基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒的制作方法

基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。本发明人经过比较筛选，找到了针对RSV特异性良好的环介导等温扩增引物，所述引物针对含有RSV以外的核酸不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定RSV成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
【专利说明】基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和核酸检测【技术领域】。具体地，本发明涉及基于环介导的 等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。

【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV)于1955年首次从黑猩猩 中分离出毒株。并于1955年从婴儿中分离得到与黑猩猩中株有相同抗原特性的病毒株，在 随后的研究中发现，该病毒以人为自然宿主，是引起人呼吸道感染的重要病原。该病毒在 体外感染细胞时会使相邻的细胞形成合胞体，产生块状的细胞病变，并因而得名。RSV是不 分节段的负股单链RNA病毒，属副粘病毒科，肺病毒亚科，肺病毒属；与副流感病毒，麻疫病 毒，偏肺病毒属同一科。
[0003] RSV感染人会引起上呼吸道感染，出现咳嗽，流涕，低烧等症状，下呼吸道感染在轻 度感染的婴儿中也很普遍，长时间的RSV感染会引起细支气管炎，哮喘及由肺炎引起的缺 氧，严重的可危及生命。RSV感染在婴儿和成人中都有发生，但婴儿，老人和有心肺疾病及免 疫缺陷的人更容易被感染，而且会表现出更严重的症状。大约2/3的婴儿会在出生后的第 一年之内经历RSV感染，大约90%的婴儿会在第二年经历RSV感染，几乎所有的婴儿都会在 出生两年内经历至少一次RSV感染，其中有一半会经历两次RSV感染。在小于5岁的儿童 中，20%的住院治疗，18%的急诊以及门诊是由RSV感染引起的。儿童在最初几年会经常性 的经历RSV的重复感染，即使在成年后，RSV依然可以感染同一个体。RSV的重复感染不依 赖于抗原的改变。RSV在初次感染时会引起下呼吸道感染，但在再次感染时症状会减轻，成 人经历RSV感染时基本没有症状。6周到六个月的婴儿最易发生严重的RSV感染，其高峰出 现在2到3月大小。
[0004] RSV的发病率随季节而变化，在温带地区一般在每年的冬季和初春爆发，一二月份 为发病的高峰，在热带地区爆发于雨季。RSV依据抗体反应分为A，B两个亚型，A型和B型 交替流行传播，A性为主要流行亚型并具有更强的致病性。A型和B型的交替流行为RSV频 繁的重复感染提供了一种可能的机制，即通过亚型交替可以规避由前一种流行亚型带来的 宿主免疫机制。但同一亚型的重复感染也频繁出现。
[0005] 现有技术中，呼吸道合胞病毒的检测方法主要包括病毒培养分离，酶连免疫检测， 荧光抗体检测，胶体金快速检测，多重PCR检测，荧光定量PCR检测，NASBA检测（Nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖的扩增反应），基因芯片检测的检测 技术。
[0006] 病毒培养技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病 毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测"金色标准"， 但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，灵敏度不足。而且操作程序复杂，对实验场 地和设备有生物安全等级要求，检测过程长（至少要一周以上），不能用于现场检测，对不 同病毒的检测结果不同。
[0007] 基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗 体之间的特异结合，通过偶联了显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不 依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过 程，灵敏性要比分子检测低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较 长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原漂变产生的新的病毒亚型的检测 能力也值得怀疑。
[0008] 病原的核酸分子检测通过聚合酶对病原的核酸分子进行扩增，然后利用荧光，电 泳等方法对反应过程或产物进监测，根据反应是否进行或产物是否出现来判定病原是否出 现。与普通PCR相比多重定量PCR，可以实现多种病毒的同时检测，而且反应过程可以实时 监测，还可以确定样品中病原的量，灵敏度也高于普通PCR。但基于PCR的方法都需要热循 环仪等设备，对检测场地也有要求，定量PCR还需要专门训练，这些都限制了 PCR相关技术 在快速检测中的应用。
[0009] 基因芯片等基于杂交的检测方法利用病毒特异的探针或探针组通过孵育，杂交， 显色，结果扫描等步骤实现多种病毒的高通量检测，但生产芯片需要昂贵的设备，杂交过程 耗时很久，结果检测也需要特殊仪器及专业人员。这些都限制了该种技术在快速检测中的 应用，使其只能作为一种研究手段实现对病原基因信息的分析。
[0010] NASBA也是一种恒温，连续的酶介导的核酸扩增技术，该技术同时使用T7RNA聚合 酶，反转录酶，与核糖核酸酶同过转录与反转录过程的交替进行实现模板的扩增，但该技术 需要通过分子信标等荧光探针实现结果的检测，因而需要特殊设备，且主要用于RNA模板 的检测。由于结果检测需要专门的设备，该技术主要用实验室检测，很难用于现场检测。除 了 NASBA外还有SDA，HAD，RCA等恒温扩增技术可能用于病原检测。
[0011] LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，环介导的等温扩增）是于 2000 年首次报道并在其后经过不断改进形成的一种等温，连续，快速，高特异和可视化检测的核 酸扩增方法。鉴于难以找到合适的、较广谱的扩增引物，以及，难以实现根据颜色变化进行 结果判定，目前国内外还没有RSV的RT-LAMP检测产品出现。


【发明内容】

[0012] 本发明的目的在于提供基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测方法以 及试剂盒。
[0013] 在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0014] 呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位（即以N基因起始密码子ATG 中A作为第1位起算）所示的多核苷酸；
[0015] 呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位（即以L基因起始密码子 ATG中A作为第1位起算）所示的多核苷酸。
[0016] 在一个优选例中，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示 的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所不；
[0017] 所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核 苷酸序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。
[0018] 在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备鉴定呼吸道合胞病 毒的检测试剂或试剂盒。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括：以待 测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中 包含呼吸道合胞病毒；
[0020] 其中，所述的特异性扩增引物包括：
[0021] 引物对 I :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ;
[0022] 引物对 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ;
[0023] 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0024] 引物对 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 ;
[0025] 引物对 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和
[0026] 引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0027] 在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增。
[0028] 在另一优选例中，所述的环介导等温扩增条件是：
[0029] (1)60±2°C (较佳地 60±1°C )恒温反应 60±10min(较佳地 60±5min);或
[0030] (2)① 60±2°C (较佳地 60土 1°C )30 秒，② 60°C ±2°C (较佳地 60土 1°C )30 秒 采集荧光；步骤①-②重复进行60± 10次（较佳地60±5次）。
[0031] 在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物对1-6混合物，环介 导等温扩增反应缓冲液，Bst聚合酶，AMV RTase，荧光素（较佳地为钙黄绿素）；其中，所述 的环介导等温扩增反应缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，Thermolpol RB,硫酸镁，Tween-20。
[0032] 在另一优选例中，所述的荧光素是钙黄绿素或SYBR Green I荧光染料。
[0033] 在另一优选例中，所述的荧光素是钙黄绿素；还在体系中加入锰离子溶液（如氯 化锰）；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩增产 物中存在橘黄色，则表明扩增阴性。
[0034] 在另一优选例中，所述鉴定呼吸道合胞病毒的方法是非疾病诊断方法。
[0035] 在另一优选例中，所述的引物以混合物的形式用于扩增，较佳地，
[0036] SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2在引物混合物中终浓度为0· 2 μ M ;
[0037] SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4在引物混合物中终浓度为L 6 μ M ;
[0038] SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6在引物混合物中终浓度为0· 8 μ M ;
[0039] SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:8在引物混合物中终浓度为0· 2 μ M ;
[0040] SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10在引物混合物中终浓度为L 6 μ M ;
[0041] SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12在引物混合物中终浓度为0. 8 μ Μ。
[0042] 在本发明的另一方面，提供一种用于环介导等温扩增的缓冲液，所述缓冲液包括： 甜菜喊，dNTP，Thermolpol RB,硫酸缓，Tween-20。
[0043] 在一个优选例中，所述的用于环介导等温扩增的缓冲液中，甜菜碱0.5M， dNTPL 6mM，Thermolpol RBl X，硫酸镁 6mM，Tween-200. 2%v/v。
[0044] 在本发明的另一方面，提供一种鉴定呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒中包 括：
[0045] 引物对 I :SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 ;
[0046] 引物对 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ;
[0047] 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0048] 引物对 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 ;
[0049] 引物对 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和
[0050] 引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0051] 在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：
[0052] 所述的用于环介导等温扩增的缓冲液或独立分装的甜菜碱、dNTP、Thermolpol RB、硫酸镁和Tween-20 ;含有呼吸道合胞病毒的检测标准品；RNA提取试剂；甜菜碱；Bst DNA聚合酶；AMV RTase ;和/或荧光素；如钙黄绿素；较佳地还包括锰离子溶液；更佳地为 钙黄绿素和氯化锰按浓度比1:100 (目视检测），或1:200 (real-time检测）配制而成的混 合液；说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。
[0053] 在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于从待测样品（如食品，离体 样品，药物）中鉴定呼吸道合胞病毒。
[0054] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0055] 图1、曲线为反应体系在565-590nm范围内的发射荧光随时间的变化，反应曲线 1-9依次对应实验条件表中的1-9号实验条件。
[0056] 图2、上图为用实验一中的引物组与RSV标准株反应的目视结果，表7为照片中对 应编号的反应管内所加的模板；下图为对应反应的实时荧光变化曲线。
[0057] 图3、上图为以RSV及相近种属病毒的RNA为模板测试引物组反应是否特异针对 RSV，表9为上图内反应体系对应的模板；下图为对应管的实时荧光变化曲线。
[0058] 图4、对RSAV A族毒株VR-1540 (上图）和B族毒株VR-1400 (下图）的RNA提取 液进行十倍倍比稀释后的反应过程。上图中，1号为阴性对照，2号为未稀释的模板，3-8号 依次为对RSV模板进行10,100,1000,10000,100000,1000000倍稀释。下图中，Al号为阴性 对照，A2号为未稀释的模板，A3-A8号依次为对RSV模板进行10,100,1000,10000,100000， 1000000倍稀释。

【具体实施方式】
[0059] 本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus，RSV)的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amp I i fi cat ion，LAMP)检测方法。经过比较筛选，找到了针对RSV特异性良好的引物，所述 引物针对含有RSV以外的核酸不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定RSV 成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
[0060] 本发明人通过对大量RSV基因组序列的分析，找到了在很多RSV病毒基因组中相 对保守的序列区段。所述区段是呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第609-930位所示 的多核苷酸；呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸。进 一步地，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第609-930位所示的多核苷酸的核 苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所示；所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第 2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 52-61任一所示。上述相对保守 的区段可用于制备鉴定呼吸道合胞病毒的检测试剂或试剂盒。
[0061] 基于上述RSV病毒基因组中相对保守的序列区段进行引物的筛选，获得一类可特 异性鉴定RSV的引物，其对于RSV的RNA发生特异性扩增，而对其它病毒的核酸不发生特异 性扩增。
[0062] LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比， LAMP不需要热循环仪（PCR仪），且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉 淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场、战时野外或条 件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学 研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。总体而言，LAMP法 是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建 立起总成本低廉的检测体系。
[0063] 本发明采用环介导等温扩增（LAMP)快速检测技术，设计三对针对目的序列的八 段区域的引物，利用链置换聚合酶和扩增产物自身形成的可与引物结合的颈环结构实现目 的片段的循环扩增，最终产物为一系列不同长度的目的序列的串联长链。该扩增方法的扩 增效率是PCR的100倍。同时反应的副产物焦磷酸根会大量积累，可以通过焦磷酸根和反 应体系内的镁离子形成的白色沉淀的量来监测反应的进行程度并可用来判定结果的阳性 及阴性。也可以同过钙黄绿素等金属指示剂的变色反应来指示反应的进行，并可用来试试 监测反应进程。
[0064] 因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括：引物对I :SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2;引物对2:SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4;引物对3:SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 6 ;引物对 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQID NO: 8 ;引物对 5 :SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10 ; 和引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0065] 本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物 质进行标记。
[0066] 利用本发明的引物，进行LAMP反应，可通过浊度仪检测或显色观察，快速地判断 待测样品是否含有RSV。优选地，可应用荧光素来进行结果观察。作为本发明的更优选方 式，LAMP反应体系中加入锰离子溶液；运用钙黄绿素作为荧光素，LAMP荧光检测试剂中的 钙黄绿素初始与锰离子结合以产生骤冷效应。接着副产物的焦磷酸根与锰离子结合并从钙 黄绿素上带走锰离子使其产生荧光。由此管内出现荧光即表明目标基因被大量扩增。将含 有扩增产物和嵌入式荧光染料的离心管放入紫外灯下照射产生的荧光强度更甚。
[0067] 本发明还提供了一种鉴定RSV的方法，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板， 以特异性扩增RSV的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含RSV。更 优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定RSV的特异性引物，所述方法包括：以待测样品的 RNA为模板，以引物对1?引物对6的混合引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测 样品中包含RSV。
[0068] 获取待测样品的RNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的 酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的RNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人 员熟知的。
[0069] 本发明还涉及一种用于鉴定RSV的试剂盒，所述试剂盒中含有针对RSV的LAMP扩 增引物。
[0070] 此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定RSV的试剂，如（但不限于）：含有RSV的 检测标准品；用于环介导等温扩增的缓冲液；含有呼吸道合胞病毒的检测标准品；RNA提取 试剂；甜菜碱；Bst DNA聚合酶；AMV RTase ;和/或荧光素（如钙黄绿素；较佳地还包括锰 离子溶液；较佳地为为钙黄绿素和氯化锰按浓度比1:100 (目视检测），或1:200 (real-time 检测）配制而成的混合液）；说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。
[0071] 此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定RSV的使用说明书和/或标准操作程序。
[0072] 本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测RSV的目的。
[0073] 本发明的主要优点在于：
[0074] (1)首次揭示一种可特异性鉴定RSV的引物，所述的引物特异性良好，对于RSV能 够实现特异性扩增，而对于RSV以外的其它病毒基因组不能特异性扩增。并且，所述引物具 有良好的再现性、结果稳定可靠。
[0075] (2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测RSV， 从待测样品中快速准确地区分RSV，并且所需样品量少，操作简单。
[0076] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0077] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0078] I.实验材料和方法
[0079] 病毒样品及RNA提取
[0080] 从上海南翔医院收集从09年08月到12年12月的77个呼吸道的鼻咽拭子样本， 将拭子浸入病毒运输液中，待反应前将病毒运输液分装用于核酸提取。用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) RNA提取试剂盒提取样本浸出液中的病毒RNA，并用无 RNA酶水洗 脱。洗脱液可以作为反应模板使用。
[0081] 病毒标准株包括 RSV A 族（VR-26, VR-1540)，RSV B 族（VR-1580, VR-955， VR-1400), Influenza B(VR-823), Rhinovirus(VR-283), Reovirus(VR-824), Mesales virus (VR-24)，coronavirus (VR-1558)，influenzaA (VR-825)，均购自 ATCC，括号内为 ATCC 编号。
[0082] LAMP反应缓冲液
[0083] 取 50mM 硫酸镁 3 μ I，6M 甜菜碱 2· 08 μ I，IOmM dNTPs4 μ I，10 X Thermolpol RB2. 5 μ 1，4%Tween-201. 25 μ 1，2. 02 μ I无 RNA酶水或等比例放大得到反应体系的缓冲液， 每次反应加入14.85μ1。其中lOXThermolpol RB是NEB公司的Bst DNA聚合酶大片段的 反应缓冲液，由 200mM Tris-HCl，IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100 组成，ρΗ8·8。
[0084] 反应用酶
[0085] 每次反应加入8U/ μ 1的Bst聚合酶大片段1 μ 1，IOU/ μ 1的AMV反转录酶 0. 05 μ 1。
[0086] 显色剂
[0087] IOX钙黄绿素溶液（500 μ M :5mM):取100 μ IlmM钙黄绿素母液与100 μ IlOmM氯 化锰混合或等比例扩大配制而成，每次反应加入1. 5 μ 1，用于反应结果的目视检测。
[0088] IOX钙黄绿素溶液（250 μ M :5mM):取50 μ IlmM钙黄绿素母液与100 μ IlOmM氯化 锰以及50 μ 1双蒸水混合或等比例扩大配制而成，每次反应加入1. 5 μ 1，用于反应过程的 实时监测。
[0089] RT-LAMP 反应
[0090] RT-LAMP反应体系如表1。
[0091] 表 1
[0092]

【权利要求】
1. 分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括： 呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示的多核苷酸； 呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸。
2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编 码区第610-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所示； 所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸 序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。
3. 权利要求1或2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备鉴定呼吸道合胞病毒 的检测试剂或试剂盒。
4. 一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，所述方法包括： 以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待 测样品中包含呼吸道合胞病毒； 其中，所述的特异性扩增引物包括： 引物对 1 :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物对 2 :SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物对 4 :SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物对 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和 引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的扩增是环介导等温扩增。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增条件是： (1) 60±2°C恒温反应 60±10min ;或 (2) @60±2°〇30秒，@601：±21：30秒采集荧光；步骤@-@重复进行60±10次。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物 对1-6混合物，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst聚合酶，AMV RTase，荧光素； 其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，Thermolpol RB，硫酸镁， Tween-20。
8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的荧光素是钙黄绿素；还在体系中加入 锰离子溶液；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩 增产物中存在橘黄色，则表明扩增阴性。
9. 一种用于环介导等温扩增的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液包括：甜菜碱，dNTP， Thermolpol RB，硫酸缓，Tween-20。
10. 如权利要求9所述的用于环介导等温扩增的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液中， 甜菜碱 〇? 5M，dNTPl. 6mM，Thermolpol RBI X，硫酸镁 6mM，Tween-200. 2%v/v。
11. 一种鉴定呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括： 引物对 1 :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物对 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ; 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物对 4 :SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物对 5 :SEQ ID N0:9 和 SEQ ID N0:10 ;和 引物对6:5￡〇10勵：11和5￡〇10勵：12。
12. 如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括： 权利要求9所述的用于环介导等温扩增的缓冲液或独立分装的甜菜碱、dNTP、 Thermolpo 1 RB、硫酸缓和 Tween-20 ; 含有呼吸道合胞病毒的检测标准品； RNA提取试剂； 甜菜碱； Bst DNA聚合酶； AMV RTase ； 荧光素；和/或 说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。
13. 权利要求11或12所述的试剂盒的用途，用于从待测样品中鉴定呼吸道合胞病毒。
【文档编号】C12Q1/68GK104419713SQ201310398466
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】蓝柯, 穆永林, 陈倩倩, 张驰宇 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所