专利名称：一株植物乳杆菌ccl67及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物微生物领域，涉及一株植物乳杆菌CCL67及其应用，特别涉及一株从鸡肠道中分离出来的植物乳杆菌CCL67及其应用。
背景技术：
乳酸菌是一类重要的益生菌，是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作为一种新型的绿色动物微生态制剂，因其无毒、无抗药性、无残留、无副作用而备受饲料界的广泛关注。采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物，除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对肠道的粘附作用外，主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌可以 产生乳酸，创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长；第二，乳酸菌产生H2O2,激活过氧化氢酶一硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌等；第三，部分乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类，称为细菌素，对大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。而且，有了产生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生产细菌素，可以替代抗生素，使动物生产更安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的研究热点。产生细菌素的乳酸菌来源很多，购买的工业菌株和标准菌株，有很多也可以产生细菌素，环境、土壤、泡菜、酸奶中都可以分离乳酸菌。然而益生菌最后要饲喂动物，那么相对于其他来源的菌株，动物无疑是乳酸菌的最好来源。来自动物肠道的乳酸菌可以适应动物肠道环境，耐受动物的胃酸和胆盐的消化，无疑是最好的益生菌来源。可见，通过从动物肠道分离和筛选能够产生细菌素的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCL67,其保藏编号为 CGMCC No. 6996。本发明的第二个目的是提供上述植物乳杆菌CCL67具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。本发明通过以下技术方案来实现一、一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCL67,其保藏编号为 CGMCCNo.6996。本发明中植物乳杆菌CCL67为革兰氏阳性，形态为杆状，是从笼养成年蛋鸡盲肠内容物中分离的乳酸杆菌菌株，经过产抑菌蛋白等特性测定筛选得到的目标菌株。筛选的具体步骤如下1、乳酸菌分离纯化采用无菌操作，用载玻片刮取笼养成年蛋鸡盲肠内容物lg，置于盛有9mL无菌生理盐水的玻璃试管中，充分震荡摇匀，然后吸取O. 5mL混合液于盛有4. 5mL无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10—1，重复以上过程作10倍比稀释，至10_6稀释浓度，选择10_4、10_5、10_6三个稀释度，吸取O.1mL菌液滴于MRS培养基平板上，平板涂布后采用厌氧培养法(5%C02)将涂好的培养皿置37°C培养箱培养48h。采用四分区划线法，用接种环挑取形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，经48h培养后，在四分区中挑取分离效果好的菌落用接种环接种于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4°C冰箱保存备用。2、菌体形态的观察取干净玻片，用接种环取一环无菌水于玻片上，而后挑取少量细菌，涂匀，待干燥后，固定。革兰氏染色先用草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗，接着滴加卢氏碘液覆盖lmin,用水冲洗,然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈现紫色时停止约O. 5min,最后用番红染 液复染lmin，水洗。油镜镜检(16X100)，选取革兰氏染色为阳性、形态为杆状或球状的菌株做后备菌株留用。其中，革兰氏染色试剂配制①草酸铵结晶紫染色液的配制A液结晶紫2g95%酒精20mLB液草酸铵O. 8g蒸馏水80mL混合A、B液,静置48h之后使用。②卢氏碘液碘片Ig碘化钾2g蒸馏水300mL先将鹏化钟溶解在少量水中，再将鹏片溶解在鹏化钟溶液中，待鹏全溶后加足水即可。③95%酒精④番红复染液番红2. 5g95% 酒精 IOOmL取上述配好的番红酒精IOmL与80mL蒸馏水混匀而成。3、抑菌性乳酸菌的筛选(I)菌液的制备将分离纯化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接种量各自接至新鲜MRS液体培养基中，37°C厌氧培养24h，使其菌液浓度达到108cfu/mL，测定其抑菌活性。将黄色微球菌接种于肉汤培养基中，于37°C摇床培养2代，用无菌水作10倍比稀释，使其菌液浓度达到105cfu/mL，作为指示菌备用。(2)产酸能力测定将分离纯化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接种量接至各自新鲜MRS液体培养基中，37°C厌氧培养，分别于0h、48h两个时间点用酸度计测定各实验菌株5mL发酵液的pH值。每个试验菌株发酵液作3个重复，取平均数。用0h、48h两个时间点各实验菌株发酵液的PH值变化，即Λ pH值来衡量乳酸菌的产酸能力。选取产酸能力闻的菌株进行下一步测定。(3)抑菌实验采用牛津杯法对分离纯化出的乳酸菌进行抑菌效果测定。取100 μ I指示菌液分别滴加到已凝固好的培养基中，用涂布棒涂布均匀。在无菌条件下用无菌镊子夹取4个牛津杯对称放在平皿上，然后分别吸取200 μ L乳酸菌发酵液于3个牛津杯中，另一个牛津杯中加入等量的MRS培养液作对照，于37°C下恒温培养16-18h。每个乳酸菌发酵液做2个重复，用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小，取平均数，选择抑菌环大的乳酸菌。为了尽快筛选出所需菌种，初步筛选采用了抑菌和产酸能力2项基本指标加和淘汰法。每项指标中，排在首位的加100分，位居第二的加99分，以此类推，排在最后的加I分。对初筛试验的2项结果各自进行加和并排序，选出总分较高的前10名菌株进行下一步研究。4、产细菌素乳酸菌的筛选将步骤2中筛选到的乳酸菌进行液体培养，为了减少酸的抑菌效果，对培养液用lmol/L NaOH溶液调整pH值至6. 8，然后进行牛津杯法测定抑菌环，方法同上，选择抑菌环最大的乳酸菌。再进行液体培养后，在培养液中加入O. lmg/L的蛋白酶37°C作用2h，取菌液做抑菌试验，筛选没有抑菌环的菌株，为产生抑菌蛋白的目标乳酸菌。
在上述筛选方法中，培养基为MRS培养基固体平板或斜面培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，乙酸钠5g，吐温_801g，硫酸镁O. 5g，硫酸锰O. 2g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL,pH6.8。液体培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，乙酸钠5g，吐温_801g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 2g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8。二、上述植物乳杆菌CCL67具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。采用上述技术方案的积极效果本发明从蛋鸡盲肠中分离出植物乳杆菌CCL67，此乳酸杆菌生长旺盛，10小时培养菌数就可达4. 7 X 109cfu/mL,且具有抑菌作用，可以利用培养基生产抑菌蛋白，抑制鸡肠道中大肠杆菌生长；通过此乳酸杆菌制备菌制剂饲喂雏鸡，可以提高雏鸡的生长，因此该植物乳杆菌CCL67在动物饲养尤其是家禽新型饲料添加剂开发和抗生素替代品研究上具有重大的社会意义和经济价值。
图1是植物乳杆菌的革兰氏染色镜检结果；图2是植物乳杆菌菌液的抑菌效果对比；图中，1、2为目的菌株的抑菌圈，3、4为其他分离菌株的抑菌圈；图3是蛋白酶处理后植物乳杆菌菌液的抑菌效果；图中，I为未处理的菌液，2、3和4分别为蛋白酶K，胰蛋白和木瓜蛋白酶处理的菌液；图4是植物乳杆菌的PCR扩增结果；图中，IMarker, 2植物乳杆菌；图5是植物乳杆菌的生长曲线图。本发明所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCL67,于2012年12月17日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏单位地址中国.北京.中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 6996。
具体实施例方式下面结合实施例、试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制本发明中生物材料的来源1、细菌通用引物购自上海博亚生物技术有限公司。实施例1本实施例用于说明植物乳杆菌CCL67的筛选。·1、乳酸菌分离纯化采用无菌操作，用载玻片刮取笼养成年蛋鸡盲肠内容物lg，置于盛有9mL无菌生理盐水的玻璃试管中，充分震荡摇匀，然后吸取O. 5mL混合液于盛有4. 5mL无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10—1，重复以上过程作10倍比稀释，至10_6稀释浓度，选择10_4、10_5、10_6三个稀释度，吸取O.1mL菌液滴于MRS培养基平板上，平板涂布后采用厌氧培养法(5%C02)将涂好的培养皿置37°C培养箱培养48h。采用四分区划线法，用接种环挑取形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，经48h培养后，在四分区中挑取分离效果好的菌落用接种环接种于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4°C冰箱保存备用。2、菌体形态的观察取干净玻片，用接种环取一环无菌水于玻片上，而后挑取少量细菌，涂匀，待干燥后，固定。革兰氏染色先用草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗，接着滴加卢氏碘液覆盖lmin,用水冲洗,然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈现紫色时停止约O. 5min,最后用番红染液复染lmin，水洗。油镜镜检(16X100)，选取革兰氏染色为阳性、形态为杆状或球状的菌株做后备菌株留用。结果如图1所示。其中，革兰氏染色试剂配制①草酸铵结晶紫染色液的配制A液结晶紫2g95%酒精20mL
B液草酸铵O. 8g蒸馏水80mL混合A、B液,静置48h之后使用。②卢氏碘液碘片Ig碘化钾2g蒸馏水300mL先将鹏化钟溶解在少量水中，再将鹏片溶解在鹏化钟溶液中，待鹏全溶后加足水即可。③95%酒精④番红复染液番红2. 5g95% 酒精 IOOmL取上述配好的番红酒精IOmL与80mL蒸馏水混匀而成。3、抑菌性乳酸菌的筛选(I)菌液的制备将分离纯化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接种量各自接至新鲜MRS液体培养基中，37°C厌氧培养24h，使其菌液浓度达到108cfu/mL，测定其抑菌活性。将黄色微球菌接种于肉汤培养基中，于37°C摇床培养2代，用无菌水作10倍比稀释，使其菌液浓度达到105cfu/mL，作为指示菌备用。(2)产酸能力测定将分离纯化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接种量接至各自新鲜MRS液体培养基中，37°C厌氧培养，分别于0h、48h两个时间点用酸度计测定各实验菌株5mL发酵液的pH值。每个试验菌株发酵液作3个重复，取平均数。用0h、48h两个时间点各实验菌株发酵液的PH值变化，即Λ pH值来衡量乳酸菌的产酸能力。选取产酸能力闻的菌株进行下一步测定。(3)抑菌实验采用牛津杯法对分离纯化出的乳酸菌进行抑菌效果测定。取100 μ I指示菌液分别滴加到已凝固好的培养基中，用涂布棒涂布均匀。在无菌条件下用无菌镊子夹取4个牛津杯对称放在平皿上，然后分别吸取200 μ L乳酸菌发酵液于3个牛津杯中，另一个牛津杯中加入等量的MRS培养液作对照，于37°C下恒温培养16-18h。每个乳酸菌发酵液做2个重复，用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小，取平均数，选择抑菌环 大的乳酸菌。为了尽快筛选出所需菌种，初步筛选采用了抑菌和产酸能力2项基本指标加和淘汰法。每项指标中，排在首位的加100分，位居第二的加99分，以此类推，排在最后的加I分。对初筛试验的2项结果各自进行加和并排序，选出总分较高的前10名菌株进行下一步研究。4、产细菌素乳酸菌的筛选将步骤2中筛选到的乳酸菌进行液体培养，为了减少酸的抑菌效果，对培养液用lmol/L NaOH溶液调整pH值至6. 8，然后进行牛津杯法测定抑菌环，方法同上，选择抑菌环最大的乳酸菌。结果如图2所示。再进行液体培养后，在培养液中加入O. lmg/L的蛋白酶37°C作用2h，取菌液做抑菌试验，筛选没有抑菌环的菌株，为产生抑菌蛋白的目标乳酸菌。结果如图3所不。在上述筛选方法中，培养基为MRS培养基固体平板或斜面培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，乙酸钠5g，吐温_801g，硫酸镁O. 5g，硫酸锰O. 2g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL, pH6. 8。液体培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，乙酸钠5g，吐温_801g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 2g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8。实施例2本实施例用于说明植物乳杆菌CCL67的鉴定。1、菌株属的鉴定过氧化氢酶试验将3%Η202直接加到斜面的菌苔上，观察是否有气泡的产生。若有气泡产生则为阳性反应。硝酸盐还原试验将细菌接种到培养基上，37°C培养48h，沿管壁加入甲液和乙液，观察。立刻呈现红色、橙红色为阳性反应。明胶液化试验将细菌接种到培养基上，20°C培养48h，观察。接种管液化为阳性反应。吲哚试验接种细菌于MRS培养液中，37°C培养48h。于培养液中加入二甲苯2-3mL，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入吲哚试剂2mL，二甲苯下层液体变玫瑰红色者为阳性反应。硫化氣试验将细囷接种于MRS培养液后,用无囷的慑子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面。上端用棉塞塞进。置于37°C培养48h，观察。纸条变黑为阳性反应。通过过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验和硫化氢试验，结果显示均为阴性，说明植物乳杆菌CCL67为乳酸杆菌属。2、菌株种的鉴定葡萄糖产酸产气、葡萄糖酸盐发酵和其他各类糖发酵试验在PY基础培养基中分 别加入O. 5%或1%比例的葡萄糖、葡萄糖酸盐、果糖、核糖、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖，接种，37°C培养48h。用BTB-MR作指示剂。培养基中指示剂变黄表示产酸；试管中产生气泡表示产气。用接种针分别挑取少量细菌接种于苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、水杨苷、山梨醇发酵微量鉴定生化管中，37°C培养48h。生化管中紫色变成黄色表示产酸，为阳性反应。15°C生长试验挑取几环细菌接种于MRS斜面培养基上，15°C培养48h，观察细菌是否在斜面上生长。精氨酸产氨试验接种细菌于含精氨酸的培养基中，37°C培养48h。向培养液中加奈氏试剂数滴，当产氨时出现橙黄或黄褐色沉淀，即为阳性反应。在上述筛选方法中，生化培养基及相关试剂配制如下硝酸盐还原试验培养基硝酸钾Ig ;蛋白胨20g ;磷酸氢二钠2g ;琼脂Ig ;葡萄糖Ig ;蒸馏水1000mL。将各成分溶解，调pH值为7. 2，121 °C高压灭菌20min。明胶基础培养基蛋白胨Ig ;酵母提取物Ig ;葡萄糖O.1g ;盐溶液4. OmL，蒸馏水lOOmL。pH7. O。将拟分装的试管内加入明胶O. 6g/管,再将上述配制煮沸后的培养基分装其中5mL管。115°C高压灭菌20min。硫化氢试验培养基胰胨IOg ;牛肉膏3g ;酵母提取物5g ；NaC15g ;半胱氨酸O. 4g ；葡萄糖2g ;蒸懼水IOOOmLo调pH值于7. 2,115°C高压灭菌20min。PY基础培养基蛋白胨5g ;胰蛋白胨5g ;酵母提取物IOg ;葡萄糖IOg ;无水CaCl2O. 2g ；MgS04 ·7Η200. 48g ；K2HPO4Ig ；NaHC0310g ;NaC12g，蒸馏水 lOOOmL。将上述培养基煮沸溶解后，115 °C高压灭菌20min。糖发酵培养基葡萄糖、葡萄糖酸盐、果糖、核糖、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖。在PY基础培养基中分别按O. 5%或1%的比例加入糖，用BTB-MR试剂作指示剂。分装试管，115°C高压灭菌15min。苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、水杨苷、山梨醇发酵微量鉴定生化管，为海博生物购买。盐溶液无水CaCl2O. 2g ；MgS04 ·7Η200· 48g ；K2HPO41. Og ；NaHC0310g ；NaC12. 0g。将CaCl2和MgSO4 ·7Η20混合溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后贮备于4°C。过氧化氢酶试剂3%过氧化氢。硝酸盐还原试验试剂甲液将0. 8g对氨基苯磺酸溶解于100mL5mol/L醋酸即成。乙液将0. 5ga-萘胺徐徐加热溶解于100mL5mol/L醋酸后，用脱脂棉过滤即成。
卩引哚试剂对二甲基氨基苯甲醒lg，无水乙醇95mL,浓盐酸20mL。BTB-MR试剂溴百里酚蓝(BTB) O. 2g，甲基红(MR) O. lg，95%乙醇300mL，蒸馏水200mL。精氨酸液L-精氨酸1. 5g，半胱氨酸(lg/mL H2O) O. 05mL,蒸懼水IOmL,调pH至7. O，灭菌后加3滴至PY基础培养液中。奈氏试剂将20g KI溶于50mL蒸馏水，并在此溶液中加HgI2小颗粒，至溶液达饱和为止(约32g)，然后再加460mL水和134g Κ0Η。将上清液贮存于暗色瓶中备用。糖发酵的实验结果如表1:表I糖发酵试验结果
权利要求
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCL67，其保藏编号为CGMCC No. 6996。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌CCL67具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。
全文摘要
本发明涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCL67，其保藏编号为CGMCC No.6996。本发明还提供了上述植物乳杆菌CCL67具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。本发明从蛋鸡盲肠中分离出植物乳杆菌CCL67，此乳酸杆菌生长旺盛，10小时培养菌数就可达4.7×109cfu/ml，且具有抑菌作用，可以利用培养基生产抑菌蛋白，抑制鸡肠道中大肠杆菌生长；通过此乳酸杆菌制备菌制剂饲喂雏鸡，可以提高雏鸡的生长，该菌株在动物饲养尤其是家禽新型饲料添加剂开发和抗生素替代品研究上具有重大的社会意义和经济价值。
文档编号C12N1/20GK103013893SQ20131002043
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者崔一喆, 王秋菊, 杨焕民, 郭丽, 王喆 申请人:黑龙江八一农垦大学