一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物载体领域，特别涉及一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用。构建方法，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化至该菌株，获得BL21(DE3)ΔaroA菌株。本发明提供的一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，采用大于500bp的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因；该菌株既可用于EPSPS功能互补验证，还实现了pET系统重组外源蛋白的大量表达，达到一举两得的效果。
【专利说明】-种BL21 (DE3) Aar〇A菌株的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物载体领域，具体而言，涉及一种BL21(DE3) AaroA菌株的构建方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] aroA基因，因其编码产物是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyru vylshikimate3_phosphate synthase, EPSPS)又被称为 EPSPS 基因 。EPSPS 是只存在于 细菌、真菌、藻类、顶配位寄生虫和植物中（Herrmann and Weaver, 1999 ;Macheroux and Schmidv，1999 Reeling et al.，1999)的莽草酸途径的关键酶，其功能是是催化PEP和莽 草酸-3-磷酸（shikimate3_phosphate，S3P)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（5_e nolpyruvylshikimate3_phosphate，EPSP)。莽草酸途径（shikimate pathway)是连接碳水 化合物代谢和芳香族化合物生物合成的重要生物代谢途径，该途径起始于糖酵解中间产物 磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)和五碳糖磷酸途径中间产物赤藓糖-4-磷 酸（erythrose4_phosphate)，到合成分支酸（chorismate)结束，整个过程有7种酶参与， EPSPS是倒数第二步的酶（Herrmann and Weaver, 1999)。EPSPS还是世界上使用量最大的 广谱灭生性除草剂草甘膦（glyphosate)的唯一靶标酶，EPSPS和PEP的结合因草甘膦在结 构上是PEP的类似物而被它竞争性的抑制，从而阻断EPSP的合成，造成分支酸合成受阻，最 终导致芳香族氨基酸和芳香族化合物的生物合成代谢失调，最终造成生物体的死亡（Gruys et al. , 1992 ；Mcdowell et al. , 2004)〇
[0003] 菌株aroA内源基因的缺失，将造成菌株自身芳香族氨基酸合成受阻，在没有外源 芳香族氨基酸添加的基本培养基（如M9、M63等基本培养基）中将不能正常生长，只有将 aroA内源基因缺失的菌株转化进完整的能够提供充足的具有活性的EPSPS的aroA基因，该 菌株才能够在基本培养基中生长，因此，aroA基因缺失的菌株可用于EPSPS功能的互补验 证（Zhou et al·，2006)。
[0004] Red同源重组技术是利用噬菌体Red系统介导实现外源线性DNA核苷酸片段与细 菌染色体上的目标基因进行同源重组的研究方法，外源线性DNA的两端只需含有与染色体 目标基因两侧同源的约50bp的序列，便可实现将目标基因同源敲除的目的。该技术在大肠 杆菌K12菌株成功应用的实例很多，但用于K12菌株以外的其他大肠杆菌菌株却鲜有报道。 BL21 (DE3)菌株是大肠杆菌B菌株，用几十bp的短的同源序列很难实现在该菌株内的靶基 因的同源替换，因此，Red同源重组技术应用于BL21 (DE3)菌株存在很大的挑战。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种BL21 (DE3) Λ aroA菌株的构建方法及其应用，以解决 上述的问题。
[0006] 在本发明的实施例中提供了一种BL21(DE3) AaroA菌株的构建方法，包括以下步 骤：
[0007] 构建aroA基因敲除打靶片段；
[0008] 将 pKD46 质粒转入 BL21 (DE3)菌株，获得 BL21 (DE3) /pKD46 菌株；
[0009] 将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21 (DE3) /pKD46菌株，获得所述BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
[0010] 优选地，所述aroA基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因 片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的长度均大于500bp。
[0011] 优选地，所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段。
[0012] 优选地，所述aroA基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤：
[0013] 以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan 抗性基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引 物为：
[0014] P1 :5' -GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[0015] P2 :5, -ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3,；
[0016] 以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoR I和 Κρη I酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述 PJA1402质粒，其中，P3和P4引物为：
[0017] P3 :5 ' -CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3 '
[0018] P4 :5, -CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3,；
[0019] 以BL21 (DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有Sal I和 Hindlll酶切位点的aroA基因下游序列ar〇A-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得 PJA1403质粒，其中，P3和P4引物为：
[0020] P5 :5, -CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3'
[0021] P6 :5, -GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3,；
[0022] 用EcoR I和Κρη I分别双酶切pJA1402和pJA1401质粒，将获得的两端含有 EcoR I和Κρη I粘性末端的ar〇A-U基因片段连入线性化的pJA1401质粒，得到含有 ar〇A-U基因片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的pJA1404质粒；
[0023] 用Sal I和Hindlll分别双酶切pJA1403和pJA1404质粒，将获得两端含有Sal I和Hindlll粘性末端的ar 〇A-D基因片段连入线性化的PJA1404质粒，构建获得含有依次 连接的ar〇A-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和ar〇A-D基因片段的pJA1405质粒；
[0024] 以P3和P6作为引物，PJA1405质粒为模板，PCR扩增即可获得aroA基因敲除打靶 片段。
[0025] 本发明还提供了上述BL21(DE3) Λ aroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接 的ar〇A-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和ar 〇A-D基因片段的pJA1405质粒。
[0026] 本发明还提供了上述BL21(DE3) Λ aroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接 的aroA-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
[0027] 本发明还提供了上述BL21(DE3)八&1*(^菌株的构建方法中得到的口从1405质粒的 菌株。
[0028] 本发明还提供了上述BL21 (DE3) Λ aroA菌株的构建方法中得到的BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
[0029] 本发明还提供了 BUT(BL21 (DE3) AaroA)菌株，将pCP20质粒转化入BL21 (DE3) Δ aroA 菌株，得到 BUT(BL21 (DE3) Δ aroA)菌株。
[0030] 本发明还提供了 BL21 (DE3) AaroA菌株在功能互补中的应用。
[0031] 本发明的实施例提供的一种BL21(DE3) AaroA菌株的构建方法，采用大于500bp 的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因，为该 技术在BL21(DE3)菌株基因组成功敲除目标基因提供了可行的方法。aroA基因缺失的 BL21 (DE3)菌株，既可以用于EPSPS的功能互补验证，同时还实现了 pET系统重组外源蛋白 的大量表达，达到一举两得的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1示出了本发明实施例1中PJA1405质粒的构建流程示意图；
[0033] 图2示出了本发明实施例1中aroA-U、aroA-D和含有Kan抗性的FRT基因片段 PCR扩增后的琼脂糖电泳结果图；
[0034] 图 3 示出了 本发明实施例 1 中质粒 pJA1401、pJA1402、pJA1403、pJA1404 和 PJA1405限制性内切酶双酶切鉴定电泳结果图；
[0035] 图4示出了本发明实施例2中BL21(DE3) AaroA菌株的PCR鉴定电泳结果图；
[0036] 图5示出了本发明实施例3中BLA_(BL21 (DE3) Λ aroA)菌株的PCR鉴定电泳结果 图；
[0037] 图6示出了本发明实施例4中BL21 (DE3)菌株和BL21 (DE3) Λ aroA菌株在LB培 养基中的生长曲线图；
[0038] 图7示出了本发明实施例4中BL21 (DE3)菌株和BL21 (DE3) Λ aroA菌株在M9基 本培养基中的生长曲线图；
[0039] 图8示出了本发明实施例4中BL21 (DE3) Λ aroA菌株在M9基本培养基和加入芳 香族氨基酸的M9基本培养基中的生长曲线图；
[0040] 图9示出了本发明实施例5中菌株BL21 (DE3) Λ aroA和BL21 (DE3) Λ aroA/ pJA 1406在M9基本培养基中的生长曲线图。
【具体实施方式】
[0041] 下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0042] 本发明涉及的实验材料和培养基的配制方法
[0043] 1、菌株与质粒、引物
[0044] 用于本发明的细菌菌株和质粒见表1 ;用于本发明的引物见表2。
[0045] 表1本发明的细菌菌株和质粒
[0046]
【权利要求】
1. 一种BL21(DE3) AaroA菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 构建aroA基因敲除打靶片段； 将pKD46质粒转入BL21 (DE3)菌株，获得BL21 (DE3) /pKD46菌株； 将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21 (DE3) /pKD46菌株，获得所述BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
2. 根据权利要求1所述的BL21 (DE3) AaroA菌株的构建方法，其特征在于，所述aroA 基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所 述ar〇A-U基因片段和ar 〇A-D基因片段的长度均大于500bp。
3. 根据权利要求2所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的构建方法，其特征在于，所述FRT基 因片段含有Kan抗性基因片段。
4. 根据权利要求3所述的BL21 (DE3) Δ aroA菌株的构建方法，其特征在于，所述aroA 基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤： 以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan抗性 基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引物为： P1 :5' -GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' P2 :5' -ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3' ； 以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoR I和 Κρη I酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述 PJA1402质粒，其中，P3和P4引物为： P3 :5' -CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3' P4 :5' -CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3' ； 以BL21(DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有Sal I和 Hindlll酶切位点的aroA基因下游序列ar〇A-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得 PJA1403质粒，其中，P5和P6引物为： P5 :5' -CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3' P6 :5' -GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3' ； 用EcoR I和Κρη I分别双酶切pJA1402和pJA1401质粒，将获得的两端含有EcoR I 和Κρη I粘性末端的ar〇A-U基因片段连入线性化的pJA1401质粒，得到含有ar〇A-U基因 片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的PJA1404质粒； 用Sal I和Hindlll分别双酶切pJA1403和pJA1404质粒，将获得两端含有Sal I和 Hindlll粘性末端的ar〇A-D基因片段连入线性化的PJA1404质粒，构建获得含有依次连接 的ar 〇A-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和ar〇A-D基因片段的pJA1405质粒； 以P3和P6作为引物，PJA1405质粒为模板，PCR扩增即可获得aroA基因敲除打靶片 段。
5. -种权利要求4所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的 aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒。
6. -种权利要求4所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的 aroA-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
7. 含有权利要求4所述的BL21(DE3)八&1*(^菌株的构建方法中得到的？从1405质粒的 菌株。
8. 权利要求4所述的BL21 (DE3) Λ aroA菌株的构建方法得到的BL21 (DE3) Λ aroA菌 株。 9. BUT(BL21 (DE3) AaroA)菌株，其特征在于，将pCP20质粒转化入权利要求8所述的 BL21 (DE3) Λ aroA 菌株，得到 BLA_(BL21 (DE3) Λ aroA)菌株。 10. BL21 (DE3) AaroA菌株在功能互补中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104099363SQ201410346343
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】巩元勇, 倪万潮, 郭书巧, 束红梅, 沙琴 申请人:江苏省农业科学院