专利名称：一种优化的谷氨酰胺转胺酶启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种谷氨酰胺转胺酶启动子及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，MicrobialTransglutaminase, EC2. 3. 2. 13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。尽管微生物MTG已实现了エ业化生产，但依靠菌种筛选和过程优化的传统发酵技 术获得的产量仍然较为有限，远不能满足市场对MTG日益增长的需求。随着蛋白质表达技术的迅速发展，通过分子生物学的方法构建MTG高产重组菌成为国内外研究者关注的ー个热点。为进一歩提高产量，日本味之素公司率先开展了 MTG重组菌构建的工作。随后，德国Martin-Luther University、台湾食品エ业发展研究所、台湾国立中兴大学、中科院微生物研究所、华南理工大学及诺和诺德(中国)制药有限公司等相关研究机构或企业相继报导了重组MTG的制备策略。至此，链霉菌MTG已在大肠杆菌、酵母、链霉菌及谷氨酸棒杆菌等宿主中成功表达。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外需经活化蛋白酶活化成有活性MTG0大肠杆菌，酵母等表达宿主，不能够合成活化蛋白酶，MTG表达后需外加活化蛋白酶。而链霉菌宿主自身就可以分泌改类活化蛋白酶，可以直接获得有活性的MTG，因此链霉菌可以作为MTG表达的理想宿主。在表达系统中，启动子强度对蛋白的表达量影响很大。在链霉菌表达系统中，与其他表达系统相比，启动子比较少，而且通用性低，不适合MTG的表达。因此有必要开发新的启动子。很多文献表明，MTG自身启动子可以用于MTG的异源表达，因此MTG自身启动子可以作为一个高效表达启动子用于蛋白表达。
发明内容
为解决上述问题，我们对MTG自身启动子进行了研究，通过逐段缺失，确定了启动子的核心区域和调控序列。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通过基因克隆方法,得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank:EU477523)。利用PCR技术，设计引物，上游引物TCU-F :TTCGAGCTCGGTACCCACCCCGCTGAATGGGACTCTTCGT (Kpn I)，下游引物 TCU-R:CGCGGATCCGGAATTCCATATGCGTCGCCGGTCATGACCTGGTG,获得上游序列(tgU)，通过对基因 tgU 上下游的逐段缺失，确定了 MTG启动子核心序列及调控序列，并将优化后的启动子序列用于MTG的表达，产量得到显著提高，因此，MTG启动子可以被链霉菌工程菌识别并启动，具有广泛的应用价值。本发明所用到的培养基
YEME培养基葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖340g/L、MgCl2 6H20 5mmoL/L、甘氛酸 5g/L ；MS 培养基甘露醇 20g/L、黄豆粉 20g/L、琼脂粉 20g/L，pH7. 2-7. 3 ；R5 培养基蔗糖 103g/L、K2SO4 0. 25g/L、MgCl2 6H20 10. 12g/L、葡萄糖 10g/L、Difco酪蛋白氨基酸0. Ig/L、0xoid酵母提取物5g/L、TES 5. 73g/L。称取5. 5g Difco琼脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115° C灭菌15min。使用时，将培养基融化，每瓶中加入=KH2PO4 (0. 5%) 2. 5mL、CaCl2 2H20(5mol/l) ImL,
L-脯氨酸(20%) 3. 75mL、NaOH (ImoI/L) 2. 5mL ；斜面培养基(g/L):葡萄糖4g/L、麦芽粉(Difco) 3g/L、酵母粉4g/L、琼脂粉20g/L, pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 种子培养基(SM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、MgSO4 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L ；pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 发酵培养基(FM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、大豆粉 15g/L、K2HPO4 4g/L、MgSO4 7H20 2g/L、CaCO3 5g/L ；pH 7. 4 ；LB 培养基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的測定比色法測定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-、单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37° C时每分钟催化形成Iymol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。试剂A :IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL 0. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入
0.2mol/L pH6. 0 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0. lmol/L 羟胺 2mL，0. Olmol/L 的还原型谷胱甘肽2mL,并调节pH至6. O。试剂B :3mol/L 的 HCL，12%TCA，5%FeCL3 按 I I I 混合。配制0-4 u mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与0. 4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y-单异羟肟酸标准溶液混合，37° C水浴10分钟。加0. 4mL试剂B終止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0. 4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100° C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL) = (6.8548X0D525-0.0164) X稀释倍数应用本发明提供的启动子可使MTG产量达到4U/mL，提高了 I倍。
图IS. hygroscopicus TGase启动子上游序列缺失分析图2S. hygroscopicus TGase启动子下游序列缺失分析图3启动子优化前后发酵上清酶
具体实施例方式实施例I :MTG启动子上游缺失采用末端基因缺失的方法分析TGase天然启动子的有效序列将5’端部分缺失的MTG基因克隆至pIJ86并转化S. Iividans TK24进行TGase表达验证。如图I所示，tgl共包含TGase开放阅读框上游基因893bp，以完整tgl表达的TGase活力为对照(100%)，当tgl 5’端缺失300bp时，发酵所得TGase活力下降到57. 9% ；tgl 5’端缺失400bp时，其对应重组菌发酵液的已检测不到TGase活性。上述结果表明，TGase启动子的上游位于_593bp和-493bp之间
实施例2 =MTG启动子下游缺失确定了 TGase启动子上边界之后，采用基因缺失的方法确定其下边界。从ATG上游_98bp (核糖体结合位点上游)处向上游每隔50bp缺失。以pIJ86/tgl为模板，通过PCR扩增分别得到3’端部分缺失的TGase启动子片段、带有核糖体结合位点的TGase前体基因及TGase转录终止子；将上述PCR产物依次克隆至pIJ86，得到表达载体编码3’端部分缺失的TGase启动子片段。如图2所示，以完整tgl表达的TGase活力为对照(100%)，基因缺失至_148bp处时，TGase活力水平降低至82% ;基因进ー步缺失至_198bp时，TGase活力水平达到达对照条件下的119%;后续的基因缺失导致TGase活力水平持续下降，缺失至-498bp时,剩余的上游序列不再具有启动子活性。结合TGase启动子上下游启动子基因缺失的结果，可以发现，位于TGase开放阅读框上游_593bp与_148bp之间的序列为
S.hygroscopicus TGase启动子区域；位于_148与-198之间的片段可能是该启动子的调控区域实施例3 :用优化后的MTG启动子表达MTG由实施例I和2得到的TGase优化后的启动子序列如SEQ ID NO. I所示，利用优化后的启动子表达TGase。将构建好的工程菌转化链霉菌原生质体，具体步骤如下(I)在250mL三角瓶中加入50mL的YEME，接种100 u L的孢子悬液，于30°C摇床中培养36 40h。(2)将培养物倒入离心管中，3500r/min离心lOmin。(3)弃上清,将菌丝体悬浮于15mL的10. 3%的鹿糖溶液中，3500r/min离心IOmin,
弃上清。同此法洗两次。(4)取ImL菌丝体，加入4mL的溶菌酶溶液(溶菌酶母液为50mg/mL P Buffer,终浓度为2mg/mL,用P Buffer稀释),于30°C水浴30 60min(间_ 5min轻轻摇动)至上清呈乳状。(5)加入5mL的P Buffer并用5mL的吸管吹吸几次,继续温浴lOmin。(6)用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的离心管中，3500r/min离心7min,原生质体沉淀呈黄色。(7)弃上清，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次(洗去溶菌酶)。每次仍使用3500r/min 离心 7min。(8)弃上清，用枪头将原生质体打散，分装，于_70°C保存。(9)将最多5 ii L的DNA (质粒或酶连产物)加于已经装有50 ii L原生质体的离心管(I. 5mL)的管壁上(不与原生质体接触)。 (10)吸取200 ii L的25%PEG4000，将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次，混匀。(11)将混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。(12)30°C培养14 20h后，用含有适当抗生素的ImL无菌水溶液覆盖。
(13)再培养f 2d后，即可看到小的转化子菌落长出。将验证正确的转化子进行液体培养，种子培养接一铲生长良好的斜面培养物(也可以直接接种孢子悬液)至装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇瓶转速为200r/min，温度30°C，培养时间24h。摇瓶培养将培养好的种子按8%的接种量接入发酵瓶中，培养温度30°C，摇瓶转速200r/min，500mL三角瓶装液量为50mL，培养时间42_72h。各 培养基使用前添加阿泊拉霉素至终浓度为50y g/mL。如图3所示，MTG产量达到4U/mL，提高了 I倍。
权利要求
1.一种优化的谷氨酰胺转胺酶启动子，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.包含权利要求I所述启动子序列的表达载体。
3.包含权利要求I所述启动子的细胞系或基因工程菌。
4.权利要求I所述的启动子应用于生产谷氨酰胺转胺酶。
全文摘要
本发明公开了一种优化的谷氨酰胺转胺酶启动子，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。应用本发明提供的启动子可使MTG产量达到4U/mL，提高了1倍。通过本发明提供的启动子及发酵方法，实现了MTG在S.lividan TK24中高效率分泌性表达，适合工业化生产。
文档编号C12N15/63GK102643820SQ201210145188
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘松, 堵国成, 张东旭, 陈坚, 陈康康, 马建龙 申请人:江南大学