专利名称：一种Vc二步发酵菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及菌株筛选方法，具体的说是一种Vc 二步发酵菌株的筛选方法背景技术
Vc 二步发酵的工业化生产，其第二步发酵为两种菌的混合发酵，实现从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的生物转化。两种菌包括具有产酸能力的细菌-普通生酮基古龙酸菌 (俗称产酸菌或小菌)和不具有转化能力但却能促进小菌生长和产酸的伴生菌(俗称大菌)。
菌种选育是提高Vc 二步发酵效率的重要途径。
传统方法均需首先对待筛选小菌和大菌进行搭配，之后再进行试管或摇瓶发酵培养，最后通过测定古龙酸含量来确定小菌产酸能力的优劣。小菌与大菌间的搭配极难控制， 因其涉及到小菌数量、大菌数量和培养条件等多重因素的影响，因此各待筛选菌与大菌的搭配比例难以达到最佳，导致以测古龙酸产量为指标的筛选结果并不能真正体现小菌的产酸能力。可见，传统的筛选方法不仅工作量大，而且筛选方法准确度低，导致小菌筛选效率低下。建立一种高效、简便的小菌筛选方法是提高小菌筛选效率的关键。发明内容
本发明目的在于提供一种Vc 二步发酵菌株的筛选方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为
一种Vc 二步发酵菌株的筛选方法，将Vc 二步发酵中的转化菌和伴生菌混合培养于Vc 二步发酵的种子液中，发酵液经离心后，所获上清液为转化菌溶液A ;另将Vc 二步发酵中的伴生菌接种于培养基中培养20-28小时，培养后经无菌滤膜过滤滤液为发酵液B ;将转化菌溶液A与发酵液B按2 :1 8 :1 (v/v)混匀，而后进行稀释，取稀释液涂布于分离培养基上，在29-37°C培养4-8天后，形成转化菌的菌落；再在形成转化菌的菌落的分离培养基上加入O. I %浓度的无菌溴百里香酚兰指示液，于常温下静置O. 5 2小时，根据菌落周围的黄色圈大小判断转化效率高低，从而快速筛选出具高效转化能力的转化菌株。
所述混合菌由转化菌和伴生菌构成；转化菌为生酮基古龙酸菌，伴生菌为蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌中的一种；混合菌培养于Vc 二步发酵的种子液中伴生菌的数量为3. 0-6. OX IO8个/ml，转化菌与伴生菌的数量比在15:1左右为宜。
将Vc 二步发酵中的伴生菌以15% (m/v)的接种量于培养基中培养20_28小时， 培养液用孔径O. 22 μ m滤膜过滤除菌，所获滤液为发酵液B。
所述分离培养基按重量百分比计蛋白胨O. 3%，牛肉膏O. 3%，酵母膏O. 3%，玉米浆 0.3%，MgSO4 O. 01%, FeSO4 O. 01%，L-山梨糖 2%，pH 7. O,琼脂 2.5%，余量为水； 121 °C高温灭菌20min ;待用。
将上述生长了转化菌菌落的分离培养基用O. I %浓度的无菌溴百里香酚兰指示液覆盖，随后于常温下静置O. 5 2小时，分离培养基上菌落周围形成浅黄色圈，黄色圈大者为转化效率高的菌株。
比较各菌落周围浅黄色圈的大小,若浅黄色圈较大(当浅黄色圈直径与菌落直径的差值大于4mm时)，则该菌落的转化菌具有高效转化合成2-酮基-L-古龙酸的潜力。该菌落再经进一步摇瓶筛选，即可获得古龙酸产生菌的优良株。
本发明具有如下优点
I.本发明基于伴生菌培养液对转化菌生长和转化的促进作用及转化产物2-酮基-L-古龙酸可引起菌落周围pH降低的原理，以伴生菌的无菌培养液作为转化菌生长和转化的激活剂，以溴百里香酚蓝为指示剂，进而得到高效、简便的优良株平板初筛方法。其筛选既避免了伴生菌的存在对转化作用的影响，又保证了伴生液对转化菌生长和产酸的激活作用，而指示剂颜色的变化又能准确指示转化菌的转化能力。
2.本发明实现了转化菌的单独培养平板筛选，和传统筛选方法比较，降低工作量 50%，并大大提高筛选的准确率。
3.本发明的操作过程简单，所需试剂和材料均为实验室所常见。
4.本发明在转化菌培养过程中加入伴生菌的无菌过滤液，使转化菌在生长和产酸阶段所需伴生效应物能持续供给，促进转化菌快速生长和转化，保证了指示剂明显指示效果的获得。
5.本发明在转化菌筛选过程中，未加入伴生菌，避免了伴生菌生长对小菌及其产酸的影响，从而提高了筛选的准确性，同时极大地提高了筛选效率。
具体实施方式
本发明将Vc 二步发酵混合菌(包括两种菌株，一种为转化菌，即具有转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的菌株；另一种为伴生菌，即不具有转化能力但却能促进转化菌生长和产酸的菌株)，经2000r离心后分离出转化菌菌液A ;另外将伴生菌接种后培养20-28 小时，用无菌滤膜过滤除去菌体，获得无菌的发酵液B ;将分离的转化菌液A与无菌发酵液 B按一定比例混合并稀释后，一同涂布于分离培养基平板上，29-37°C培养4-6天，得到转化菌的平板菌落；在菌落平板上，加入少量O. I %浓度的无菌溴百里香酚兰溶液，常温静置 O. 5-1小时；比较菌落周围的黄色圈大小，黄色圈大的表明该菌株转化效率高，反之则转化效率低，继而得到能够高效转化合成2-酮基-L-古龙酸的菌株。
实施例I
I.转化菌的离心分离
将Vc 二步发酵中的转化菌和伴生菌的混合菌按数量比在15:1混合，随后30h的摇瓶发酵培养基内发酵培养，发酵液经2000rpm，IOmin离心，取其上清液即为分离出的转化菌液A。
发酵培养基玉米浆，1.5%，尿素1.2%，山梨糖8% ,MgSO4 0.01% ,蒸馏水定容至1000ml,调节pH至7. 0，121°C高温灭菌20min，摇瓶装量150ml/750ml。
转化菌为生酮基古龙酸菌，伴生菌为蜡样芽孢杆菌。
2.伴生菌发酵液无菌处理
将Vc 二步发酵中的伴生菌以15% (m/v)的接种量于发酵培养基中培养28小时， 发酵液经无菌滤膜(滤膜孔径为O. 22 u m)过滤后所得上清液即为伴生发酵液的无菌液B。
3.转化菌的平板分离培养
将离心分离的转化菌液A同伴生菌无菌液B按4:1 (v/v)的比例充分混合，混合液经梯度稀释，吸取10_6的梯度稀释液O. Iml于分离培养基平板上，用无菌三角耙均匀涂布菌体布满整个平板。而后将平板置于培养箱中，29°C培养4-6天，得到转化菌在平板上的单菌落。
所述分离培养基按重量百分比计，蛋白胨O. 3 %，牛肉膏O. 3 %，酵母膏O. 3 %，玉米浆 O. 3%,MgSO4 O. 01%, FeSO4 O. 01 %，L-山梨糖 2%，pH 7. O,琼脂 2. 5%余量为水。 121°C高温灭菌20min，待温度降到80°C左右时取30ml倒入无菌的玻璃培养皿中，凝固后备用。
4.指示剂的选择和使用
配制O. 1% (m/v)的溴百里香酚蓝溶液(O. Ig溴百里香酚蓝指示剂，溶于5ml乙醇中，充分溶解，再添加蒸馏水定容至100ml)，经无菌滤膜(滤膜孔径为O. 22 u m)过滤，所得溶液即为无菌的O. 1%溴百里香酚蓝溶液。吸取O. 5ml该溶液均匀滴加于已长有转化菌单菌落的分离平板上，18-25°C静置lh。
5.优良株筛选
观察已滴加过指示剂、且静置Ih的转化菌分离平板，比较各菌落周围浅黄色圈的大小，浅黄色圈直径与菌落直径的差值大于4mm的菌落，即为2-酮基-L-古龙酸高效转化菌株的初筛菌株。
所得菌落可再经进一步摇瓶筛选，即可获得古龙酸产生菌的优良株。
将上述获得的优良菌株和伴生菌搭配后进行发酵试验，5批摇瓶发酵，平均转化率 92. 3%，较出发菌株转化率提高3. 4%，发酵周期缩短4小时。
比较例
取Vc 二步发酵混合菌液，各以传统的随机挑取法和本发明方法进行平板筛选，比较两种方法的筛选效率和准确度。
随机挑取法将混合菌液进行梯度稀释，选择10_6稀释度的菌液，移取O. Iml的菌液均匀涂布于分离培养基平板(蛋白胨O. 3%，牛肉膏O. 3%，酵母膏O. 3%，玉米浆O. 3%， MgSO4 O. 01%, FeSO4 O. 01 %，L-山梨糖 2%，pH 7. O,琼脂 2.5%。121°C高温灭菌 20min， 待温度降到80°C左右时取30ml倒入无菌的玻璃培养皿中，凝固后备用)，29°C培养4天，在该培养基的菌落中，通过随机挑取法获得20株转化菌。
同时，按照上述本发明的实施例方法所获得另外20株转化菌。将两种方法所得的共40株转化菌分别扩大培养并和伴生菌蜡样芽孢杆菌进行搭配并发酵，测定了发酵40h时发酵液的古龙酸含量。以40h时产古龙酸含量达到62. Omg/ml以上为正突变株，62. Omg/ml 以下为负突变株。对发酵结果进行比较，结果如下表，传统的随机法在20株中共获得7株正突变株，占总数的比例仅为35%，而本发明方法获得14株菌株，占总数的比例达到70% (参见表I)。因此，与传统筛选方法相比，新方法的筛选准确性高大幅度提高。
表I
权利要求
1.一种Vc 二步发酵菌株的筛选方法，其特征在于将Vc 二步发酵中的转化菌和伴生菌混合培养于Vc 二步发酵的种子液中，发酵液经离心后，所获上清液为转化菌溶液A ;另将Vc 二步发酵中的伴生菌接种于培养基中培养20-28小时，培养后经无菌滤膜过滤滤液为发酵液B;将转化菌溶液A与发酵液B按2:1 8:1 (v/v)混匀，而后进行稀释，取稀释液涂布于分离培养基上，在29-37°C培养4-8天后，形成转化菌的菌落；再在形成转化菌的菌落的分离培养基上加入O. I %浓度的无菌溴百里香酚兰指示液，于常温下静置O. 5 2小时，根据菌落周围的黄色圈大小判断转化效率高低，从而快速筛选出具高效转化能力的转化菌株。
2.按权利要求I所述的Vc二步发酵菌株的筛选方法，其特征在于所述混合菌由转化菌和伴生菌构成；转化菌为生酮基古龙酸菌，伴生菌为蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌中的一种；混合菌培养于Vc 二步发酵的种子液中伴生菌的数量为3.0-6. OX IO8 个/ml。
3.按权利要求I所述的Vc二步发酵菌株的筛选方法，其特征在于将Vc 二步发酵中的伴生菌以15% (m/v)的接种量于培养基中培养20-28小时，培养液用孔径0.22 μ m滤膜过滤除菌，所获滤液为发酵液B。
4.按权利要求I所述的Vc二步发酵菌株的筛选方法，其特征在于所述分离培养基按重量百分比计蛋白胨O. 3%，牛肉膏O. 3%，酵母膏O. 3%，玉米浆O. 3%, MgSO4 0.01%,FeSO4 O. 01%，L-山梨糖2%，pH 7. O,琼脂2. 5%，余量为水；121°C高温灭菌20min ;待用。
5.按权利要求I所述的Vc二步发酵菌株的筛选方法，其特征在于将上述生长了转化菌菌落的分离培养基用O. I %浓度的无菌溴百里香酚兰指示液覆盖，随后于常温下静置·O.5 2小时，分离培养基上菌落周围形成浅黄色圈，黄色圈大者为转化效率高的菌株。
全文摘要
本发明涉及菌株筛选方法，具体的说是一种Vc二步发酵菌株的筛选方法。将Vc二步发酵中的转化菌和伴生菌混合培养于Vc二步发酵的种子液中，发酵液经离心后，上清液为转化菌溶液A；另将Vc二步发酵中的伴生菌接种于培养基中培养20-28小时，培养后无菌滤膜过滤滤液为发酵液B；将转化菌溶液A与发酵液B混匀后进行稀释，取稀释液涂布于分离培养基上，在29-37℃培养4-8天后，形成转化菌的菌落；再在形成转化菌的菌落的分离培养基上加入0.1％浓度的无菌溴百里香酚兰指示液，于常温下静置0.5～2小时，根据菌落周围的黄色圈大小判断转化效率高低，从而快速筛选出具高效转化能力的转化菌株。本发明筛选方法既避免了伴生菌的存在对转化作用的影响，又保证了伴生液对转化菌生长和产酸的激活作用，而指示剂颜色的变化又能准确指示转化菌的转化能力，同时极大地提高了筛选效率。
文档编号C12Q1/04GK102978131SQ201210453520
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者徐慧, 杨伟超, 韩利涛, 姜铭妍, 徐静, 张忠泽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所