鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒及含有的核酸和引物对的制作方法

鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒及含有的核酸和引物对的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种核酸，该核酸具有SEQ?ID?NO：1所示的序列。本发明还提供了扩增如上所述的核酸的引物对。本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌，该方法包括以下步骤：（1）制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；（2）以步骤（1）中得到的全基因组DNA待测样本为模板，使用如上所述的引物对进行PCR扩增；检测扩增产物中是否存在SEQ?ID?NO：4所示的核酸；（3）根据步骤（2）的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述扩增产物中不存在SEQ?ID?No：4所示的核酸的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株属于高致病型；在所述扩增产物中存在SEQ?ID?NO：4所示的核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型。
【专利说明】鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒及含有的核酸和引物对
【技术领域】
[0001]本发明涉及农作物病害防治领域，具体地，涉及ー种核酸、ー种引物对、一种鉴定真菌菌株致病型的方法和ー种试剂盒。【背景技术】
[0002]大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是ー种植物致病真菌,它可以导致植物(特别是棉花)发生黄萎病等病害。但是，不同的大丽轮枝菌菌株的致病型差别很大，例如某些致病型高的菌株感染棉花后会导致棉花的严重病害而引起农田产量的下降，而某些致病型低的菌株感染棉花后仅导致棉花的轻微病害且对农田产量影响较小。此外，大丽轮枝菌的致病型还表现出一定的潜伏性，即当年感染的高致病型菌株可能不致病，而在次年大范围地严重致病。
[0003]如果能够检测出农田中大丽轮枝菌的主要菌株类型，并对其致病型作出准确的判断，就可以结合药物防治和轮作等农业手段抑制病害的发生，从而增加经济效益和社会效益。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是解决如何准确判断大丽轮枝菌菌株的致病型的技术问题，提供一种核酸、ー种引物对、一种鉴定真菌菌株致病型的方法和ー种试剂盒。
[0005]SEQ ID NO:1所示的序列为本发明人发现的在高致病型的大丽轮枝菌菌株的基因组序列中不出现而在低致病型的大丽轮枝菌的基因组序列中出现的序列。因而，对于某一致病型待测的大丽轮枝菌菌株，只要鉴定该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可获知该大丽轮枝菌菌株是否为高致病型大丽轮枝菌。具体地，如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，则判断该大丽轮枝菌菌株属于高致病型；如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，则判断该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型。
[0006]为了实现上述目的，一方面，本发明提供ー种核酸，该核酸具有SEQ ID N0:1所示的序列。
[0007]另ー方面，本发明还提供了扩增如上所述的核酸的引物对，该引物对包括SEQ IDNO:2所示的正向引物和SEQ ID NO:3所示的反向引物。
[0008]另ー方面，本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),该方法包括以下步骤:(I)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；(2)以步骤(1)中得到的全基因组DNA待测样本为模板，使用如上所述的引物对进行PCR扩增；检测扩增产物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸；(3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述扩增产物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株属于高致病型；在所述扩增产物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型。
[0009]另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的引物对，以及PCR试剂和/或分子杂交试剂。
[0010]通过上述技术方案，本发明鉴定的高致病型的大丽轮枝菌的导致棉花发生黄萎病的平均病情指数为70.2 ;本发明鉴定的低致病型的大丽轮枝菌的导致棉花发生黄萎病的平均病情指数为11.0。
[0011]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0012]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0013]—方面，本发明提供一种核酸，该核酸具有SEQ ID NO:1所不的序列。
[0014]另一方面，本发明还提供了扩增如上所述的核酸的引物对，该引物对包括SEQ IDNO: 2所示的正向引物(5 ’ -CCCATCACCTTCAGCGACAT-3 ’)和SEQ ID NO: 3所示的反向引物(5， -AGCCTTTGAGCGAGACACCC-3，)。
[0015]另一方面，本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),该方法包括以下步骤:(I)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；(2)以步骤(1)中得到的全基因组DNA待测样本为模板，使用如上所述的引物对进行PCR扩增；检测扩增产物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸；(3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述扩增产物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株属于高致病型；在所述扩增产物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型。
[0016]其中，SEQ ID NO:4所示的核酸是SEQ ID NO:1所示的核酸的一个片段，它能够通过上述引物对以SEQ ID NO:1所示的核酸为模板而PCR扩增得到。
[0017]其中，制备待测样本的步骤可以按照本领域常规的制备用于检测核酸的样本的方法进行，本发明没有特别的要求，例如可以从棉花植株上采集组织，并且将采集的组织在含有抗性的培养基上培养，并且筛选、辨别和分离大丽轮枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版))中所述的方法提取大丽轮枝菌的基因组DNA，即可制备得到待测样本。
[0018]其中，检测扩增产物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸，可以按照本领域常规的方法和标准进行，例如可以通过核酸电泳方法或者实时定量PCR方法。
[0019]另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的引物对，以及PCR试剂和/或分子杂交试剂。
[0020]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，各种大丽轮枝菌的菌株属于经过合法渠道获得的遗传资源。
[0021]实施例1
[0022]本实施例用于说明待测样本的制备。具体地，是从80个不同的大丽轮枝菌菌株(编号为VDGl至VDG80)的基因组DNA的制备。
[0023]切取棉花植株离地表约10_35cm处的莖，切成Imm3左右大小的小块，接种在在含有抗生素(氨苄青霉素、利福平和链霉素，浓度均为lOOyg/ml)的PDA培养基(含有马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂20g/L)上，25°C下培养7天，根据大丽轮枝菌的标准菌落形态鉴别大丽轮枝菌的菌落。得到鉴别的大丽轮枝菌的菌落即作为大丽轮枝菌菌株样品。
[0024]按照上述方法，从80个不同的棉花植株中取得80个不同的大丽轮枝菌菌株，将上述80个不同的大丽轮枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法，分别提取基因组DNA样本，得到待测样本1-80。
[0025]实施例2
[0026]本实施例用于说明上述80个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型的检测结果。
[0027]参照文献(朱荷琴，冯自力，李志芳，赵丽红，师勇强.蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法鉴定棉花品种(系)的抗黄萎病性.中国棉花，2010,37(12):15-17)中的蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法，对实施例1中所述的80个不同的大丽轮枝菌菌株进行棉花苗期致病型鉴定。以所述的80个不同的大丽轮枝菌菌株在接种健康棉花植株后的病情指数来表征致病型的高低。
[0028]具体地，将大丽轮枝菌在查比克培养基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的琼脂)上培养至产生孢子，用无菌水洗下孢子得到孢子悬液，并将孢子悬液中的孢子浓度调整至5X IO6个/ml。然后，播种在纸钵的棉花幼苗至少有一片真叶展开时接种，向纸牒底部注入IOmL孢子悬浮液，将纸钵放入纸牒中，接种棉苗30株以上。接种后4周发病情况，调查采用5级分级法，分级标准:0级，健苗、无病状；1级，1-2片子叶表现病状、子叶变黄、真叶不显病状；2级，子叶和I片真叶表现病状；3级、2片真叶表现病状；4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落，顶心枯死。
[0029]根据调查结果，计算出病情指数，公式如下所示:
[0030]
病十虫栌教= Σ[病级株数该级代表数值] v
总株数发病最高级的代表数值O
[0031]本实施例检测得到了上述80个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型，通过上述鉴别标准，鉴定出其中61个大丽轮枝菌菌株的病情指数均高于35，属于高致病型，而另外19个大丽轮枝菌菌株的病情指数均低于20，不属于高致病型。
[0032]上述61个属于高致病型的大丽轮枝菌菌株分别为:VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDGl。上述19个不属于高致病型的大丽轮枝菌菌株分别为:VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51。
[0033]实施例3
[0034]按照Illumina公司的测序仪Genome Analyzer的说明书(Solexa技术)中规定的方法，测定大丽轮枝菌菌株(编号为VDGl以及VDG2)的全基因组序列。[0035]本实施例得到了上述2个不同的大丽轮枝菌菌株的全基因组序列，通过序列比对，鉴定出VDGl的全基因组序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列；而VDG2的全基因组序列中含有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0036]通过上述相同的方法，鉴定出上述80个不同的大丽轮枝菌菌株中的61个(分别为 VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl 1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDGl)的基因组的序列中均不含有SEQ ID NO:1所示的序列；并且，另外的19个大丽轮枝菌菌株(分别为VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51)的全基因组序列中含有 SEQ ID NO:1 所示的序列。
[0037]根据实施例2和实施例3的结果可以确定，如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，则该大丽轮枝菌菌株属于高致病型；如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，则该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型。
[0038]实施例4
[0039]以实施例1中分别制得的待测样本1-80作为模板进行PCR扩增，引物对包括如SEQ ID NO:2 所示的正向引物(5，-CCCATCACCTTCAGCGACAT-3，)和 SEQ ID NO:3 所示的反向引物(5 ’ -AGCCTTTGAGCGAGACACCC-3，)。
[0040]具体的扩增条件包括:94°C，10分钟；(94°C，30秒，54°C，45秒，72°C，I分钟)35个循环；72°C，10分钟，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0041]检测结果说明:上述80个不同的大丽轮枝菌菌株中，61个(分别为VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGlU VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDGl)不存在 SEQ ID NO:4 所示的核酸，证明这些大丽轮枝菌菌株均不存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，据此判断这些大丽轮枝菌菌株属于高致病型。并且，另外的19个大丽轮枝菌菌株(分别为VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80和VDG51)存在SEQ ID NO:4所示的核酸，证明这些大丽轮枝菌菌株均存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，据此判断这些大丽轮枝菌菌株不属于高致病型。
[0042]根据实施例2的结果，可知实施例4的判断结果完全正确，由此可以确定，如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列所示的序列，则该大丽轮枝菌菌株属于高致病型。
【权利要求】
1.ー种核酸，其特征在于，该核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列。
2.一种引物对，其特征在于，该引物对包括SEQ ID NO:2所示的正向引物和SEQ ID NO:3所示的反向引物。
3.—种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae),其特征在于,该方法包括以下步骤: (1)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本； (2)以步骤(1)中得到的全基因组DNA待测样本为模板，使用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；检测扩增产物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸； (3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述扩增产物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株属于高致病型；在所述扩增产物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型。
4.ー种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有根据权利要求2所述的引物对，以及PCR试剂。
【文档编号】C12R1/645GK103571834SQ201310587125
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】戴小枫, 李蕾, 陈捷胤, 马雪峰, 孔志强, 包郁明, 肖红利, 桂月晶, 徐 明 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所