一种树木snp位点基因型检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种树木SNP位点基因型检测方法。该检测方法包括：步骤S1.采用扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得到长度不大于500bp的PCR扩增产物，其中扩增引物具有生物素标记；步骤S2.对步骤S1中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5’端有生物素标记的DNA单链，DNA单链包含多个待测位点；步骤S3.利用测序引物对步骤S2得到的DNA单链进行焦磷酸测序分析，其中序列读取长度为20～50bp，混合酶用量为390～395μl/plate，荧光底物用量为390～395μl/plate，得到分型结果。该检测方法延长了测序长度，一次测序检测多位点；同时节约了1/3试剂用量，降低了成本。
【专利说明】一种树木SNP位点基因型检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种树木SNP位点基因型检测方法。
【背景技术】
[0002] 焦磷酸测序分型技术主要是利用了核酸链延伸时，每添加一个核苷酸残基，就会 释放一个焦磷酸基团（PPi )，而PPi与腺苷酰硫酸(APS)在酶的催化下，会生成等量的ATP。 ATP驱动荧光素酶介导荧光素转化为氧化荧光素，释放出强度与ATP量成正比的可见光信 号。因此，由可见光信号的有无和强弱，可以判断该核苷酸残基是否连接到了核酸链末端以 及连接的数量。所以通过分别依次向以待测序DNA单链为模板的引物杂交延伸体系中加入 硫代三磷酸腺苷（dATPS，替代dATP )、三磷酸鸟苷（dGTP )、三磷酸胞苷（dCTP )和三磷酸胸苷 (dTTP)四种中的一种，通过检测是否有可见光产生以及可见光强度的大小，可以判断延伸 的核苷酸残基类型以及数量，从而达到对模板DNA单链进行测序以及基因型类型检测的目 的。
[0003] 目前，焦磷酸测序分型技术主要应用于人类医学以及动物研究领域，植物领域极 少使用，尤其是树木领域则是空白。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种树木SNP位点基因型检测方法，弥补了焦磷酸测序分型技术 在树木领域的空白。
[0005] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种树木SNP位点基因型检 测方法，该检测方法包括：步骤S1，采用扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得 到长度不大于500bp的PCR扩增产物，其中扩增引物具有生物素标记；步骤S2,对步骤Sl 中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5'端有生物素标记的DNA单链，DNA单链包含 多个待测位点；步骤S3,利用测序引物对步骤S2得到的DNA单链进行焦磷酸测序分析，其 中序列读取长度为20?50bp，混合酶用量为390?395 μ Ι/plate，荧光底物用量为390? 395μ Ι/plate，得到分型结果。
[0006] 进一步地，上述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，且正向扩增引物或 者反向扩增引物具有生物素标记。
[0007] 进一步地，上述待测位点中第一个待测位点靠近测序引物的3'末端最后一个碱 基。
[0008] 进一步地，上述步骤Sl中PCR扩增的体系为25μ 1，由20ng全基因组DNA、0. 8U Taq酶、(λ 2mM dNTPs、10 X PCR缓冲液以及50ng正向引物和50ng反向引物和超纯水组成。
[0009] 进一步地，上述步骤Sl中PCR扩增包括：步骤S11，将全基因组DNA依次在95°C 下预变性6min、95°C下变性30s，得到变性产物；步骤S12,将变性产物在50?60°C下退火 30s，得到退火产物；步骤S13,将退火产物在72°C下延伸Imin ;步骤S14,将步骤Sll至步骤 S13重复35?45次，且最后一次的步骤S13持续lOmin。
[0010] 进一步地，上述步骤S2中DNA单链制备包括：步骤S21，将PCR扩增产物与结合缓 冲液、琼脂糖珠进行混合，形成混合物；步骤S22,将混合物进行化学变性，得到具有生物素 标记的DNA单链。
[0011] 进一步地，上述树木为小叶杨，待测位点为CBF2基因的SNPl位点和SNP2位点， SNPl位点位于CBF2基因的68bp处，SNP2位点位于CBF2基因的95bp处，其中CBF2基因的 喊基序列为SEQ ID NO :1。
[0012] 进一步地，上述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，其中正向扩增引物 的碱基序列为SEQ ID N0:2,反向扩增引物的碱基序列为SEQ ID N0:3,且正向扩增引物采 用生物素进行标记。
[0013] 进一步地，上述测序引物的碱基序列为SEQ ID N0:4，SNP1位点的基因型为T和C， SNP2位点的基因型为A和G，且SNP2位点与测序引物3'末端最后一个碱基之间具有一个 喊基。
[0014] 本发明的技术方案利用了树木基因杂合度高、DNA序列多态性丰富的特点，将测序 长度由现有技术中的20bp延长到20?50bp，从而使得一次测序反应得到更多的位点基因 型信息；同时将混合酶用量和荧光底物用量均由现有技术中的588 μ Ι/plate减少至390? 395yl/plate，节约了三分之一的用量，因此在保证了检测结果准确性的基础上降低了实 验成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0016] 图1示出了实施例1的测序分型结果的基因型峰图。
【具体实施方式】
[0017] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0018] 在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种树木SNP位点基因型检测方法，上 述检测方法包括：步骤Sl，采用PCR扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得到长 度不大于500bp的PCR扩增产物，其中所述扩增引物具有生物素标记；步骤S2,对所述步骤 Sl中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5'端有生物素标记的DNA单链，DNA单链包 含多个待测位点；步骤S3,利用测序引物对所述步骤S2得到的DNA单链进行焦磷酸测序分 析，其中序列读取长度为20?50bp，混合酶用量为390?395 μ Ι/plate，荧光底物用量为 390?395μ Ι/plate，得到分型结果。
[0019] 上述技术方案利用了树木基因杂合度高、DNA序列多态性丰富的特点，将测序长 度由现有技术中的20bp延长到20?50bp，从而使得一次测序反应得到更多的位点基因型 信息；同时将混合酶用量和荧光底物用量均由现有技术中的588 μ Ι/plate减少至390? 395yl/plate，节约了三分之一的用量，因此在保证了检测结果准确性的基础上降低了实 验成本。其中的混合酶和荧光底物均为本领域进行焦磷酸测序时的常规物质，比如混合酶 为DNA聚合酶（DNA polymerase)、硫酸化酶（ATP sulfurylase)、突光素酶（Iuciferase)和 双磷酸酶（apyrase)组成的混合酶，在此不再赘述。
[0020] 上述检测方法中所应用的扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，且正向扩 增引物或者反向扩增引物具有生物素标记。
[0021] 为了提高分型结果的准确性以及增加待测位点的个数，优选上述待测位点中第一 个待测位点靠近测序引物的3'末端最后一个碱基。
[0022] 在本发明一种优选的实施例中，优选上述步骤Sl中PCR扩增的体系为25 μ 1，由 20ng全基因组DNA、0. 8U Taq酶、0· 2mM dNTPs、10XPCR缓冲液以及50ng正向引物和50ng 反向引物和超纯水组成。
[0023] 在进行步骤Sl的PCR扩增时，为了提高所得到的PCR扩增产物的浓度和特异性， 优选上述步骤Sl中PCR扩增包括：步骤S11，将全基因组DNA依次在95°C下预变性6min、 95°C下变性30s，得到变性产物；步骤S12,将变性产物在50?60°C下退火30s，得到退火产 物；步骤S13,将退火产物在72°C下延伸Imin ;步骤S14,将步骤Sll至步骤S13重复35? 45次，优选39至42次，且最后一次的步骤S13持续lOmin。
[0024] 在本发明的又一种优选的实施例中，上述步骤S2中DNA单链制备包括：步骤S21， 将PCR扩增产物与结合缓冲液、琼脂糖珠进行混合，形成混合物；步骤S22,将混合物进行化 学变性，得到DNA单链。其中，单链DNA制备的步骤S21中的结合缓冲液常为现有技术中常 用的IOmM Tris-HC1、2M NaCl、lmM EDTA和0. l%Tween20组成的缓冲液；步骤S22中化学 变性也是利用本领域的常规变性缓冲液，如70%乙醇、0. 2M NaOH溶液和洗涤缓冲液（IOmM Tris-Acetate)。对于以上DNA单链制备过程中所应用的试剂以及实际的用量，本领域技术 人员可以根据PCR扩增产物的特性和浓度，在已有背景知识的基础上，合理选择相应的结 合缓冲液和变性缓冲液。
[0025] 在本发明的一种优选出的具体实施例中，上述树木为小叶杨，待测位点为CBF2基 因的SNPl位点和SNP2位点，SNPl位于68bp处，SNP2位于95bp处，其中CBF2基因的碱基 序列为SEQ ID NO: 1。SNPl位点和SNP2位点的距离为26bp，也就是说即使相距26bp的位 点也可以采用本发明的检测方法进行检测。
[0026] 在对小叶杨的CBF4基因的SNP12位点和SNP13位点进行分析时，优选上述扩增引 物包括正向扩增引物和反向扩增引物，其中正向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO: 2，反向 扩增引物的碱基序列为SEQ ID N0:3,且正向扩增引物采用生物素进行标记。测序引物的 碱基序列为SEQ ID N0:4, SNPl位点的基因型为T和C，SNP2位点的基因型为A和G，且 SNP2位点与测序引物3'末端最后一个喊基之间具有一个喊基。
[0027] 实施例1
[0028] 从小叶杨自然分布区收集了 528株个体作为研究对象。提取每株个体的基因组 DNA后，随机挑选了 40株个体，分别对其CBF2基因进行克隆测序，通过序列比对确定候选 SNPs 位点为 SNPl 和 SNP2。
[0029] 针对两个位点的距离为26bp的SNPl位点和SNP2位点，在得到了小叶 杨CBF2基因完整序列的基础之上，设计合成了正向扩增引物的碱基序列为SEQ ID N0:2 :5' -TGCCTTCAGTTCTTGTTG-3'，反向扩增引物的碱基序列为 SEQ ID N0:3 : 5 ' -GTTTGGTTCCCGCATCTC-3 '，其中正向扩增引物用生物素进行了标记，扩增片段长度为 280bp〇
[0030] 设计合成了一条碱基序列为SEQ ID N0:4 :5' -GCTTCTTGCCTGTCA-3'的反向测序 引物，两个待检测位点SNPl的基因型为T和C、SNP2的基因型为A和G，且SNP2位点与反 向测序引物的3'末端最后一个喊基相之间具有一个喊基。
[0031] 用上述扩增引物，对小叶杨自然群体中单株的基因组DNA分别进行PCR扩增，最终 得到了 6批次、共528个的CBF2基因部分片段的PCR扩增产物。PCR扩增的体系为：20ng基 因组 DNA，0. 8UTaq 酶，0. 2mMdNTPs，10XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反向引物， 补充超纯水至25以1。？〇?扩增的条件为：预变性951：61^11，变性951：308，退火581：308， 延伸72°C lmin，40个循环，最后一次延伸72°C lOmin。
[0032] 在上述PCR扩增后得到的PCR扩增产物中，每批次随机选择10个样品，进行抽样 质检，用琼脂糖凝胶电泳的方法，检测其特异性和浓度，以判断该批次全部扩增产物是否可 以进行随后的单链制备和测序分型步骤随后在每个样品中，分别加入24μ 1的结合缓冲液 和1 μ 1的sepharose beads混合均勻，在振荡器上震荡15min，形成悬池混合物，其中，结合 缓冲液为 IOmM Tris-HCl, 2M NaCl, ImM EDTA 和 0. l%Tween20 组成的缓冲液。
[0033] 然后，将此悬浊混合物吸附到膜上，即依次置入70%乙醇、0. 2M NaOH溶液溶 液和IOmM Tris-Acetate的洗涤缓冲液中洗脱洗涤，最终在膜上得到生物素标记的 正向单链DNA，随后分别释放到含有碱基序列为SEQ ID N0:3的反向测序引物的变 性退火缓冲液中，其中变性退火缓冲液为20mM Tris-Acetate和2mM Mg-Acetate组 成的缓冲液，通过焦磷酸测序分析仪进行分型测定，测序分型参考序列设置为：TT/ CGGGCATTGAATTTGACCTCAAAGGATA/GTT。通过选取在仪器中预先设定的加样参数方案：混合 酶注剂时间84ms，荧光底物注剂时间77ms，混合酶和荧光底物用量均为392ul/plate，最后 统计分型结果，峰形图如图1所示。
[0034] 统计结果显示：SNP1位点的基因型分布为351株CC、102株TC和75株TT，SNP2位 点的基因型分布为422株GG和106株AG。由此可见，采用本发明的检测方法对相距26bp 的两个位点也能在一次检测中得到较为准确的分型结果。
[0035] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0036]
[0037]
【权利要求】
1. 一种树木SNP位点基因型检测方法，其特征在于，所述检测方法包括： 步骤S1，采用扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得到长度不大于500bp的 PCR扩增产物，其中所述扩增引物具有生物素标记； 步骤S2,对所述步骤S1中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5'端有生物素标记 的DNA单链，所述DNA单链包含多个待测位点； 步骤S3,利用测序引物对所述步骤S2得到的所述DNA单链进行焦磷酸测序分析，其中 序列读取长度为20?50bp，混合酶用量为390?395 μ Ι/plate，荧光底物用量为390? 395μ 1/plate，得到分型结果。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扩增引物包括正向扩增引物和 反向扩增引物，且所述正向扩增引物或者所述反向扩增引物具有所述生物素标记。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测位点中第一个待测位点靠 近所述测序引物的3'末端最后一个碱基。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中所述PCR扩增的体系 为25μ1，由20ng全基因组DNA、0.8U Taq酶、0.2mM dNTPs、10XPCR缓冲液以及50ng正向 引物和50ng反向引物和超纯水组成。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中所述PCR扩增包括： 步骤S11，将所述全基因组DNA依次在95°C下预变性6min、95°C下变性30s，得到变性 产物； 步骤S12,将所述变性产物在50?60°C下退火30s，得到退火产物； 步骤S13,将所述退火产物在72°C下延伸lmin ; 步骤S14,将所述步骤SI 1至所述步骤S13重复35?45次，且最后一次的所述步骤S13 持续l〇min。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中所述DNA单链制备包 括： 步骤S21，将所述PCR扩增产物与结合缓冲液、琼脂糖珠进行混合，形成混合物； 步骤S22,将所述混合物进行化学变性，得到具有所述生物素标记的所述DNA单链。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述树木为小叶杨，所 述待测位点为CBF2基因的SNP1位点和SNP2位点，所述SNP1位点位于所述CBF2基因的 68bp处，所述SNP2位点位于所述CBF2基因的95bp处，其中CBF2基因的碱基序列为SEQ ID NO :1。
8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述扩增引物包括正向扩增引物和 反向扩增引物，其中所述正向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO: 2，所述反向扩增引物的碱 基序列为SEQ ID N0:3,且所述正向扩增引物采用所述生物素进行标记。
9. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述测序引物的碱基序列为SEQ ID N0:4,所述SNP1位点的基因型为T和C，所述SNP2位点的基因型为A和G，且所述SNP2位 点与所述测序引物3'末端最后一个碱基之间具有一个碱基。
【文档编号】C12Q1/68GK104293894SQ201310298853
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 徐煲铧, 杜庆章 申请人:北京林业大学