一种dna组装和克隆的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种简便的DNA组装和克隆方法。本发明所述DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA；其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。本发明所述DNA组装和克隆的方法反应体系简单、成本低，操作简便、易于平行操作，对复杂基因片段库、组合基因片段库、多基因通路的DNA组装和克隆具有明显的优势，可广泛应用于单一基因、多基因以及基因片段库的DNA组装和克隆，特别适用于高通量基因合成与组装。
【专利说明】-种DNA组装和克隆的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及基因合成的方法，尤其是涉及一种简便的DNA 组装和克隆方法。
【背景技术】
[0002] DNA组装和克隆是分子生物学研究中最基本、最常用的技术手段。基因组学、合成 生物学的快速发展对DNA组装和克隆技术提出了越来越高的要求。根据插入片段和载体上 是否需要具有特异性位点或序列，可W将目前的DNA组装和克隆方法分为两大类，即序列 依赖型和非序列依赖型。
[0003] 序列依赖型克隆是基于限制性酶切-连接或位点特异性重组的方法。限制性酶 切-连接是常用的经典克隆方法，即插入片段和载体都通过相应的限制性内切酶切割，产 生两个单链粘性末端或平齐末端，然后在DNA连接酶的作用下重新形成磯酸二醋键而得到 环化的重组质粒。限制性内切酶和连接酶的商品化和普及使构建单一基因与目标载体的 重组质粒变得简单，但是操作步骤较繁琐、耗时。受基因序列中原有酶切位点的限制，当插 入多条基因时，不易找到可利用的酶切位点，同时还可能受到因载体自连而造成的假阳性 克隆的干扰。而基于位点特异性重组的克隆方法则无需限制性内切酶、DNA连接酶W及许 多针对于亚克隆的体外操作，较之更为快速和简便，如通用载体质粒融合系统（univector plasmid-fusion system, UP巧和通路克隆系统（gateway cloning system)等。UPS 是建 立在瞻菌体PI的化e-loxp位点特异性重组之上的质粒融合系统，催化含有目的基因的特 殊载体（pUNI)与含有相关调控信息的宿主载体（P册ST)之间质粒融合，融合质粒经过选择 后，使目的基因受控于宿主载体上的新启动子等调控元件而完成目的基因-表达载体的构 建。gateway系统是基于A瞻菌体位点特异重组系统，可将DNA插入片段从一个表达载体 快速简便地转移到另一个表达载体，同时保证方向和阅读框的正确。受到DNA特异性位点 的限制，该两种克隆方法对于较复杂或是多片段组装的DNA合成与克隆依然表现出很大的 局限性。
[0004] 非序列依赖型克隆方法主要是基于同源重组的原理，如LIC、MAGIC、SLIC、Gibson、 In-Fusion、PI阳等等，但该些克隆方法严格意义上的完全不依赖于DNA序列，还是需要在 插入片段和目标载体的交叠区域缺失或多出一些碱基，形成相互匹配的粘性末端，该样不 仅增加了克隆的步骤，而且还要应用昂贵的组合酶体系，所W在时间和经济成本上并未表 现出明显的优势。同时，该些方法的退火步骤通常都是在室温下进行的，使非特异性杂交的 几率增加，进而造成DNA的错误组装。
[0005] 每种克隆方法各有优缺点和最适用的领域，但对于复杂基因片段库、基因线路图、 代谢途径等的合成，则需要更为精确、高效、简便、经济的DNA组装和克隆方法。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便的DNA组装和克隆的方法，该方法中 载体与插入片段互为引物和模板，通过聚合酶进行延伸反应连接，形成双链环状DM,直接 用于转化，较现有方法更为高效、简便、经济。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案
[0008] -种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶 链式反应，获得双链环状DNA ;其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序 列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。
[0009] 在一些实施方案中，所述线性载体与插入片段在反应体系中的摩尔比为 (0. 1:1)?（10:1)。
[0010] 在一些实施方案中，所述线性载体的终浓度为0. Ing/y 1?20ng/y 1。
[0011] 在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为IObp?40bp。
[0012] 在一些实施方案中，所述重叠序列的Tm值差异范围在SC W内。
[0013] 进一步的，在一些优选实施方案中，所述重叠序列的Tm值范围为5(TC?7(TC。
[0014] 在一些实施方案中，所述反应的循环数为1个?40个。
[0015] 进一步的，在一些优选实施方案中，其中所述反应的循环数为1个?10个。
[0016] 进一步的，在一些优选实施方案中，其中所述反应的循环数为5个?40个。
[0017] 更进一步的，在一些优选实施方案中，所述反应的退火为W 0. 1-0. 5C /s的速率 缓慢降温退火。
[0018] 本发明所述DNA组装和克隆的方法，至少具有W下有益效果中的一种：
[0019] 第一，需要较少的循环，最少只需1个循环即可获得全长DNA，并且可一次性组装 长达20化的DNA片段；
[0020] 第二，无需外加引物引发反应，反应过程中对插入片段和载体片段不进行数量扩 增，只有链延长；
[0021] 第H，反应得到的产物为环状重组质粒，可W直接转化至受体细胞，完成克隆，无 需再经过酶切连接等后续处理步骤。
[0022] 第四，反应过程仅基于DNA聚合酶延伸反应原理，不涉及复杂的重组过程，反应时 间短、突变几率低，反应效率和保真度高；
[0023] 第五，反应体系简单、成本低，操作简便、易于平行操作，对复杂基因片段库、组合 基因片段库、多基因通路的DM组装和克隆具有明显的优势，可广泛应用于单一基因、多基 因W及基因片段库的DNA组装和克隆，特别适用于高通量基因合成与组装。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[00巧]图1示基因组装和克隆方法流程示意图，其中，图A为单一基因，图B为多基因片 段，图C为多基因片段库，图D基因组装和克隆方法反应原理示意图；
[002引图2示单一基因组装产物鉴定结果，图A为DNA组装反应产物电泳图，其中，M为 肥B化b DNA标准品，泳道1和2分别为PCR循环数为1或5的产物；图B为对所得阳性克 隆进行菌落PCR鉴定的结果，其中，M为肥B化b DNA标准品，泳道1?8和9?16分别为 PCR反应循环数为1和5的产物；
[0027] 图3示多基因片段组装产物鉴定结果，图A为DNA组装反应产物电泳图，其中，M 为肥B化b DNA标准品，泳道1-3分别为PCR循环数为2、5或10的产物；图B为DNA组装 反应产物电泳图，M为肥B化b DNA标准品，泳道1为PCR循环数为20的产物；
[0028] 图4示多基因片段库组装产物鉴定结果，图A为方法a的组装反应产物电泳图，其 中，M为肥B化b DNA标准品，泳道1-3分别为PCR循环数为2、10和20的产物；图B为方 法b的组装反应产物电泳图，其中，M为肥B化bDNA标准品，泳道1为PCR循环数为25的 产物。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0030] 术语与定义
[0031] 术语"基因"是指携带有遗传信息的DNA序列。
[0032] 术语"基因片段库"是指通过某种建库方法得到的多个基因片段的集合。
[0033] 术语"组合基因片段库"是指通过不同建库方法得到的不同基因片段库的组合。
[0034] 术语"插入片段"是欲与载体连接的DNA片段，可W是一个或多个基因、一个或多 个基因片段库。可W是天然产物或人工合成所得，首尾序列明确。
[00巧]术语"载体"是指基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体 细胞的一种能自我复制的DNA分子。
[0036] 术语"聚合酶链式反应"是指体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA在 体外高温时会变性为单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着5' -3'的方向合成互补链。
[0037] 本发明提供了一种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模 板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA ;其中插入片段两端分别带有与线性载体两端 重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。
[0038] 本发明所述DNA组装和克隆的方法中插入片段序列5'末端带有与线性载体序列 3'端重叠的重复序列，插入片段序列3'末端带有与线性载体序列5'端重叠的重复序列； 而线性载体序列5'末端带有与插入片段序列3'端重叠的重复序列，线性载体序列3'末端 带有与插入片段序列5'端重叠的重复序列。插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠 的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。插入片段与线性载 体互为模板和引物在聚合酶的作用下进行聚合酶链式反应，一步反应形成环状质粒，产物 直接转化至受体细胞，操作简便，高效、经济。具体反应原理如图ID所示。
[0039] 本领域技术人员可W理解，本发明所述DNA组装和克隆的方法，所述的插入片段 可W是一个或多个基因、一个或多个基因片段库。其中，所述的多个基因可W为相同序列或 不同序列。所述多个基因片段库可W为相同内容的基因片段库或不同内容的基因片段库。
[0040] 本发明所述DNA组装和克隆的方法，所述的插入片段可W是天然产物，也可W经 人工合成所得，序列的首尾序列明确。
[0041] 本领域技术人员可W理解，本发明所述DM组装和克隆的方法中所述的线性载体 可W通过本领域技术人员公知的技术获得，如环状载体酶切、环状载体PCR扩增、化学合成 等。
[0042] 在一些实施方案中，本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述线性载体与插入片 段在反应体系中的摩尔比为（0.1:1)?（10:1)。在一些优选实施方案中，所述插入片段与 线性载体的摩尔比为1:1?1:2。如所述插入片段与线性载体的摩尔比为1. 5:1。
[0043] 在一些实施方案中，本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述线性载体的终浓度 为0. Ing/y 1?20ng/y 1。在一些优选实施方案中，线性载体的终浓度为在4ng/y 1? 15ng/]i 1。女口 4ng/]i l、5ng/]i l、6ng/]i l、7ng/]i l、8ng/]i l、9ng/]i l、10ng/]i l、llng/]i 1、 12ng/]i l、13ng/]i l、14ng/]i l、15ng/]i Id
[0044] 在一些实施方案中，本发明所述DM组装和克隆的方法中所述重叠序列的长度为 IObp ?40bp。
[0045] 在一些优选实施方案中，所述重叠序列的长度为15bp?30bp。
[0046] 在一些优选实施方案中，所述重叠序列的长度为IObp?15bp。如lObpUAp、 12bp、13bp、14bp 或 15bp。
[0047] 本发明所述DM组装和克隆的方法所述的重叠序列具有相近的Tm值。在一些实 施方案中，所述重叠序列的Tm值差异范围在SC W内。
[0048] 进一步的，在一些优选实施方案中，所述重叠序列的Tm值范围为5(TC?7(TC。更 一步的，在一些优选实施方案中，所述重叠序列的Tm值范围为6(TC?7(TC。
[0049] 本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述聚合酶链式反应的反应体系、反应条件 与常规PCR相同。
[0050] 在一些优选实施方案中，本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述聚合酶链式反 应的反应体系组成为插入片段与线性载体按摩尔比1:1?1:2比例的混合物、0. SmM dNTP 混合物，IXPCR反应缓冲液，适量的高保真DNA聚合酶。本领域技术人员可W理解，所述高 保真DNA聚合酶可W为肥B公司的化USion超保真DNA聚合酶、肥B公司的Q5超保真聚合 酶等。
[0051] 在一些实施方案中，本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述聚合酶链式反应的 循环数为1个?40个。
[0052] 本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述聚合酶链式反应的循环数因插入片段 的复杂程度不同而有所差异。
[0053] 在一些实施方案中，所述插入片段为单一基因或简单基因片段库时，所述反应的 循环数为1个?10个。如，1个、5个、10个。
[0054] 在一些优选实施方案中，所述反应的循环数为1个?5个。如1个、2个、3个、4 个、5个。
[0055] 在一些实施方案中，所述插入片段为多个基因、复杂基因片段库或组合基因片段 库时，所述反应的循环数为5个?40个。如，2个、10个、20个、25个。其中，所述多个基因 是指至少2个基因，具体个数由基因大小决定，可W组装至20化。
[0056] 在一些优选实施方案中，所述反应的循环数为15个?30个。如15个、16个、17 个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个。
[0057] 更进一步的，在一些实施方案中，所述插入片段为多个基因、复杂基因片段库或组 合基因片段库时，所述反应的退火为W 0. 1-0. 5C /s的速率缓慢降温退火。在一些优选实 施方案中，所述反应的退火为W 0. TC /s的速率缓慢降温退火。
[0058] 本发明所述DNA组装和克隆的方法中所述聚合酶链式反应的延伸时间取决于反 应中插入片段或载体的长度和所用聚合酶的延伸效率。
[0059] 按照本发明所述DNA组装和克隆的方法得到的组装或克隆产物为双链环状DNA。
[0060] 其中，所述双链环状DNA可W按照本领域技术人员公知的方法获得。在一些实施 方案中，所述双链环状DNA为反应产物电泳检测，凝胶纯化回收得到。所述电泳检测及凝胶 回收的详细操作步骤参见《分子克隆实验指南第H版》
[0061] 本发明所述DNA组装和克隆的方法得到双链环状DNA，可直接转化至感受态细胞 中进行抗生素筛选。
[0062] 在一些优选实施方案中，所述感受态细胞为转化效率高于108c化/ Ug DNA的感受 态细胞。
[006引本发明所述DNA组装和克隆的方法得到的环状质粒，每条DNA链上会有一个缺口， 转化到受体细胞，缺口会在胞内完成修复，形成闭合环状重组质粒。
[0064] 本发明所述DNA组装和克隆的方法，至少具有W下有益效果中的一种：
[006引第一，需要较少的循环，最少只需1个循环即可获得全长DNA，并且可一次性组装 长达20化的DNA片段；
[0066] 第二，无需外加引物引发反应，反应过程中对插入片段和载体片段不进行数量扩 增，只有链延长；
[0067] 第H，反应得到的产物为环状重组质粒，可W直接转化至受体细胞，完成克隆，无 需再经过酶切连接等后续处理步骤。
[0068] 第四，反应过程仅基于DNA聚合酶延伸反应原理，不涉及复杂的重组过程，反应时 间短、突变几率低，反应效率和保真度高；
[0069] 第五，反应体系简单、成本低，操作简便、易于平行操作，对复杂基因片段库、组合 基因片段库、多基因通路的DM组装和克隆具有明显的优势，可广泛应用于单一基因、多基 因W及基因片段库的DNA组装和克隆，特别适用于高通量基因合成与组装。
[0070] 综上所述，本发明所述DNA组装和克隆的方法更适用于高通量平行组装和组合库 的构建，能够实现不依赖序列、无需连接酶的无痕组装，是一种简便、高效、低成本的DNA组 装和克隆方法，对于复杂基因的重组具有更为明显的优势，能够在一定程度上推动基因组 学W及合成生物学的发展。
[0071] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中实施例中 涉及的插入片段、载体W及相应的扩增引物详见表1、2。如无特殊说明，具体操作参见《分 子克隆实验指南第H版》。
[0072] 表1插入片段及载体的获得
[0073]
【权利要求】
1. 一种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶链 式反应，获得双链环状DNA;其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序列， 线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述线性载体与插入片段在反应体系中的摩尔比 为（0? 1:1)?（10:1)。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述线性载体的终浓度为0. lng/iil?20ng/ U 1〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重叠序列的长度为l〇bp?40bp。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重叠序列的Tm值差异范围在3°C以内。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述重叠序列的Tm值范围为50°C?70°C。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述反应的循环数为1个?40个。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述插入片段为单一基因或简单基因片段库时， 所述反应的循环数为1个?10个。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述插入片段为多个基因、复杂基因片段库或组 合基因片段库时，所述反应的循环数为5个?40个。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述反应的退火为以0. 1-0. 5°C /s的速率缓慢 降温退火。
【文档编号】C12N15/10GK104357438SQ201410489832
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】王璐, 田敬东, 冯淼, 王丽娜 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所