磁性粒子加入到有机溶剂中，再加入粒子修饰剂B，在O 50°C条件下反应2 6小时，即得表面修饰的磁性纳米粒子；所述粒子修饰剂B是分子结构中至少含有一个羧基且可与所述硅烷偶联剂中的有机功能基团发生反应形成化学键连接的物质；所述磁性纳米粒子、所述硅烷偶联剂、所述粒子修饰剂A、所述粒子修饰剂B的质量份数比为 200 2-40 O. 2-20 100-150。在本发明中，所述磁性纳米粒子为金属纳米粒子、合金纳米粒子或过渡族金属氧化物纳米粒子；所述金属纳米粒子具体为Fe, Ni或Co纳米粒子。所述合金纳米粒子具体为 Fe-Pt合金纳米粒子或Fe-Co合金纳米粒子,所述过渡族金属氧化物纳米粒子具体为Fe3O4 纳米粒子、Y -Fe2O3纳米粒子、MnO纳米粒子或FeCoO纳米粒子。所述磁性纳米粒子的粒径为5-20nm，所形成的小聚集体的直径约为50nm。该磁性纳米粒子可按照现有方法进行制备。在本发明中，含氨基的硅烷偶联剂具体可选自3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基二甲氧基娃烧，含可聚合基团的娃烧偶联剂具体为乙稀基二甲氧基娃烧、乙稀基二乙氧基硅烷、3_(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷、或3-甲基丙烯酸丙基(三甲氧基硅烷)。在本发明中，所述粒子修饰剂A具体选自下述至少一种丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴和衣康酸酯。所述粒子修饰剂B是具体选自琥珀酸酐和/或马来酸酐。所述形成高分子材料层的单体为含乙烯基的单体；所述乙烯基单体是可通过自由基聚合反应形成聚合物的乙烯基单体；具体可选自下述至少一种丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸钠、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、顺丁二烯、三羟基甲基丙烷和三甲基丙烯酸酯。在本发明中，所述引发剂是在O 50°C条件下能够引发产生自由基使乙烯基单体发生自由基聚合的热引发或氧化还原引发类物质。所述引发剂具体选自A和B(1 I I 3，质量比)组成的复合引发体系；所述A选自下述至少一种过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰；所述B选择下述至少一种亚铁盐、亚硫酸盐、 N，N’ - 二甲基苯胺、氨水、N，N’ - 二甲基-对甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和 N-甲基吗啉。所述交联剂具体可为N，N’ -甲叉双丙烯酰胺。所述有机溶剂选自下述任意一种二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、乙腈、乙醇和丙酮；所述有机溶剂水溶液是含下述至少一种有机溶剂的水溶液二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、乙腈、乙醇和丙酮，其中，有机溶剂的质量百分比含量为O. 5 50% ；所述pH值为5 10的缓冲溶液选自下述任意一种物质的水溶液磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠和Tris碱-盐酸。本发明制备的磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒具有较高的生物催化活性，其原因如下首先，由于酶分子不与外壳高分子或磁性纳米粒子共价连接，或被化学修饰剂修饰，酶分子本身最大限度得保持了天然酶的分子构象从而降低了酶活性丧失。第二，高分子材料外壳层与磁性粒子表面的乙烯基集团通过共价连接，并以交联剂形成网状结构，能够防止磁性纳米粒子和酶分子脱落，保证磁性酶纳米凝胶的可重复使用性；第三，高分子外壳中的高分子层将酶分子包埋在网状结构中，显著强化酶分子的结构，从而有效阻止了高温下酶的结构振动导致的失活问题。同时亲水性高分子材料层可以有效的保持酶分子表面的结构必需水。并且由于脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的粒径处于纳米范围、外壳连接的高分子材料层薄至几个到几十纳米，因此对酶催化反应的底物传质物无明显的影响。综上所述， 本发明的磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒具有活性高、热稳定性强、可回收利用、易操作、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力特点。这种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒作为一种高性能的纳米酶制剂，在纳米科学和生物技术领域具有广泛的应用前景。本发明的磁性酶纳米凝胶的制备方法，即先在磁性纳米粒子表面通过化学修饰引入氨基基团，碳碳双键基团，羧基基团等，然后通过调节溶液PH值(达蛋白等电点pi值) 得到酶-磁性纳米粒子的纳米级复合材料，最后以含有碳碳双键的乙烯基单体为原料，通过自由基聚合得到。该方法具有简单温和、便于纯化、易于工业实施放大的特点。上述方法的核心在于制备过程如何保持酶的活性，同时既能够提供较高的制备收率，又能够制备具备理想的粒径分布的纳米颗粒。因此本发明在磁性粒子表面修饰引入氨基或羧基以及碳碳双键基团阶段和自由基聚合阶段使用了温度控制，保证制备温度发生在O 50°C，可以尽量避免酶在制备过程中的失活问题，制备过程几乎不会引起酶的失活；同时为了保证在较低的制备温度下自由基聚合可以得到较高的收率，使用了复合引发体系；为了保证自由基聚合主要发生在酶表面，使用了有机溶剂水溶液作为自由基聚合环境。同时该制备方法可以制备200纳米以下尺度的磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒，避免了以往的酶固定化过程中高的传质阻力，方法简便、易于工业实施和放大。
图I为实施例I制备的磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒的透射电镜照片。图2为实施例I制备的磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒的原子力显微镜照片。图3为实施例I制备的磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒在外加磁场作用下的磁相应特性的照片。图4为实施例I制备的磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒和天然脂肪酶的在50°C 和60°C定性对比图。图5为实施例I制备的磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒在循环利用10次的剩余活性图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明所述的磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法予以进一步的说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所用的酶包括脂肪酶，胰蛋白酶，细胞色素病，辣根过氧化物酶。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明， 均可从商业途径获得。实施例I :制备磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒I)制备具有超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子
原料氯化铁以摩尔计2份，氯化亚铁以摩尔计I份，氨水(质量浓度30% )以重量计为7份，合计10份。将氯化铁与氯化亚铁按照摩尔比2 I的比例溶解于双蒸水中，滴加稀盐酸调节溶液PH值小于2，通氮气30分钟除氧。将上述氯化铁/氯化亚铁溶液冷却至4 8°C，迅速搅拌的条件下(转速大于l，000rpm)，迅速加入冷却的氨水7份，形成黑色胶体溶液。将反应体系温度提高至70°C，并保持30分钟，磁力搅拌，同时保持通氮气，得到黑色的四氧化三铁纳米粒子。用钕铁硼磁体回收四氧化三铁纳米粒子，并用双蒸水清洗3次除残余氨水及各种离子。该纳米粒子具有超顺磁性，粒径3 8nm。利用高分辨透射电镜观察上述四氧化三铁纳米粒子的形态，结果如图I所示，平均粒径为6nm，粒径分布较为均匀。2)制备氨基和双键修饰的四氧化三铁纳米粒子将步骤I)制备的四氧化三铁纳米粒子200质量份分散于200质量份乙醇/水(体积比1/1)混合溶剂中，再加入10质量份3-氨丙基三乙氧基硅烷(偶联剂)，通氮气30分钟除氧。将反应体系温度升到50°C并保持12小时。用钕铁硼磁体回收氨基修饰的四氧化三铁纳米粒子，并用双蒸水清洗。将所得氨基修饰粒子分散于2000质量份pH8. O的Tris-HCl 缓冲液中，缓缓加入20质量份丙烯酸琥珀酰亚胺酯(粒子修饰剂A，先溶解于20质量份二甲基砜)，磁力搅拌，在30°C条件下反应2小时。用钕铁硼磁体回收双键修饰的四氧化三铁纳米粒子I，并用双蒸水清洗。将双键修饰的粒子I分散于1000质量份四氢呋喃中，加入100质量份琥珀酰亚胺 (粒子修饰剂B)，在室温条件下反应6小时。用钕铁硼磁体回收羧基与双键修饰的四氧化三铁纳米粒子II，并用双蒸水清洗。3)制备磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒原料为脂肪酶以重量计为10份，经过修饰剂A修饰的磁性纳米粒子I以重量计为 40份，含乙烯基的单体为200份丙烯酰胺，交联剂为2份甲叉双丙烯酰胺，引发剂为4份过硫酸铵和6份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物，合计10份。将上述脂肪酶与磁性纳米粒子加入pH为8的50mM Tris-HCl缓冲液中，在30°C 条件下反应2小时，以磁铁收集酶-纳米粒子复合物并用缓冲液洗3次除去自由酶。加入 200份丙烯酰胺和2份甲叉双丙烯酰胺(溶解在质量分数5%的二甲基亚砜水溶液中)，温度保持30°C，磁力搅拌，加入上述引发剂，温度保持30°C，继续反应2小时，然后以磁铁收集产物，并冻干即可得到脂肪酶磁性酶纳米凝胶催化颗粒。以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒的生物催化活性总收率为85%，聚合反应收率为99%， 而产物粒径为220nm，外壳厚度为170nm。如图4所示，50°C下，天然脂肪酶的酶活半衰期为30分钟，而脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒在相同条件下500分钟内仍然保持了很高的催化活性。在60°C条件下，天然脂肪酶与脂肪酶磁性纳米凝胶都会有一定程度失活，天然酶的半衰期为18分钟，磁性纳米凝胶的半衰期延长到253分钟。如图5表明，利用磁铁可以从复杂体系中分离脂肪酶磁性酶纳米凝胶并回收，在连续使用10次后，脂肪酶磁性酶纳米凝胶的催化活性仍然保持在90% 以上。而天然脂肪酶无法回收利用。实施例2 :制备磁性胰蛋白酶纳米凝胶生物催化颗
将实施例I中的目标酶改为20份胰蛋白酶，磁性粒子改为实施例I中制备的羧基与双键修饰的四氧化三铁纳米粒子II 80份，含乙烯基的单体为400份丙烯酰胺，交联剂为4份甲叉双丙烯酰胺，引发剂为8份过硫酸铵和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。其余步骤与实施例I相同。最后将胰蛋白酶磁性酶纳米凝胶分散在含有CaCl2 IOmM, pH值为8的 50mMTris-Cl激活缓冲液中。以Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐作为底物测量胰蛋白酶磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒的生物催化活性总收率为95%，聚合反应收率为 89%，而产物粒径为200nm。实施例3 :制备磁性细胞色素丙纳米凝胶生物催化颗将实施例I中的目标蛋白改为10份细胞色素丙，磁性粒子改为实施例I中制备的羧基与双键修饰的四氧化三铁纳米粒子II 40份，乙烯基单体改为300份丙烯酸钠、交联剂改为O. 5份N，N’ -甲叉双丙烯酰胺，其余配方和步骤与实施例I相同。此时，得到的产物以2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)以及过氧化氢作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率为82%，聚合反应收率为70%，而产物粒径为250nm。实施例4 :制备磁性脂肪酶纳米凝胶生物催化颗粒将实施例I步骤I)所制备的四氧化三铁纳米粒子200质量份分散于20质量份乙醇/水(体积比1/1)混合溶剂中，再加入10质量份3-氨丙基三乙氧基硅烷(偶联剂)与 3_(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷的混合物(二者质量比I : I)，通氮气30分钟除氧。将反应体系温度升到50°C并保持12小时。用钕铁硼磁体回收双键修饰的四氧化三铁纳米粒子，并用双蒸水清洗。然后按照实施例I步骤3)中的方法制备磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒。以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒的生物催化活性总收率为80%， 聚合反应收率为80%，而产物粒径为200nm。比较例I :将实施例I中引入交联剂N，N’ -甲叉双丙烯酰胺这一步去掉，其余配方和步骤与实施例I相同，结果仍形成脂肪酶磁性纳米凝胶生物催化颗粒，粒径260nm，但是将该磁性酶纳米凝胶在PH 6的磷酸盐缓冲液(即调节pH使接近目标蛋白脂肪酶pi)中温育I小时，利用磁铁分别收集磁性纳米凝胶和上层清夜。发现上层清夜中还有相当于 10%的蛋白以及催化活力，即聚丙烯酰胺没有形成网状结构包埋脂肪酶，导致脂肪酶从磁性粒子表面逐渐脱落，不适合回收利用。比较例2 将实施例3中的N，N’_甲叉双丙烯酰胺改为10份，其余配方和步骤与实施例3相同，结果反应体系发生凝胶化，不形成纳米级凝胶生物催化颗粒。凝胶仍具有催化活力，但由于传质阻力过高而不适合由于工业催化。比较例3 将实施例3中的缓冲液改为pH为4的乙酸钠缓冲液，无法形成酶-粒子复合物， 即使引发聚合也无法形成将酶-粒子包埋的聚合物纳米结构，所形成的纳米凝胶不具有催化活力。本发明可用其它的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明的权力要求书相当的含有和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种磁性酶纳米凝胶颗粒，其为核壳结构，核芯为吸附酶分子的磁性纳米粒子，外壳为交联的高分子材料层；所述磁性纳米粒子的表面修饰有可与所述交联的高分子材料层反应的基团，所述核壳之间通过化学键连接。
2.根据权利要求I所述的磁性酶纳米凝胶颗粒，其特征在于所述磁性酶纳米凝胶颗粒的粒径为150-250nm，所述交联的高分子材料层的厚度为100_200nm。
3.根据权利要求I或2所述的磁性酶纳米凝胶颗粒，其特征在于所述磁性纳米粒子为金属纳米粒子、合金纳米粒子或过渡族金属氧化物纳米粒子；所述金属纳米粒子具体为 Fe、Ni或Co纳米粒子,所述合金纳米粒子具体为Fe-Pt合金纳米粒子或Fe-Co合金纳米粒子，所述过渡族金属氧化物纳米粒子具体为Fe3O4纳米粒子、Y -Fe2O3纳米粒子、MnO纳米粒子或FeCoO纳米粒子；所述磁性纳米粒子的粒径为5-20nm ;所述酶为脂肪酶、胰蛋白酶或细胞色素丙。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的磁性酶纳米凝胶颗粒，其特征在于所述磁性酶纳米凝胶颗粒是按照权利要求5-10中任一项所述方法制备得到的。
5.一种制备权利要求1-3中任一项所述磁性酶纳米凝胶颗粒的方法，是以下述质量份的物质为原料制备得到的表面修饰的磁性纳米粒子40份、酶10份、形成所述高分子材料层的单体200-400份、交联剂O. 5 5份和引发剂O. 5 20份，所述表面修饰的磁性纳米粒子其表面具有可聚合基团以及对所述酶分子具有静电吸附作用的基团；所方法包括下述步骤.1)将表面修饰的磁性纳米粒子与酶加入pH值为5 10的缓冲溶液中，在O 50°C条件下反应O. 5 6小时，得到酶-纳米粒子复合物，即所述磁性酶纳米凝胶颗粒的核芯；.2)将所述酶-纳米粒子复合物加入到有机溶剂水溶液中，再加入所述形成所述高分子材料层的单体、引发剂和交联剂，在O 50°C下反应O. 5 6小时，得到所述磁性酶纳米凝胶颗粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述表面修饰的磁性纳米粒子是按照下述三种方法中的任意一种制备得到的方法一将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12小时， 即得表面修饰的磁性纳米粒子；其中，所述硅烷偶联剂为至少两种硅烷偶联剂的混合物，所述硅烷偶联剂的结构式为Y(CH2)SiX3, X代表可水解基团和Y代表有机功能基团，所述Y为对所述酶分子具有静电吸附作用的基团和可聚合基团，所述对所述酶分子具有静电吸附作用的基团和可聚合基团的摩尔比为90 10-50 50 ;所述磁性纳米粒子与所述硅烷偶联剂的质量份数比为200 2 40 ;方法二 .1)将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12小时；其中，所述硅烷偶联剂的结构式为Y(CH2)SiX3, X代表可水解基团和Y代表带氨基；.2)将步骤I)修饰后的磁性纳米粒子加入到pH值为8 9的缓冲液中，再加入粒子修饰剂A,在O 50°C条件下反应O. 5 6小时，即得表面修饰的磁性纳米粒子；所述粒子修饰剂A是分子结构中至少含有一个可聚合基团且可与氨基发生反应形成化学键连接的物质；所述磁性纳米粒子、所述硅烷偶联剂与所述粒子修饰剂A的质量份数比为.200 2-40 O.2-20 ；方法二 .1)将磁性纳米粒子与硅烷偶联剂在有机溶剂水溶液中，于30 70°C下反应5 12小时；其中，所述硅烷偶联剂的结构式为Y(CH2)SiX3, X代表可水解基团和Y代表氨基；.2)将步骤I)修饰后的磁性纳米粒子加入到pH值为8 9的缓冲液中，再加入粒子修饰剂A，在O 50°C条件下反应O. 5 6小时；所述粒子修饰剂A是分子结构中至少含有一个可聚合基团且可与氨基发生反应形成化学键连接的物质；.3)将步骤2)修饰后的磁性粒子加入到有机溶剂中，再加入粒子修饰剂B，在O 50°C 条件下反应2 6小时，即得表面修饰的磁性纳米粒子；所述粒子修饰剂B是分子结构中至少含有一个羧基且可与所述硅烷偶联剂中的有机功能基团发生反应形成化学键连接的物质；所述磁性纳米粒子、所述硅烷偶联剂、所述粒子修饰剂A、所述粒子修饰剂B的质量份数比为 200 2-40 O. 2-20 100-150。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述硅烷偶联剂的结构式中Y代表氨基， 所述娃烧偶联剂具体为3-氨丙基二乙氧基娃烧或3-氨丙基二甲氧基娃烧；所述娃烧偶联剂的结构式中Y代表可聚合基团，所述硅烷偶联剂具体为乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、3_(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷、或3-甲基丙烯酸丙基(三甲氧基硅烷)；所述粒子修饰剂A选自下述至少一种丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴和衣康酸酯；所述粒子修饰剂B选自下述至少一种琥珀酸酐和马来酸酐。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述磁性纳米粒子为金属纳米粒子、 合金纳米粒子或过渡族金属氧化物纳米粒子；所述金属纳米粒子具体为Fe, Ni所述合金纳米粒子具体为Fe-Pt合金纳米粒子或Fe-Co合金纳米粒子,所述过渡族金属氧化物纳米粒子具体为Fe3O4纳米粒子、Y -Fe2O3纳米粒子、MnO纳米粒子或FeCoO纳米粒子；所述磁性纳米粒子的粒径为5_20nm。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于所述形成所述高分子材料层的单体为含乙烯基的单体；所述含乙烯基单体是可通过自由基聚合反应形成聚合物的乙烯基单体；所述乙烯基单体具体选自下述至少一种丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸钠、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、顺丁二烯、三羟基甲基丙烷和三甲基丙烯酸酯。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于所述引发剂是在O 50°C条件下能够引发产生自由基使乙烯基单体发生自由基聚合的热引发或氧化还原引发类物质； 所述引发剂具体选自A和B按照质量比I : I I : 3组成的复合引发体系；所述A选自下述至少一种过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰；所述B 选择下述至少一种亚铁盐、亚硫酸盐、N, N’ - 二甲基苯胺、氨水、N, N’ - 二甲基-对甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基吗啉；所述交联剂为N，N’ -甲叉双丙烯酰胺。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的方法，其特征在于所述有机溶剂选自下述任意一种二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、乙腈、乙醇和丙酮；所述有机溶剂水溶液是含下述至少一种有机溶剂的水溶液二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈、乙醇和丙酮其中，有机溶剂的质量百分比含量为O. 5 50% ；所述PH值为5 10的缓冲溶液选自下述任意一种物质的水溶液磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、 碳酸钾、碳酸氢钾、乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠和Tris碱-盐酸。
全文摘要
本发明公开了一种磁性酶纳米凝胶颗粒及其制备方法。该磁性酶纳米凝胶颗粒为核壳结构，其核心为表面吸附酶分子的磁性纳米粒子，酶分子与磁性纳米粒子以静电力相互作用；外壳为交联的高分子材料层；核壳之间通过化学键连接。制备方法如下先在磁性纳米粒子表面通过化学修饰引入氨基、碳碳双键、羧基等基团，然后通过调节溶液pI得到酶-粒子的纳米级复合材料，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基聚合得到。该方法具有简单温和、便于纯化、易于工业实施放大的特点。本发明的磁性酶纳米凝胶颗粒具有生物催化活性高、热稳定性强、便于循环利用的特点，在有机合成、食品工业、洗涤剂工业、能源工业、生物医药、传感器等领域具有广泛的应用前景。
文档编号C12N11/14GK102604925SQ20121007025
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者刘铮, 卢滇楠, 林萌萌 申请人:清华大学