鸡外周血单核淋巴细胞pd-l1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子病理学与免疫学【技术领域】，涉及鸡外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集雏鸡淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD-L1目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD-L1目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD-L1的基因丰度。本发明的PD-L1基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。
【专利说明】鸡外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子病理学与免疫学【技术领域】，具体涉及鸡外周血单核淋巴细胞PD-Ll重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起雏鸡的一种急性、高度接触性传染病。研究表明，IBDV感染后可引起机体的免疫抑制状态和持续性感染。病毒感染的靶器官为法氏囊，病毒在B细胞内复制导致法氏囊淋巴滤泡损伤、破坏，B淋巴细胞溶解。同时，病毒在法氏囊单核-巨噬细胞系统内复制导致炎性介质的大量分泌、病毒扩散和损伤加剧，形成败血性休克综合征，导致严重的B细胞免疫反应抑制，并加剧了病鸡的死亡。另外，IBDV感染后前B淋巴细胞增殖的抑制和凋亡的发生，也是造成体液免疫抑制的重要原因。
[0003]程序性死亡配体(PD-Ll)及其程序性死亡受体-1 (PD-1)是⑶28 / B7超家族成员，广泛表达于各种组织。ro-1 / ro-L共刺激信号视机体的炎症程度、免疫状态和遗传背景不同而激活或抑制，主要参与T细胞的中枢及外周免疫耐受。与其他CD28超家族成员相t匕，ro-1 / ro-L信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用，与自身免疫病、肿瘤、慢性感染及炎症密切相关。在免疫调节方面，PD-Ll与其受体ro-Ι共同介导ro-l:PD-L信号通路的激活，在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，对抗原特异性T、B细胞的功能、T细胞的增殖、细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能。经相关研究证实，一些病毒的感染可以诱导ro-Ll及其受体PD-1的表达，从而影响ro-1:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤，引起机体产生免疫抑制和持续性感染。因此，PD-Li及其受体ro-1近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点，而在动物免疫抑制性疾病或病毒持续性感染方面，T细胞免疫抑制通路ro-1=PD-Ls的研究才刚刚起步，特别是在家禽类该方面的研究还少见报道。
[0004]近年来，实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)技术为基因丰度检测提供了全新的方法，和传统的方法相比，具有敏感性高、特异性强、操作简便、成本低以及定量准确被广泛应用，它可以通过检测目标序列PCR扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的。然而对鸡外周血单核细胞中ro-Ll基因的丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于:本发明提供了一种鸡外周血单核淋巴细胞ro-Ll实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法；
在此基础上本发明建立了一种ro-Ll基因丰度的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；
本发明通过研究外周血单核细胞中PD-Ll的变化规律，为鸡ro-Ll分子检测的定量分析提供了技术平台，并能用于分析鸡感染免疫抑制性疾病后ro-Ll基因的转录水平的变化规律中。
[0006]本发明的技术方案:
鸡外周血单核淋巴细胞PD-Ll实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，包括以下步骤:
采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20°C，采用普通PCR方法扩增I3D-Ll目的基因片段；
采用普通PCR方法扩增PD-Ll目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将I3D-Ll目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5 α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；
其中普通PCR扩增时的反应体系为25 μ L，反应体系如下:2 μ L样品cDNA模板，2.5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTP，浓度均为20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水；
正向引物 F 为:5' -TTCAGGGACGGATAAAGCTG-3'
反向引物 R 为:5' - AAAGCCCCG CGTCTCTGAGCTTC-3'。
[0007]所述目的基因片段为序列表的SEQ ID N0.1序列。
[0008]其中普通PCR扩增时的反应程序为:95°C热启动Imin ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30个循环，最后72°C延伸IOmin0
[0009]一种鸡外周血单核淋巴细胞ro-Li基因的丰度实时检测方法，包括以下步骤:
(1)将回收纯化的ro-LI目的基因片段与pMD 18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5a中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与H)- LI目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按I: 10倍的浓度梯度稀释阳性质粒；
(2)以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中I3D-Ll的基因丰度；
其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20 μ L，包括2 μ L质粒模板，浓度为20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6 μ L ；
正向引物 F 为:5' -TTCAGGGACGGATAAAGCTG-3'，
反向引物 R 为:5' - AAAGCCCCG CGTCTCTGAGCTTC-3'。
[0010]所述目的基因片段为序列表的SEQ ID N0.1序列。
[0011]其中实时荧光定量PCR反应程序为:95°C热启动30s ;94°C变性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C时收集荧光信号，再40个循环；
采用的实时荧光定量PCR仪为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。
[0012]所述稀释的阳性质粒浓度范围为浓度范围为3.42X 1010-3.42X IO1Copies/μ L ；标准曲线的相关系数R2=0.991，斜率为-3.511。[0013]所述的检测方法在分析鸡感染免疫抑制性疾病后ro-Ll基因的转录水平变化规律中的应用。
[0014]本发明的积极有益效果:
本发明建立了鸡外周血单核细胞中PD-Ll基因丰度的实时荧光定量PCR的方法，为更好的对鸡免疫抑制状态下ro-Li的转录水平进行准确定量，进而研究外周血单核细胞中PD-LI的变化规律，为鸡ro-Ll分子检测的定量分析提供了技术平台，并为ro-Ll在鸡免疫抑制性疾病中发挥的生物学功能及其应用机制奠定基础。
[0015]本发明所公开的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对IO9~IO1 copies/μ L的9组不同浓度标准阳性质粒进行检测，结果显示:本发明中TO-Ll的检测下限为10 copies/μ L，其浓度与Ct值之间有较好的线性关系，相关系数R2=0.991 ；利用建立的方法进行重复性试验，组内和组间重复性试验结果表明，变异系数均在3%以内，具有较好的重复性；从溶解曲线图可知，PD-Ll分子溶解曲线出现单一狭窄峰(图4)，且琼脂糖凝胶电泳分析表明，Real-time RT-PCR扩增结果为单一特异性目的片段(图5)，说明本发明具有较好的特异性；另外本技术方案还具有检测通量高、操作简便、成本低以及定量准确等特点。
[0016]本发明通过实验证实，鸡传染性法氏囊病病毒IBDV感染后，随着病毒在机体内复制ro-Ll的表达量逐渐升高，说明IBDV的感染及病毒载量与鸡ro- LI基因丰度的变化关系十分密切；并证实了鸡IBDV感染后ro-Ll表达变化与IFN-Y、IL-2细胞因子的表达变化之间存在一定关系，鸡ro-Ll表达升高后激活了 ro-1 =PD-Ls信号通路，引起了鸡τ细胞免疫功能和增殖活性的下降，导致康复鸡或亚临床感染鸡免疫抑制反应的持续存在。
[0017]本发明的鸡ro-Ll基因实时荧光定量PCR检测方法，为检测鸡感染免疫抑制性疾病(如鸡传染性法氏囊病IBD、鸡马立克氏病MD、鸡传染性贫血CIA，鸡白血病ALD和鸡网状内皮组织增生病RE等)所导致的免疫抑制状态中I3D-Ll的表达变化规律提供了技术平台，从而进一步丰富了鸡免疫抑制性疾病引起免疫抑制的机理。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为琼脂糖凝胶检测鸡ro-Ll基因扩增结果；
图2为鸡ro-Ll实时荧光定量分析扩增曲线；
图3为鸡ro-Ll实时荧光定量分析标准曲线；
图4为鸡ro-Ll实时荧光定量分析标准品溶解曲线；
图5为鸡ro- LI实时荧光定量产物特异性分析结果；
图6为鸡感染IBDV不同时期T细胞中PD-Ll基因的拷贝数；
图7为鸡感染IBDV不同时期体内IBDV病毒载量半定量PCR检测结果；
图8为鸡感染IBDV不同时期IFN-Y基因的拷贝数； 图9为鸡感染IBDV不同时期IL-2基因的拷贝数；
图10为实验组鸡感染IBDV康 复后胸腺T细胞增殖活检测；
图11为对照组鸡感染IBDV康复后胸腺T细胞增殖活检测。
【具体实施方式】[0019]在本发明中，基因拷贝数、基因丰度代表同样的概念；Real-time PCR、实时荧光定量PCR表示同样的概念；ddH20表示双蒸水；IBDV表示鸡传染性法氏囊病病毒；CFSE为一种可以标记活体细胞的荧光染料。
[0020]实施例中的实验动物和菌种:1日龄健康雏鸡，SPF隔离器中饲养至4周龄；IBDV，LD50IOV0.1 mL，为本实验室分离并保存；大肠杆菌感受态细胞DH5 α，为本实验室保存。
[0021]主要试剂和仪器:淋巴细胞分离液，购自天津灏阳生物制品科技有限公司；IBDV快速检测试纸条，购自河南百奥生物工程有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、pMD 18-T载体，均购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Green I,购自Invitrogen公司。
[0022]实施例1鸡ro-Ll实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建
采集4周龄雏鸡的外周血，参照淋巴细胞分离液的说明书分离外周血的淋巴细胞，参照Invitrogen公司TRIzol试剂盒说明书和相关文献进行总RNA的提取。提取的总RNA参照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，保存于-20°C备用，用于扩增H)-L1目的基因片段的模板。
[0023]采用普通PCR方法扩增H)-L1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将I3D-Ll目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5ci中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；
所述目的基因片段为序列表中SEQ ID N0.1序列:
【权利要求】
1.鸡外周血单核淋巴细胞ro-Ll实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20°C，采用普通PCR方法扩增I3D-Ll目的基因片段； 采用普通PCR方法扩增ro-Li目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将I3D-Ll目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5a中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒； 其中普通PCR扩增时的反应体系为25 μ L，反应体系如下'2 μ L样品cDNA模板，2.5 μ LIOXPCR Buffer,2y L dNTP，浓度均为20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5μ L，0.5μ L的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水； 其中，正向引物 F 为:5' -TTCAGGGACGGATAAAGCTG-3' 反向引物 R 为:5' - AAAGCCCCG CGTCTCTGAGCTTC-3'。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于:所述目的基因片段为序列表的SEQID N0.1 序列。
3.根据权利要求1或2所 述的构建方法，其特征在于:其中普通PCR扩增时的反应程序为:95°C热启动Imin ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，30个循环，最后72°C延伸IOmin0
4.一种鸡外周血单核淋巴细胞ro-Ll基因的丰度实时检测方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)将回收纯化的ro-LI目的基因片段与pMD 18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5a中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与H)- LI目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按I: 10倍的浓度梯度稀释阳性质粒； (2)以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中I3D-Ll的基因丰度； 其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20 μ L，包括2 μ L质粒模板，浓度为20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6 μ L ； 其中，正向引物 F 为:5' -TTCAGGGACGGATAAAGCTG-3'， 反向引物 R 为:5' - AAAGCCCCG CGTCTCTGAGCTTC-3;。
5.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:所述目的基因片段为序列表的SEQ ID N0.1序列。
6.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应程序为:95°C热启动30s ;94°C变性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C时收集荧光信号，再40个循环。
7.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应时采用的实时荧光定量PCR仪为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。
8.根据权利要求4-7任一项所述的丰度实时检测方法，其特征在于:所述稀释的阳性质粒浓度范围为浓度范围为3.42X1010-3.AZXlOkopies/yL ;标准曲线的相关系数R2=0.991，斜率为-3.511。
9.权利要求4-7任一项所述的检测方法在分析鸡感染免疫抑制性疾病后I3D-Ll基因的转录水平变化 规律中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103789335SQ201410038957
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】王选年, 冯春花, 孙国鹏, 王爱国, 张艳芳, 朱艳平, 李鹏, 岳锋, 张万方, 李博文, 杨媛, 阮涛, 王军 申请人:新乡学院