用于二恶英类物质生物检测的重组载体和细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的重组细胞。本发明还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。
【专利说明】用于二恶英类物质生物检测的重组载体和细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的重组细胞。本发明还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。
【背景技术】
[0002]环境污染问题一直伴随着人类社会的发展进程而日益复杂化及多样化，这使得环境污染对人类的健康所带来的负面影响也日益严重。世界卫生组织(WHO)在其《2004年世界卫生报告》中指出在全球范围内估计24%的疾病负担(健康寿命年损失)和23%的所有死亡(早逝)可归因于环境因素，而其中最主要的因素之一就是日益加剧的化学污染物。在众多的化学污染物中，持久性有机污染物(POPs)因为其自身的物化特性和对人类健康的严重威胁受到全球极大的重视。[0003]二恶英类化合物(Dioxins)是一类典型的持久性有机污染物，也是斯德哥尔摩公约中首批被列入对人类健康和生态环境有害的持久性有机污染物。国际癌症研究中心已将其列为人类一级致癌物。持久性有机污染物(POPs)具有生物蓄积性、半挥发性和持久性等特点(Vallack etal., 1998; Jonesand de Voogt, 1999)。151 个国家的政府签署的斯德哥尔摩公约“关于持久性有机污染物”，旨在消除或控制至少12种持久性有机污染物(环境署，2006年)。根据本公约，建立持久性有机污染物的排放清单是强制性的，这为进一步减少排放量奠定基础。因此，在环境中持久性有机污染物监测是重要的第一步(WH0，1999)。其中，持久性有机污染物，多氯二苯并二恶英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)和多氯联苯(PCBs)，即所谓的“二恶英类化合物”，是目前公开的监管和科学关注对象，因为这些化合物具有广泛的毒性效应，包括免疫毒性、发育毒性、生殖毒性、神经毒性和致癌性(Kerkvliet，1995;Brouwer, 1991;Nebert et al.，1993)。
[0004]高分辨率气相色谱/质谱被认为是分析二恶英类物质的黄金标准方法。高分辨液相质谱连用具有灵敏度高、结果准确等优点，但是检测费用相当高昂，并且检测周期长，需要样品量大，使其在环境、食品和卫生等领域开展二恶英类化合物污染状况筛查中的应用受到一定限制。另外，由于化学分析仅限于17种二恶英/呋喃的风险评估，而对其他的有毒多卤代芳香烃化合物(PHAHs)，包括氟化、溴代和混合卤化二恶英/呋喃以及偶氮、氧化偶氮化合物、联苯醚、萘、硫类似物等二氧芑类物质和烷基化的二氧芑类物质则不能指示。此外，化学方法会忽略二恶英类化合物潜在的协同或拮抗作用。在环境中，二恶英类化合物共存的复杂性以及各种同系物的混合物和多级二恶英类化合物之间的相互作用可以调节他们的潜在毒性。大量的研究表明二恶英类化合物和非添加剂之间的相互作用(Davis andSafe, 1990; Harper et al., 1995)。因此,化学分析既不高通量监测环境二恶英类化合物也不适合生物毒性的预测，急需要快速而廉价的生物检测方法。
[0005]为了克服化学分析方法的限制，国际上已经开发出各种生物检测法，主要包括:EROD (ethoxyresorufin-O-deethylas)、ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay)和 CALUX (chemical-activatedluc if erase expression)。这些生物测定的方法是根据多项研究成果(Nebert et al., 1993; Lucieret al., 1993; Safe, 1990; SchmidtandBradfield, 1996)。二恶英类化合物的毒性是通过芳香烃受体(AHR)配体依赖的转录因子介导的(Nie et al.，2001)。目前二恶英类化合物结合芳香烃后，芳香烃受体复合物进行变构和AHR核转运蛋白(ARNT) 二聚合相互作用。这种异源性的配体复合物(AhR-Arnt)结合到基因启动区的二恶英反应元件(DRE)上，DRE序列的结合导致DNA弯曲、干扰染色质和和核小体，从而激活基因的转录。随后，P4501A1蛋白合成增加并诱导P4501A1酶活性增加，然后产生一系列生物学反应和毒性效应。因此，分析P4501A1依赖的EROD酶活性变化可以指示外源物质的影响。但是，EROD法灵敏度低，限制了其应用范围。ELISA法有很好的特异性，然而该方法不能反映样品的总毒性当量，而且检测过程都需要大量而且昂贵的抗体，增加了检测成本。CALUX法成本低，而且灵敏度高，被认为是最好的生物检测二恶英类物质的生物方法。
[0006]CALUX方法由美国科学家Denison及其同事在1996年发明(MurkA.J etal.，1996)，该技术已经在多国包括我国获得了多项相关专利。目前，美国、欧盟以及日本已经建立和完善了基于该方法的标准，例如US EPA Method4435,EU Commission RegulationN01883/2006,以及日本的N0.92-1-1。因此，在我国开发二恶英生物检测的CALUX方法迫在眉睫。二恶英类物质可以激发Ah受体(AhR)，这种DNA结合蛋白质接触二恶英类物质时能够产生相应的毒性和生物学反应从而引起化学响应。经过遗传工程处理过的商品化细胞株含有萤火虫荧光素酶基因，通过进入AhR受体激活。这些细胞株可以用于混合物对AhR激发响应的灵敏检测和相对含量确定。这种细胞体外测定法称之为化学响应荧光素酶基因表达或CALUX分析法。能够激发这一体系的化合物主要是多氯代芳烃如2，3，7，8-四氯二苯并二恶英(T⑶D)。卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)以及一些天然化合物都可以活化该系统，即该系统特异性不够高，所以目前所用的CALUX系统并不能区分检测这些可以激活AhR的化合物，可以通过有效的前处理方法达到区分和检测二恶英类化合物的目的。其他类多氯代芳烃的相对毒性和生物效应可以转化成相对2，3，7，8-TCDD毒性的值来衡量。因为该物质能最强最有效的激活AhR反应，包括基因转录。这种相对定量的方法可以得到总体毒性情况并用毒性当量TEQs来表示。即使用该方法可以得到样品的总毒性当量。目前的问题在于，未来可以通过优化环境样品的前处理方法，提高样品的纯度，进一步提高CALUX系统的特异性。
[0007]根据二恶英类物质生物检测的现状并结合我国检测设备和水平较落后的具体情况，仍需开发成本低廉、灵敏度高以及克服现有系统缺陷的生物报告检测方法。
【发明内容】
[0008]本发明的发明人经过大量实验，提供了改进的二恶英类化合物生物报告检测载体和细胞，由此完成了本发明。
[0009]本发明第一方面涉及重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于CYPlAl启动子的CYPlAl启动子基本区段和二恶英反应元件(DRE)富集区段，以及报告基因，所述CYPlAl启动子基本区段和二恶英反应元件(DRE)富集区段调节该报告基因的转录。[0010]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的CYPlAl启动子为哺乳动物CYPlAl启动子，例如为小鼠、豚鼠或人的CYPlAl启动子。在本发明的实施方案中，所述的CYPlAl启动子为小鼠启动子。
[0011]在本发明中，所述的CYPlAl启动子基本区段和二恶英反应元件(DRE)富集区段都来源于CYPlAl全长启动子。
[0012]在本发明的实施方案中，所述启动子基本区段包括启动子核心启动序列和近端启动序列。
[0013]在本发明的实施方案中，所述的二恶英反应元件(DRE)富集区段包含四个二恶英反应元件。
[0014]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段的序列为SEQ ID NO:8所示的序列；和/或所述二恶英反应元件的富集区段的序列为SEQ IDNO:9所不的序列。
[0015]在本发明中，所述CYPlAl启动子的基本区段和所述二恶英反应元件的富集区段之间的连接方式为本领域所公知，例如可以通过linker或酶切位点连接。在本发明的实施方案中，所述二恶英反应元件的富集区段位于CYPlAl启动子的基本区段的上游方向。
[0016]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段和二恶英反应元件(DRE)的富集区段连接的序列为SEQID N0:10所示的序列。
[0017]根据本发明第 一方面任一项的重组载体，其中所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
[0018]根据本发明第一方面任一项的重组载体，所述载体含有萤火虫荧光素酶基因。
[0019]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其是在pGL系列载体的萤火虫荧光素酶基因的上游可操作地连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
[0020]在本发明的实施方案中，其是在多克隆位点连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
[0021]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的pGL系列载体例如为pGL2、pGL3、pGL4 或pGL6。
[0022]在本发明的实施方案中，所述pGL系列载体为pGL3系列载体。在本发明的实施方案中，所述pGL系列载体为pGL3 — basic载体。
[0023]在本发明的实施方案中，所述重组载体为pCL-CRl。
[0024]本发明第二方面涉及重组细胞，其含有本发明第一方面任一项的重组载体。
[0025]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0026]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，其为重组肝源细胞，例如为重组肝癌细胞(例如!fepal、HePG2、SMMC-7721、BEL-7402, QGY-7701)，例如为重组!fepal 细胞。
[0027]在本发明中，所述肝源细胞是指来源于肝实质的细胞。
[0028]在本发明的实施方案中，所述重组细胞为CBG2.4D，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC N0.8958。
[0029]本发明第三方面涉及本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞用于二恶英类化合物生物检测的用途。[0030]本发明第四方面涉及一种二恶英类化合物生物检测方法，所述方法使用本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞的步骤。
[0031]根据本发明第三方面任一项的用途或者第四方面任一项的方法，其中所述的二恶英类化合物选自多氯二苯并二恶英(P⑶Ds)(例如2，3，7,8-四氯二苯并二恶英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯联苯(PCBs)、卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合卤代化合物。
[0032]保藏信息
[0033]细胞株CBG2.4D，分类命名小鼠肝癌细胞，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编 100101)，保藏编号 CGMCC N0.8958。
[0034]细胞株CBG1.FL，分类命名小鼠肝癌细胞，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编 100101)，保藏编号 CGMCC N0.8956。
[0035]发明的有益效果
[0036]本发明采用CYPlAl的基础启动子与DRE富集区段连接作为荧光素酶报告基因的启动子，构建了二恶英类物质生物检测的重组载体，由于该启动子未添加任何外源基因，更有利于二恶英类物质与二恶英反应元件的特异性结合，以尽可能模拟二恶英类物质暴露的真实情况；
[0037]同时，该组合启动子的长度较短，且含有的DRE个数少于CYPlAl全长启动子，但仍具有较好的灵敏度，因此在保证检测灵敏度的同时可以降低非特异性序列与二恶英类物质的结合，从另一方面也提高了检测特异性；
[0038]并且，在相同处理及仪器检测条件下，荧光检测强度(RLU)较目前常用的生物检测载体提高了一个数量级，这样可以降低对酶标仪检测参数的要求，进而降低检测成本，为实现检测方法的大范围推广提供了更加有利的条件；
[0039]通过将DRE富集区段与CYPlAl启动子基础区段近距离连接得到的重组载体，与基于原始CYPlAl启动子的重组载体相比。其具有更好的响应效果；
[0040]本发明还构建了基于该生物报告基因检测载体的稳定细胞株，并筛选到具有较高灵敏度的细胞株，为二恶英类物质的生物报告基因检测奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1pCL-FL及pCL-CRl的构建示意图；
[0042]图2为pCL-CRl、pCL-FL和pGL6.1对T⑶D的反应，其中左侧纵坐标为荧光强度，其单位为RLU，即相对发光值，右侧纵坐标为荧光素酶水平相对于溶剂对照的倍数；
[0043]图3为pCL-CRl瞬转Ifepal后对梯度浓度的T⑶D的反应，纵坐标为荧光素酶水平相对于溶剂对照的倍数。
[0044]图4为pCL-FL瞬转Ifepal后对梯度浓度的T⑶D的反应，纵坐标为荧光素酶水平相对于溶剂对照的倍数。
[0045]图5CBG2.4D与CBG1.FL对T⑶D的反应，其中左侧纵坐标为荧光强度，单位为RLU，右侧纵坐标为荧光素酶水平相对于溶剂对照的倍数；[0046]图6CBG2.4D对T⑶D的MDL，其中纵坐标为荧光强度，单位为RLU，其中*表示与溶剂对照组相比有显著差异。
【具体实施方式】
[0047]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0048]本发明中使用的缩写，具有以下含义:AhR，芳基烃受体；ARNT，芳基烃受体核转蛋白；TCDD，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英；TCDF，2，3，7，8-四氯二苯并呋喃；PeCDF，2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃；DRE，二恶英反应元件；POTDS，多氯代二苯并-对-二恶英；P⑶Fs,，多氯代二苯并呋喃；PCBs，多氯联苯；DLCs，二恶英类化合物。
[0049]其中Hepal 细胞也叫 Hepalclc7 细胞，Michael S.Denison 赠，参见 Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.Μ.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P., andDenison, M.S.(1996).Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for thedetection of 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals.Fund.Appl.Toxicol.30, 194 - 203.[0050]pGL6.1,也叫 pGudLuc6.1,Michael S.Deni son 赠，参见 Han, D._H.，Nagy, S.R.，andDenison, M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0051]Hepa6.1,也叫 H1L6.1c2,Michael S.Denison 赠，参见 Han, D._H., Nagy, S.R., andDenison, M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0052]pGL3_basic 购自 Promega。
[0053]实施例1
[0054]1.pCL-FL质粒的构建
[0055]小鼠基因组DNA来自于肝癌细胞Ifepal细胞，按照试剂盒标准方法抽提。并通过标准的分子克隆手段构建获得PCL-FL (图1)。
[0056]本实验的目的是构建获得包括小鼠CYPlAl启动子(-1400~+3)原始序列的二恶英报告基因检测质粒，该序列包含6个DRE序列。以小鼠基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR反应。
[0057]5’ 引物为:5’ -CACGCTCGAGAACAGGTTGAGTTAGAC-3，(SEQID NO:1)
[0058]3，引物为:5，-CACGAAGCTTCAGGGTTAGGGTGAAG-3，(SEQID NO:2)
[0059]获得PCR片段后，以Xho I和Hind III双酶切，并对载体质粒pGL3_basic进行同样的双酶切，最后将该片段构建入pGL3-basic中。最后经酶切测序鉴定后，获得pCL-FL质粒。
[0060]其中启动子的序列为:
[0061 ] AACAGGTTGAGTTAGACACGCCAAGTTCAGATGTTCTTCTTACACTAATCTCACTCTGGGAGCACCCTTCAGGGCCAGAGAGCACCTGCAAAACAGCCAGCTAGGCGTGCCGGGTGGTGCTGCGTGTCCTGCCACTAAAAATGTGGACACACGCTGTTCAGGCCTTTGCTCTCAGGCAGAAGCCGAGCATCGCACGCAAACCCGGCCCTTTGCACCGCTGGCG
【权利要求】
1.重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于CYPlAl启动子的CYPlAl启动子基本区段和二恶英反应元件(DRE)富集区段，以及报告基因，所述CYPlAl启动子基本区段和二恶英反应元件(DRE)富集区段调节该报告基因的转录。
2.权利要求1的重组载体，其中所述的CYPlAl启动子为哺乳动物CYPlAl启动子，例如为小鼠CYPlAl启动子。
3.权利要求1的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段的序列为SEQID NO:8所示的序列；和/或所述二恶英反应元件的富集区段的序列为SEQ ID NO:9所示的序列。
4.权利要求1的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段和二恶英反应元件(DRE)的富集区段的序列为SEQ ID N0:10所示的序列。
5.权利要求1的重组载体，其中所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
6.权利要求1-5任一项的重组载体,其是在pGL系列载体的萤火虫突光素酶基因的上游可操作地连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
7.权利要求6的重组载体，其中所述的pGL系列载体为pGL2、pGL3、pGL4或pGL6，优选地，所述重组载体为pCL-CRl。
8.重组细胞，其含有权利要求1-7任一项的重组载体。
9.权利要求8的重组细胞,其为重组肝源细胞,例如为重组肝癌细胞，例如为重组Hepal细胞。
10.权利要求8或9的重组细胞，其为重组细胞CBG2.4D，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC N0.8958。
11.权利要求1-7任一项的重组载体或权利要求8— 10任一项的重组细胞用于二恶英类化合物生物检测的用途。
12.—种二恶英类化合物生物检测方法，所述方法使用权利要求1-7任一项的重组载体或权利要求8 — 10任一项的重组细胞的步骤。
13.权利要求11的用途或者权利要求12的方法，其中所述的二恶英类化合物选自多氯二苯并二恶英(P⑶Ds)(例如2，3，7，8-四氯二苯并二恶英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯联苯(PCBs)、卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合卤代化合物。
【文档编号】C12N15/85GK103834688SQ201410099506
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】赵斌, 李帅章, 谢群慧, 裴新辉 申请人:中国科学院生态环境研究中心