一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法

一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法
【专利摘要】本发明属于基因检测【技术领域】，公开了一种检测目标核苷酸序列中单核苷酸多态性SNP位点或者点突变的方法。本发明的方法与目前普遍采用的用4种标记ddNTPs的单碱基延伸方法相比，其改进之处在于，本发明使用的自由核苷酸为标记的dNTP，其为DNA聚合酶的自然底物，所以用含标记的dNTP在进行引物延伸时，比用含标记的ddNTP时更加顺畅和准确。同时，含标记的dNTP价格低廉，利于大规模、高通量地进行检查。此外，本发明还公开了用于检测结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性SNP位点或点突变的引物以及含有该引物的试剂盒。
【专利说明】一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测【技术领域】，具体涉及一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法。
【背景技术】
[0002]研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组时代研究的主题之一。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是人类基因组中最常见的单碱基差异，在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个人对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。SNP的广泛应用前景，使之成为了后基因组时代的主要研究内容之
O
[0003]由结核分支杆菌引起的结核病是当今全球流行最广泛的传染病之一。近年来结核疫情有重新上升的趋势，其主要原因之一就是耐多药结核的流行。因此，快速、准确的实现结核耐药性检测将有助于从根本上控制结核的流行。
[0004]遗传学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变所造成。目前对结核杆菌耐药性分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。现已研究清楚耐药性是由相关基因的突变形成的，这些基因突变使得结核分枝杆菌对抗结核一线药物(利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素等)出现了耐药性，准确地检测出这些引起耐药性的突变位点，已经成为控制结核的关键问题之一。
[0005]基因突变常以单个核苷酸位点突变的形式出现，产生了单核苷酸多态性(SNP)。这些变异位点以较高的密度存在于结核分支杆菌的基因组中，从而对这些位点上核苷酸的检测成为编写相关基因图谱的有力工具。
[0006]目前已有许多检测基因多态性的方法，它们大多数都在含有目的聚核苷酸片段的反应混合物中，使用双脱氧核苷酸扩增出不同长度的扩增产物，将双脱氧核苷酸进行放射性同位素或荧光标记，然后通过检测扩增产物的长度、放射性或荧光值来对突变位点核苷酸进行测定，也可以通过严密控制条件的凝胶电泳来检测核酸内由于序列改变而引起的构
象变化。
[0007]科学研究和临床应用上都亟需能同时进行简单、有效且低成本的高通量SNP分析技术。但总体来说，现有方法普遍受到样品纯化浓缩、操作复杂，及标记检测技术的限制，能同时检出的SNPs位点数和样本数是很有限的，有的方法分析成本过高或结果的准确性不够，缺乏真实的实用性。这些技术和方法上的瓶颈，妨碍了后基因组研究的深入方法。同时，高通量低消耗地跟踪细菌也需要进一步开发简单、有效且低成本的高通量SNP分析技术，以提闻相应的检测效率。

【发明内容】

[0008]针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种检测目标核苷酸序列中单核苷酸多态性SNP位点或者点突变的方法,所述目标核苷酸序列的3’端与待测位点处核苷酸紧邻的核苷酸序列已知，该方法包括以下步骤:
[0009]1、使所述目标核苷酸序列与一条作为延伸引物的寡聚核苷酸序列杂交，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸的序列与目标核苷酸中待测位点的3’端下游序列互补。因此，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的3’端位点处核苷酸与目标核苷酸序列中待测位点处核苷酸的3’端紧邻的核苷酸也互补。
[0010]2、在反应混合物中，提供与待测位点处核苷酸具有互补碱基的被标记的dNTP。
[0011]3、在反应混合物中，相应的聚合酶在适当的条件下将与待测位点处核苷酸互补的被标记的dNTP连接到延伸引物上。
[0012]4、对延伸后的引物进行荧光偏振光值(即FP值)测定，分析所得数据，获得所检测的SNP或点突变的相关信息。
[0013]该方法的工作原理是，紧邻待测位点核苷酸3’端的序列是已知的，寡聚核苷酸引物互补于目标核苷酸内一段序列，这段与引物互补的序列5’端连接的即为待测位点，这个位点就是SNP或点突变所在位置。聚合酶反应混合物中除了目标核苷酸片段、寡聚核苷酸引物、聚合酶及其他起缓冲作用的物质外，还存在着四种用荧光素标记的*dNTP中的一种，即*dATP、*dGTP、*dCTP或*dTTP。只有互补于待测位点核苷酸的那种*dNTP才可以与引物起交联反应，加到引物的3’端上，将引物延伸，所以在延伸反应中最多只会有一种碱基延伸。例如，如果反应混合物中提供的必须是*dCTP才会引起FP的改变，显示出待测位点的碱基类型在DNA中读为G。同样地，如果反应混合物中提供的必须是*dATP才会引起FP的改变，则显示出待测位点的碱基类型在DNA中读为T。如果反应混合物中提供的必须是*dGTP，才会引起FP的改变，则显示出待测位点的碱基类型在DNA中读为C。如果反应混合物中提供的必须是*dTTP，才会引起FP的改变，则显示出待测位点的碱基类型在DNA中读为A(参见附图1)。在该*dNTP与引物连接上之后，所产生的残基亦只能与混合物中的同一种*dNTP继续连接反应以致聚合反应最终停止。对反应产物进行荧光值测定，会产生不同的荧光偏振光值(FP值)，根据所得FP值的大小，就可以得到所测位点被哪种*dNTP所产生的*dNMP占据着。
[0014]对于一个未知突变，需要四个反应，每个反应混合物中分别含有一种延伸核苷酸*dNTP，在适当的条件下，寡聚核苷酸引物与目标核苷酸片段互补后，进行单个核苷酸延伸的反应，每个反应都设置一个没有目标聚核苷酸片段但有相同量*dNTP的反应混合物，作为空白对照。
[0015]由此可见，较为完整的实验设计为，一组实验由8个反应组成，这8个反应分成4个小组，反应同时进行。这4个小组的反应混合物所含有的*dNTP的种类彼此不同。例如，第1小组含有*dCTP，第2小组含有*dATP，第3小组含有*dGTP，第4小组含有*dTTP。各个小组含有2个反应，其中1个反应用来作空白对照，对照反应没有添加目标核苷酸片段。除了在*dNTP和目标核苷酸片段上有所不同之外，反应所需的其他物质与传统DNA延伸反应所需的物质相同。
[0016]反应结束后，对每个反应混合物进行偏振光测定，比作为对照的混合物所测得的FP值有明显增加者，此反应则视为阳性反应，与阳性反应的反应混合物中所含*dNTP中碱基互补的核苷酸即为此待测位点的核苷酸。例如，第I小组中，实验组所得值比它的对照实验有明显增加，那么可以确定该位置处的碱基类型为G，反之两个值差别不显著，则可认为该位置处的碱基类型不为G，同理可判断其他3个小组的结果。
[0017]由此，在一次实验中可同时检测出待测位点上，所有存在的核苷酸，以实现基因分型或点突变的确定。同时也可以根据与空白对照的FP值相差的多少粗略估计，每种核苷酸所占比例，从而达到SNP分型的目的(参见附图2)。该方法在反应结束后，不需要对产物和引物进行分离，即可在FP检测仪上直接测定，方便、简捷、高效。
[0018]在本发明优选的实施方案中，目标核苷酸序列来源于直接从生物体获得的DNA、经过传统PCR扩增获得的DNA或已知浓度很高的cDNA。[0019]如果从样本来源处提取的DNA足量的话，就不需要将DNA进行传统的PCR扩增来获得目标核苷酸片段，而直接用从生物体提取的DNA作为目标核苷酸片段来源，当然如果可直接通过其他方式得到足够量的目标核苷酸片段，如已有浓度很高的cDNA等，也可以直接进行延伸反应。
[0020]在本发明优选的实施方案中，目标核苷酸序列来源于结核杆菌耐药相关基因的基因组DNA,其中结核杆菌耐药相关基因优选为rpo β、rpsL、rrs、embB、katG、pncA或inhA。
[0021]在本发明更加优选的实施方案中，还包括了进行传统PCR扩增来获得目标核苷酸片段的步骤。
[0022]在本发明最优选的实施方案中，在进行传统PCR扩增后还包括将目标核苷酸片段从PCR反应混合物中纯化分离的步骤，其中纯化分离的步骤是通过虾碱性磷酸酶(SAP)和Exol在适当条件下进行酶切或者通过凝胶电泳完成的。
[0023]首先通过传统的一对PCR引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出包含待测位点处核苷酸的目标核苷酸序列(如embB基因)，此处将这对PCR引物分别称为第一和第二引物。然后将被扩增出来的产物，即目标核苷酸，从PCR反应混合物中纯化分离出来。这个步骤可以通过虾碱性磷酸酶(SAP)和Exol在适当条件下酶切来实现。纯化后的扩增产物继而与第三引物反应，此第三引物是一段与目标核苷酸序列互补的一段寡聚核苷酸，它的3’端与待测位点处核苷酸紧邻的核苷酸互补。也就是说，延伸反应一经起动，将被连接在引物3’端的，即是与目标核苷酸上待测位点的核苷酸互补的*dNTP。最后，在反应结束后，将反应混合物转移在384孔板上，离心后测定FP值，并对此值进分析，得出结果，根据结果即可获得结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性或点突变的类型，进而确认该结核病患所携带的结核分枝杆菌的耐药性。
[0024]上述过程中，以SAP及Exol酶切的目的在于去除dNTP及第一和第二引物对实验的干扰，防止这些物质与第三引物进行反应，对第三引物与*dNTP的反应产生干扰。
[0025]在本发明的检测方法中，如果检测仪器灵敏度很高，也可以用小量的DNA，预期结果也会很理想。此外，PCR扩增的引物和条件如果高度特异，在PCR扩增后，也可以不必进行产物纯化的步骤。
[0026]在本发明的检测方法中，扩增目标核苷酸所用的PCR引物应距待测位点足够远，以满足延伸反应时容纳一个第三引物的要求，第三引物的长度为少于60个碱基较好，优选为15至55个碱基。
[0027]在本发明优选的实施方案中，作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的5’端可以固定在固相表面上。反应结束后，将固相表面清洗，以除去未与引物发生连接的*dNTP，测定荧光值，与对照的荧光值进行对比。如果荧光值比起对照值有明显的变化，则认为实验结果为阳性。若待测位点上的碱基类型为A，则在延伸反应中就会引入一个*dTTP，若待测位点上的碱基类型为C，则在延伸反应中就会引入一个*dGTP，以此类推。如果没有得到阳性结果，可以把另一种*dNTP和聚合酶加到反应混合物中，进行第二轮延伸反应。如果第二轮延伸反应仍然没有检测到有链的延伸，那么就可用不同于第一和第二轮所用的*dNTP的另一种，进行第三轮反应，直到检测到阳性的结果。
[0028]为了使实验能够得到完整的信息，也就是说可用不同的*dNTP，在每一个延伸反应后作清洗，进行4个连续反应。如果在DNA芯片上进行此实验，就可能很方便地得出完整的实验结果。
[0029]在一些特殊情况下，并不需要在待测位点的SNP多态性中测试所有可能存在的4个碱基，若这些特殊的多态性只有两种碱基构成，则只需要较少的延伸反应次数就会得到相应的完整的结果。在另一些情况下，某个特定的核苷酸残基位点上出现某种类型的碱基意味着一种重要的疾病，则只需要得知这个位点是否为某一特定类型的碱基占据，就可以知道结果，由此得知，此时所需的延伸反应更少，节约了筛选的成本。
[0030]本发明的 另一方面还提供了用于检测结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性SNP位点或点突变的延伸引物,其序列如表2所示,分别用于对rpoB、rpsL、rrs、embB、katG、或inhA基因进行检测。
[0031]本发明的再一方面还提供了用于检测结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性SNP位点或点突变的试剂盒，其含有如上所述的引物。
[0032]在本发明优选的实施方案中，试剂盒中还含有用于扩增相应结核杆菌耐药相关基因的引物对序列。在本发明更加优选的实施方案中，用于扩增相应结核杆菌耐药相关基因的引物对序列如表1所示。
[0033]本发明所采用的上述单碱基延伸方法，与目前普遍采用的用4种标记ddNTPs的单碱基延伸方法相比，其改进之处在于，本发明的方法中使用的自由核苷酸为标记的dNTP。由于dNTPs是DNA聚合酶的自然底物，而ddNTPs则不是，所以用含标记的dNTP在进行引物延伸时，比用含标记的ddNTP时顺畅和准确。同时含标记的ddNTP十分昂贵，而含标记的dNTP则便宜很多，有利大规模、高通量运作。
[0034]此外，本发明所采用的上述方法，在一次实验中即可同时检测出待测位点上所有存在的核苷酸，以实现基因分型或对点突变的确定。同时也可以根据与空白对照的FP值相差的程度粗略估计每种核苷酸所占的比例。本发明所用的方法在反应结束后，不需要对产物和引物进行分离，即可在FP检测仪上直接测定，方便，简捷。
[0035]最后，本发明所采用的上述方法，不仅可以在固相表面上完成，例如98孔板、384孔板或芯片等，也可在液相中进行，例如电泳及直接使用荧光及FP检测仪器等。当在液相中采用本发明的方法时，可以直接进行测定，不需要在延伸完成后对产物进行分离和纯化。【专利附图】

【附图说明】
[0036]图1:以rpoB S531L为示例的本发明检测SNP或点突变的流程图。
[0037]图2:采用本发明的检测SNP或点突变的方法获得的FP代表图。
【具体实施方式】
[0038]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0039]实施例1:MTB菌株及药敏试验
[0040]从广东省结核防治研究所(ARI)的临床样本分离获得121例肺结核分歧杆菌(MTB)菌株。MTB的鉴定基于标准的微生物检测，包括菌落形态、抗酸染色和生化检查(WH01998a;WH01998b)。比例法被用于药敏试验，其中药物浓度为利福平(40 μ g/ml )，链霉素(4μ g/ml),乙胺丁醇(2μ g/ml)和异烟肼(0.2 μ g/ml XCanetti et al.1969)。MTB 菌株生长在改良罗氏(LJ)培养基上，涡旋生成基于浊度为lmg/ml的悬浮液，并稀释到0.01mg/ml和0.1 μ g/ml。取这些稀释悬浮液的0.01ml分别在添加或未添加抗生素的LJ培养基上恒温37°C生长4周。当含抗生素的培养基上菌落计数与无抗生素的培养基上的菌落计数相比，大于等于1%时，则认为菌株该具有抗生素抗性。当0.1 μ g/ml细胞悬液中取得的
0.01ml接种物小于等于20时，重新对培养物进行测试。
[0041 ] 实施例2 =MTB菌株的基因组DNA的提取
[0042]提取基因组DNA基本上如前所述(Ramasubban et al.2011)。MTB菌株在100°C煮沸10-15分钟，然后离心，12，OOOrpm离心10分钟，上清液用作模板DNA。
[0043]实施例3 =MTB耐药相关基因目标区的PCR扩增
[0044]采用表1(A)所示的PCR引物对MTB抗利福平，链霉素，乙胺丁醇和异烟肼的rpoB，rpsL, rrs, embB, katG和inhA基因的相关区域进行扩增,扩增获得的基因片段如下(NCBI参考序列:NC_000962.3，2013 年 5 月):
[0045]UrpoB:碱基 1253 到 1570 (碱基 761059 到 761376，NC_000962.3)；
[0046]2、rpsL:碱基 55 到 575 (碱基 781614 至 782134，NC_000962.3)；
[0047]3、rrs:碱基 438 到 1065 (基地 1472283 到 1472910，NC_000962.3)；
[0048]4、embB:碱基 649 到 1260 (碱基 4247162 至 4247773，NC_000962.3)；
[0049]5、katG:碱基 781 到 1532 (碱基 2154580 到 2155331，NC_000962.3)；
[0050]6、inhA:调节区碱基-979 到-683 (碱基 1673223 到 1673519，NC_000962.3)。
[0051]扩增在20 μ I反应混合物中进行。其中含有40ng的MTB DNA，125nM的引物，200 μ M的四种dNTPs，1 X PCR缓冲液(IOmM的Tris_HCl，pH值9.0，1.5mM的氯化镁和50mM氯化钾)和1U Taq DNA聚合酶(TAKARA，大连，中国)。PCR反应在95°C变性3分钟，然后35个循环包括95°C 30秒，56 V 30秒，72°C 45秒，72°C最终延伸5分钟。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭染色，以确认片段长度和不存在非特异性产物的存在。
[0052]为了除去未掺入的引物和核苷酸，20μ 1的PCR产物加入到终体积40 μ 1的反应混合物中进行处理。其中包含IX虾碱性磷酸酶(SAP)缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH值8.0，IOmM MgCl2)中，2.4单位核酸外切酶1 (TAKARA), 3.6单位SAP (GE医疗集团，白金汉郡，英国)，在37°C 45分钟，然后85°C 15分钟。处理后的产物作为模板进行DNA测序和单碱基延伸反应。
[0053]表1、扩增耐药性相关基因片段所采用的PCR引物对
[0054]
【权利要求】
1.一种检测目标核苷酸序列中单核苷酸多态性SNP位点或者点突变的方法，所述目标核苷酸序列的3’端与待测位点处核苷酸紧邻的核苷酸序列已知，所述方法包括以下步骤: (a)使所述目标核苷酸序列与一条作为延伸引物的寡聚核苷酸序列杂交，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸的序列与目标核苷酸中待测位点的3’端下游序列互补，因此，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的3’端位点处核苷酸与目标核苷酸序列中待测位点处核苷酸的3’端紧邻的核苷酸也互补； (b)在反应混合物中，提供与待测位点处核苷酸具有互补碱基的被标记的dNTP； (c)在反应混合物中，相应的聚合酶在适当的条件下将与待测位点处核苷酸互补的被标记的dNTP连接到延伸引物上； Cd)对延伸后的引物进行荧光偏振光值(即FP值)测定，分析所得数据，获得所检测的SNP或点突变的相关信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其中目标核苷酸序列来源于直接从生物体获得的DNA、经过传统PCR扩增获得的DNA或已知浓度很高的cDNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中目标核苷酸序列来源于结核杆菌耐药相关基因的基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其中结核杆菌耐药相关基因为rροβ、rpsL、rrs、embB、katG、pncA 或 inhA。
5.根据权利要求3所述的方法，其中还包括了进行传统PCR扩增来获得目标核苷酸片段的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在进行传统PCR扩增后还包括将目标核苷酸片段从PCR反应混合物中纯化分离的步骤。
7.根据权利要求6所述的方 法，其中纯化分离的步骤是通过虾碱性磷酸酶(SAP)和Exol在适当条件下进行酶切或者通过凝胶电泳完成的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的长度为15-55个喊基。
9.根据权利要求1或3所述的方法，其中作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的5’端固定在固相表面上。
10.用于检测结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性SNP位点或点突变的延伸引物，其序列如表2所示,分别用于对rpoB、rpsL、rrs、embB、katG、或inhA基因进行检测。
11.含有权利要求10所述引物的试剂盒，用于检测结核杆菌耐药相关基因中单核苷酸多态性SNP位点或点突变。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中还包括用于扩增结核杆菌耐药相关基因的引物对序列。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中用于扩增结核杆菌耐药相关基因的引物对序列如表1所示。
【文档编号】C12N15/11GK103882114SQ201410010069
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】薛红, 赵存友, 王子晖 申请人:华晶基因技术有限公司