本发明涉及直接从含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶中分离可溶性蛋白的方法。具体地，本发明涉及通过使含有聚集的酪蛋白的材料经历能够特异性结合可溶性蛋白的色谱支持物分离一种或多种可溶性蛋白。
发明背景
牛奶是非常复杂的材料，以及工业过程使用牛奶来产生酪蛋白、乳清、乳糖、炼乳、奶粉和许多其他食品添加剂和工业产品。牛奶包含诸如蛋白质、矿物质、脂肪、糖、盐和维生素的组分的混合物。特别地，牛奶中的主要作为酪蛋白或乳清蛋白被发现的蛋白质在这些年来已经获得越来越多的关注。该增加的关注的原因在于牛奶蛋白的多样性，以及因为各蛋白具有营养的、生物的、功能的和食品成分的应用的独特属性。此外，这些蛋白质与例如牛奶中的肽和酶一起构成人和动物中的主要和重要的健康和营养作用。
为获得蛋白的最大可能潜能以及探索或开发蛋白，例如牛奶中的蛋白的潜在功能及生物活性特性，通过避免可能的变性条件(如高盐条件、高或低pH条件、热或蛋白酶处理/暴露)的程序来分离天然蛋白质是重要的。
牛奶中的主要蛋白组分是酪蛋白。牛奶中的酪蛋白主要通过大分子酪蛋白聚集体形成的胶束酪蛋白被发现。胶束酪蛋白为多孔疏水性结构，它们具有聚集和沉淀的天然趋势，然而，在牛奶中，通过(a)酪蛋白聚集的结构中糖巨肽的存在，以及(b)胶束结构的负电荷阻止该趋势。
可以通过使用凝乳酶对胶束结构进行酶修饰或通过酸沉淀来促进酪蛋白聚集和沉淀。酶修饰导致酪蛋白胶束的特异性水解，由此丢失糖巨肽。当胶束酪蛋白被切割成胶束实体聚集体，以及当足量的胶束酪蛋白被切割时，聚集的酪蛋白沉淀，并且与作为固体级分的乳清蛋白分离。
传统上，牛奶的处理通常由以下组成：酪蛋白的最初提取，如通过聚集的胶束酪蛋白的沉淀，例如通过使用凝乳酶进行的酶修饰或通过酸处理，提供聚集的酪蛋白的沉淀物、凝乳和液体的乳清蛋白溶液。
然而，这种处理面临一些劣势，因为酶修饰或酸处理可引起聚集的酪蛋白和/或部分可溶性蛋白被部分地分解，以及蛋白质可能丧失一些生物学活性。此外，沉淀的酪蛋白可能在聚集体中包埋一些可溶性蛋白，从而降低可溶性蛋白的收率或增加聚集的酪蛋白沉淀物中的杂质。
因此，解决以上提及的问题以及适合于工业应用的用于分级牛奶和提供可溶性蛋白级分的改善的方法将是有利的。具体地，直接由含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶提供高收率和/或纯度的可溶性蛋白级分的更有效的、特异性的和/或可靠的方法将是有利的。
发明概述
因此，本发明的目标是提供将含有聚集的酪蛋白的材料分级成各种组分，如蛋白级分(各种可溶性蛋白级分和/或不溶性蛋白级分)、碳水化合物级分、矿物质级分、脂质级分和/或水级分的改善的方法。所述方法可以是快速的、划算的，并产生具有高纯度、高回收率和/或高收率的高品质级分。
具体地，本发明的目标是提供解决现有技术的以上提及的问题的分级含有聚集的酪蛋白的材料的方法。
因此，本发明的目标涉及从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物接触，允许在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一种或多种可溶性蛋白被所述色谱支持物保留；
(iii)从所述色谱支持物获得包含聚集的酪蛋白的透过物级分；
(iv)任选地洗涤所述色谱支持物；
(v)使所述色谱支持物经历至少一种洗脱缓冲液，从所述色谱支持物获得至少一种可溶性蛋白级分；以及
其中所述色谱支持物包含能够结合来自所述含有聚集的酪蛋白的材料的所述可溶性蛋白的一种或多种混合模式配体。
本发明的另一方面涉及通过根据本发明的方法获得的可溶性蛋白级分。
本发明的另一方面提供包含两种或更多种可溶性蛋白的可溶性蛋白级分，其中所述两种或更多种可溶性蛋白的蛋白概况基本上类似于含有聚集的酪蛋白的材料中所述可溶性蛋白的蛋白概况。
在本发明的上下文中，术语“蛋白概况”涉及在含有聚集的酪蛋白的材料或至少一种可溶性蛋白级分中两种或更多种可溶性蛋白之间的相对浓度比率(以重量/重量计)。
本发明的另一方面涉及包含具有共价连接的一种或多种混合模式配体的多孔有机聚合物基体基质的色谱支持物在从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分中的用途，所述一种或多种混合模式配体包含疏水性部分和非芳族氮部分。
本发明的另外方面涉及本发明的可溶性蛋白级分作为成分，优选地，作为食物产品、饲料产品、饮食产品、药物产品、营养食品产品、治疗产品、饮料产品、护肤品、化妆品、针对营养免疫疗法的产品或针对被动免疫的产品中的成分的用途。
本发明的另一方面是提供这样的可溶性蛋白级分，关于至少免疫球蛋白和α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白，所述可溶性蛋白级分包含的蛋白概况基本上类似于含有聚集的酪蛋白的材料中的蛋白概况。
本发明的另一方面涉及包含一种或多种混合模式配体的色谱支持物在至少结合来自含有聚集的酪蛋白的材料中的可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一种中的用途。
本发明的另外方面涉及本发明的可溶性蛋白级分作为成分，优选地，作为食物产品、饮料产品或化妆品中的成分的用途。
现在将在下述更详细地描述本发明。
附图简述
图1显示使用混合模式配体直接从含有聚集的酪蛋白的材料，如脱脂乳中分离单个可溶性蛋白的本发明方法的效率。色谱支持物可以基本上保留来自脱脂乳的全部可溶性蛋白，以及随后可以从色谱支持物洗脱单独的可溶性蛋白，提供高纯度、高回收率和高收率的单独可溶性蛋白级分。图1示出通过本发明获得的高纯度的β-乳球蛋白级分。虚线示出从色谱支持物直接获得的β-乳球蛋白级分，然而实线显示在另外的微滤步骤之后获得的β-乳球蛋白级分。
现在将在下述更详细地描述本发明。
发明详述
多年以来，分级含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶并提供所述蛋白级分的应用的兴趣已经增大。传统上，现有技术描述例如牛奶的分级，其从酪蛋白的提取开始的，具体地通过沉淀聚集的酪蛋白，以便获得可溶部分与不溶部分的清晰的分离。本发明的发明人惊人地发现工业规模上分级含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶的方法而无需聚集的酪蛋白的最初沉淀，该方法是直接从所述含有聚集的酪蛋白的材料提供高收率和/或纯度的可溶性蛋白级分的有效的、特异性的和/或可靠的方法。
因此，本发明的一个方面涉及从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物接触，允许在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一种或多种可溶性蛋白被所述色谱支持物保留；
(iii)从所述色谱支持物获得包含聚集的酪蛋白的透过物级分；
(iv)任选地洗涤所述色谱支持物；
(v)使所述色谱支持物经历至少一种洗脱缓冲液，从所述色谱支持物获得至少一种可溶性蛋白级分；以及
其中所述色谱支持物包含能够结合来自所述含有聚集的酪蛋白的材料的所述可溶性蛋白的一种或多种混合模式配体。
本发明的另外方面涉及从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物接触，至少允许在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白种的至少一种被所述色谱支持物保留；
(iii)从所述色谱支持物获得包含聚集的酪蛋白的透过物级分；
(iv)任选地洗涤所述色谱支持物；
(v)使所述色谱支持物经历至少一种洗脱缓冲液，从所述色谱支持物获得至少一种可溶性蛋白级分；以及
其中所述色谱支持物包含能够结合来自含有聚集的酪蛋白的材料的可溶性蛋白的一种或多种混合模式配体。
本发明的另外方面涉及从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物接触，允许在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一种或多种可溶性蛋白被所述色谱支持物保留；
(iii)从所述色谱支持物获得包含聚集的酪蛋白的透过物级分；
(iv)任选地洗涤所述色谱支持物；
(v)使所述色谱支持物经历至少一种洗脱缓冲液，从所述色谱支持物获得至少一种可溶性蛋白级分；以及
其中所述色谱支持物包含具有共价连接的一种或多种混合模式配体的多孔有机聚合物基体基质，所述一种或多种混合模式配体包含疏水性部分和非芳族氮部分。
在本发明的上下文中，术语“至少一种可溶性蛋白级分”涉及通过本发明获得的并且包含单独的可溶性蛋白或在相同的可溶性蛋白级分中两种或更多种可溶性蛋白的各种组合的可溶性蛋白级分。在本发明的上下文中，术语“单独的可溶性蛋白”涉及这样的蛋白概况，其已经从与含有聚集的酪蛋白的材料的蛋白概况非常类似的蛋白概况转移到至少一种可溶性蛋白是有利的蛋白概况。
在本发明的上下文中，术语“可溶性蛋白”涉及在含有聚集的酪蛋白的材料中溶解的自由流动的非聚集成分。与可溶性蛋白相反，术语“聚集的”涉及当分散在溶剂，如水中时形成一些非常大的分子如酪蛋白的结构。此类大分子被认为是太大而不能真正地溶于水中。然而，这些大分子形成允许其在水中保持悬浮如同其是可溶的结构。这些大的结构在水中的分散液被称为胶体悬浮液。允许大分子保持胶状地悬浮于水中的结构被称为胶粒。
在本发明的实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一种或多种可溶性蛋白的分子大小可以小于1000千道尔顿(kDa)、如小于750kDa、如小于500kDa、例如小于400kDa、如小于300kDa、例如小于250kDa。
在本发明的上下文中，术语“分离”涉及将物质的混合物，如含有聚集的酪蛋白的材料转化成两种或更多种不同级分的过程，不同级分中的至少一种富含来自混合物的一种或多种物质。
在本发明的实施方案中，分离涉及提供包含获得自含有聚集的酪蛋白的材料的可溶性蛋白的混合物的至少一种可溶性蛋白级分的过程。在本发明的实施方案中，可溶性蛋白的混合物可以为至少2种或更多种可溶性蛋白、如至少3种或更多种可溶性蛋白、例如至少4种或更多种可溶性蛋白、如至少5种或更多种可溶性蛋白、例如至少6种或更多种可溶性蛋白的混合物。
在本发明的另一实施方案中，分离涉及提供包含单独的可溶性蛋白的两种或更多种不同的可溶性蛋白级分、如3种或更多种不同的可溶性蛋白级分、例如4种或更多种不同的可溶性蛋白级分、如5种或更多种不同的可溶性蛋白级分、例如6种或更多种不同的可溶性蛋白级分。
牛奶中的蛋白质可以具有不同的物理化学特性，其可影响分级并且可以被有利地使用以提供一种可溶性蛋白级分与另一可溶性蛋白级分或含有聚集的酪蛋白的材料中的聚集的酪蛋白的选择性分离。
此类使用色谱支持物的一种或多种可溶性蛋白的选择性分离可以在两种条件下操作：
(a)一种或多种可溶性蛋白从色谱支持物的选择性洗脱，或
(b)一种或多种可溶性蛋白与色谱支持物的选择性吸附
在选择性洗脱中，含有聚集的酪蛋白的材料中的所有可溶性蛋白或一组可溶性蛋白被色谱支持物同时捕获。漂洗色谱支持物上的污染物和未捕获的物质。然后，由人们使用专门设计的适合于待分离的特定蛋白质的洗脱缓冲液依序洗脱捕获的可溶性蛋白。因此，通过使用选择性洗脱技术，从同一色谱支持物获得数种纯化的蛋白级分是可能的。
在选择性吸附中，优化工艺条件以越过一种蛋白质捕获另一种可溶性蛋白。当捕获感兴趣的可溶性蛋白时，漂洗色谱支持物的污染物，随后洗脱特异性可溶性蛋白。
在本发明的实施方案中，方法为选择性洗脱过程。用这种方法，提供两种或更多种、如3种或更多种、例如4种或更多种、如5种或更多种、例如6种或更多种包含单独的可溶性蛋白的不同的可溶性蛋白级分是可能的。
在本发明的上下文中，术语“选择性吸附”涉及这样的过程，其中色谱支持物被设计和/或过程条件被设计成有利于来自含有聚集的酪蛋白的材料的一种组分而非来自含有聚集的酪蛋白的材料的另一种组分的结合。
在本发明的上下文中，术语“选择性洗脱”涉及这样的过程，其中洗脱缓冲液被设计和/或过程条件被设计成有利于一种保留的可溶性蛋白在另一种保留的可溶性蛋白之后从色谱支持物洗脱。
在本发明的上下文中，术语“保留”涉及将一种或多种可溶性蛋白保存或保持在特定位置，即在色谱支持物的行为。可溶性蛋白可以被保留在色谱支持物中直至改变条件，以及保留蛋白被从色谱支持物同时或依序释放和洗脱。
在本发明的实施方案中，从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法可以为中等大小规模的生产或大规模生产。
在本发明的实施方案中，从含有聚集的酪蛋白的材料中分离至少一种可溶性蛋白级分的方法可以为分批过程或连续过程。
含有聚集的酪蛋白的材料
根据本发明所述的方法，所述方法的最初步骤涉及提供含有聚集的酪蛋白的材料(步骤(i))。
在本发明的实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料可以获得自任何产乳动物，并且优选传统上用于大规模牛奶生产的动物。优选地，含有聚集的酪蛋白的材料获得自反刍动物，如牛、山羊、绵羊、长颈鹿、牦牛、鹿、骆驼、美洲驼或羚羊。
在本发明的上下文中，术语“含有聚集的酪蛋白的材料”涉及未通过添加凝乳酶、酸、加热或它们的任何组合经受酪蛋白沉淀的材料。优选地，含有聚集的酪蛋白的材料选自牛奶、全脂奶、脱脂乳、牛奶浓缩液、复原乳奶粉、未巴氏灭菌的牛奶、微滤的牛奶、pH-调节的牛奶。[改写]
本发明的方面是在可溶性蛋白的分离之前，含有聚集的酪蛋白的材料未经受酪蛋白沉淀或酪蛋白胶粒和/或酪蛋白聚集体的去除。
在本发明的实施方案中，直接从含有聚集的酪蛋白的材料中分离可溶性蛋白。
在本发明的上下文中，术语“酪蛋白聚集体”涉及不同大小的胶束结构的酪蛋白和聚集的酪蛋白。当形成酪蛋白分子时，随着它们开始折叠成球形胶束结构使得酪蛋白可以在乳水中保持无限悬浮，提供胶束酪蛋白。
在本发明的另一实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料包含至少5g酪蛋白/l含有聚集的酪蛋白的材料、如至少10g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少15g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少20g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少22g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少24g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少30g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少40g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少50g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少60g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少70g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少80g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少90g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少100g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料。
可以以分批过程进行中等大小规模的生产和/或工业规模的生产。优选地，此类分批过程涉及处理至少50升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少100升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如250升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少500升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如750升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少1,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如2,500升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少5,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如7,500升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少10,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如25,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少50,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如75,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、如至少100,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环、例如250,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循环。
可选地，可以以连续过程进行大规模生产(工业规模的生产)。当可溶性蛋白被色谱支持物保留时，在分离过程期间的某个点的洗脱步骤可能是必要的。通过提供至少两个色谱支持物并将其平行放置，可以提供此类连续分离，其中含有聚集的酪蛋白的材料的流动可以从一个色谱支持物(当该色谱材料为负载的并且准备好洗脱时)转移至其他色谱支持物。可选地，可以使用移动床色谱、模拟的移动床色谱等。
在本发明的实施方案中，连续分离的容量可以为至少5,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小时、如至少10,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小时、例如至少12,000升含有聚集的酪蛋白/小时、如至少15,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小时、例如至少18,000升含有聚集的酪蛋白/小时、如至少20,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小时、例如至少25,000升含有聚集的酪蛋白/小时、如至少50,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小时、例如至少100,000升含有聚集的酪蛋白/小时。
在本发明的实施方案中，在将含有聚集的酪蛋白的材料添加至色谱支持物之前，不需要调节含有聚集的酪蛋白的材料的电导率和/或pH。因此，含有聚集的酪蛋白的材料的pH和/或电导率可与最初提供的含有聚集的酪蛋白的材料的pH和/或电导率相同。
在本发明的实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料可以包含矿物质。在本发明的优选实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料未经历矿物质的去除和/或添加。在本发明的优选实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料包含天然存在的矿物质。
优选地，矿物质选自钙、磷、碘、镁、锌和钾。优选地，乳清材料中存在的矿物质为乳清材料中天然存在的。
在本发明的上下文中，术语“天然存在的”涉及这样的矿物质，其存在于含有聚集的酪蛋白的材料中，并且不是单独添加的化合物，但可见于步骤(i)中提供的含有聚集的酪蛋白的材料中。
在本发明的实施方案中，未使含有聚集的酪蛋白的材料经历巴氏灭菌。
色谱支持物
如以上所述，本发明教导色谱支持物的用途，其允许来自含有聚集的酪蛋白的材料的一种或多种可溶性蛋白被保留(步骤(ii))。
在本发明的上下文中，术语“色谱支持物”涉及包含吸附剂的任何种类的容器，其可以被提供有用于含有聚集的酪蛋白的材料的应用的至少一个入口以及当经历洗脱缓冲液时用于获得至少一种可溶性蛋白级分的至少一个出口。
待使用的色谱支持物可以为膜色谱支持物，优选混合模式膜色谱支持物或柱色谱支持物。优选地，柱色谱支持物包括填充床色谱、搅拌罐吸附、移动床色谱、模拟移动床色谱、流化床色谱和/或膨胀床色谱。
膨胀床色谱(EBA)技术通常可以与非澄清的原材料，如含有聚集的酪蛋白的材料一起有效地起作用的事实使其成为实施生物分子物质分离和分开的吸引人的解决方案。与基于填充床色谱的过程相比，膨胀床色谱可以提供包含较少步骤，以及因此导致增加的产率和改善的过程经济性的稳健过程。由于实行EBA过程期间吸附床的膨胀，EBA柱可以被进一步按比例放大至工业规模，而没有关于由于系统堵塞而引起的增加的背压或过程故障(当使用填充床柱时，其常常为一种问题)的任何显著的注意事项。所以，根据本发明，膨胀床色谱可以为优选的柱色谱支持物。
通常，膨胀床吸附为本领域技术人员众所周知的，并且可以将本发明中所述的方法修改成WO 92/00799、WO 92/18237、WO 97/17132、WO 00/57982或WO 98/33572中所述的方法。
在本发明的实施方案中，可以以1-50cm/min范围内；优选地在5-30cm/min范围内；更优选地在10-25cm/min范围内；甚至更优选地，在15-20cm/min范围内的流速将含有聚集的酪蛋白的材料装载至色谱支持物。
吸附剂
在本发明的优选实施方案中，色谱支持物可以包含吸附剂。
在含有聚集的酪蛋白的材料可以与吸附剂接触之前，本发明方法中的最初但任选步骤可以涉及吸附剂的平衡。可以通过使用平衡液来进行此类平衡。平衡液的PH可以依赖于含有聚集的酪蛋白的材料的类型和/或使用的配体而改变。
吸附剂的平衡可以优选地通过使用酸或水，如自来水、纯净水、去离子水、软化水或蒸馏水进行。如果平衡液为酸，则平衡液可以包含低成本的矿物酸，如盐酸、磷酸、硫酸。然而，食品级有机酸，如乙酸、柠檬酸和乳酸也可以是特别优选的。
在本发明的上下文中，术语“吸附剂”涉及色谱支持物中存在的整个床，并且负责保留一种或多种可溶性蛋白。
在本发明的实施方案中，吸附剂可以包含单独的颗粒。在本发明的上下文中，术语“吸附剂颗粒”与术语“颗粒”可交换地使用，并且涉及构成吸附剂的单独的单一颗粒。
在本发明的另一实施方案中，吸附剂可以包含与能够结合一种或多种可溶性蛋白的混合模式配体偶联的膜。
如果颗粒形式的吸附剂被用于膨胀床吸附，则数种特征，如流速、颗粒大小和颗粒密度可以对流化床的膨胀和蛋白的分离具有影响。以使吸附剂颗粒保持在柱内，但同时优化流速的方式控制膨胀度是重要的。
膨胀度可以被确定为H/H0，其中“H0”为填充床模式中床的高度，以及“H”为膨胀模式中床的高度。在本发明的实施方案中，膨胀度H/H0在1.1-10范围内，例如1.0-6、如1.2-5、例如1.3-5、如1.5-4、例如4-6、如3-5、例如3-4、如4-6。
在本发明的另一实施方案中，膨胀度H/H0为至少1.1、如至少1.5、例如至少2、如至少2.5、例如至少3、如至少3.5、例如至少4、如至少4.5、例如至少5、如至少5.5、例如至少6、如至少10。
此外，关于典型的EBA柱内部可能的吸附床的最大膨胀度(例如H/H0max 3-5)，EBA吸附剂颗粒的密度可以对于可应用的流速是高度重要的，并且必须为至少1.3g/ml、更优选地至少1.5g/ml、更优选地至少1.8g/ml、甚至更优选地至少2.0g/ml、最优选地至少2.3g/ml，以便使方法的高生产率成为可能。
EBA吸附剂颗粒的密度意指吸附剂颗粒在其完全溶剂化(例如水合)状态的密度，与干燥的吸附剂颗粒的密度相对。
在本发明的实施方案中，吸附剂颗粒具有至多250μm、如至多200μm、例如至多180μm、特别地如至多160μm、例如至多150μm、如至多140μm、例如至多130μm、如至多120μm、例如至多110μm、如至多100μm的平均颗粒大小。甚至更通常地，吸附剂颗粒具有在90-250μm范围内，例如100-200μm、如120-180μm、例如140-160μm的平均颗粒大小。
应理解，本发明也覆盖小于100μm，如小于90μm、例如小于80μm、如小于70μm、例如小于60μm、如小于50μm、例如小于40μm、如小于30μm、例如小于20μm、如小于10μm的平均颗粒大小。然而，与使用平均颗粒大小为或大于100μm的吸附剂颗粒相比，使用平均颗粒大小小于100μm的吸附剂颗粒可导致较低的生产率。
在很大程度上，可以通过包含某一比例的致密无孔芯材(优选具有至少4.0g/ml、如至少10g/ml、例如至少16g/ml、如至少25g/ml的密度)来实现吸附剂颗粒的高密度。通常，无孔芯材具有在约4.0-25g/ml范围内的密度，如约4.0-20g/ml、例如约4.0-16g/ml、如12-19g/ml、例如14-18g/ml、如约6.0-15.0g/ml、例如约6.0-16g/ml。
根据本发明，使用的吸附剂颗粒对含有聚集的酪蛋白的材料中存在的蛋白可以是至少部分可透过的，以便确保重要的结合能力，这与仅可以在其表面结合靶分子，导致相对低的结合能力的不可渗透的颗粒相反。吸附剂颗粒可以为不同结构、组成和形状的阵列。
吸附剂颗粒可以由许多化学衍生的具有必需密度和结合能力的多孔材料构成以在给定流速下自身操作。颗粒可以为如WO 92/00799中所述的具有被多孔聚合物基体基质包围的至少两个无孔芯的聚集物类型，或具有被多孔聚合物基体基质包围的单个无孔芯的薄膜类型。
吸附剂可以包含具有共价连接的一种或多种混合模式配体的多孔聚合物基体基质。优选地，多孔聚合物基体基质可以为多孔有机聚合物基体基质。在本发明的实施方案中，吸附剂可以包含被多孔聚合物基体基质包围的密致无孔芯材料。
在本发明的上下文中，术语“聚集物类型”涉及微粒材料的颗粒，其包含具有通过多孔聚合物基体基质保持在一起的不同类型和大小的芯材的高密度无孔芯珠，例如由通过周围的琼脂糖(多孔聚合物基体基质)保持在一起的两个或更多个高密度颗粒组成的芯颗粒。
在本发明的上下文中，术语“薄膜类型”涉及颗粒的复合物，其中各个颗粒仅由涂覆有一层多孔聚合物基体基质的一个高密度芯材，例如涂覆有琼脂糖的高密度不锈钢珠组成。
因此，术语“至少一个高密度无孔芯”涉及包含单个高密度无孔颗粒的薄膜芯，或者其涉及包含多于一个高密度无孔颗粒的聚集物芯。
在本发明的上下文中，术语“芯”涉及吸附剂内部存在的芯颗粒。芯颗粒可以附带地分布在多孔聚合物基体基质内且不限于位于吸附剂的中心。
在本发明的实施方案中，无孔芯通常构成吸附剂的总体积的至多50％、如至多40％、例如至多30％、如至多25％、例如至多20％、如至多10％、例如至多5％。
在本发明的另一实施方案中，分子量大于1000道尔顿的蛋白可进入的孔体积构成至少50％的吸附剂、如至少60％的吸附剂、例如至少70％的吸附剂、如至少75％的吸附剂、例如至少80％的吸附剂、如至少90％的吸附剂。
本领域技术人员了解各种无孔芯材和各种多孔聚合物基体基质。无孔芯材和多孔聚合物基体基质的实例可以见于WO 2010/037736。技术人员也了解根据本发明制备吸附剂的方法，此类制备吸附剂的方法可以描述在WO 2010/03776、EP 0 538 350或WO 97/17132中。
在本发明的实施方案中，聚合物基体基质不包含苯乙烯乙烯基三乙氧基硅烷共聚物。
在本发明的另外实施方案中，吸附剂不包含二氧化硅颗粒或氧化铝颗粒。优选地，吸附剂不包含包被有苯乙烯乙烯基三乙氧基硅烷共聚物的二氧化硅颗粒、氧化铝颗粒或陶瓷颗粒。
在操作期间，含有聚集的酪蛋白的材料可以与吸附剂接触，以及一种或多种可溶性蛋白可以被吸附或固定至吸附剂，然而其他组分，如聚集的酪蛋白、矿物质、碳水化合物或它们的组合不结合色谱支持物，并且流过吸附剂。该吸附可以在压力下进行。在任选洗涤期间，从柱中任选去除微粒和/或未结合的材料以及可溶性杂质。
当使含有聚集的酪蛋白的材料与吸附剂接触时，可以优化吸附剂与含有聚集的酪蛋白的材料之间的比率以便提供吸附剂的高容量，以及获得分离的至少一种可溶性蛋白级分的高纯度、高产率和/或高回收率。
在本发明的实施方案中，色谱支持物可以具有以下的可溶性蛋白相对于吸附剂的装载比：至少10mg装载的可溶性蛋白/ml吸附剂、如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少50mg、例如至少75mg、如至少100mg、例如至少150mg、如至少175mg、例如至少200mg。
在本发明的另一实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料相对于吸附剂的装载比为至少50mg装载的聚集的酪蛋白/ml吸附剂，如至少75mg、例如至少100mg、如至少200mg、例如至少300mg、如至少400mg、例如至少500mg、如至少600mg、例如至少700mg、如至少800mg、例如至少900mg、如至少1000mg、例如至少1500mg。
在本发明的上下文中，当测定可溶性蛋白和/或含有聚集的酪蛋白的材料的装载比时，吸附剂处于其完全溶剂化(例如水合)状态。
配体
为了使色谱支持物和/或吸附剂保留来自含有聚集的酪蛋白的材料的一种或多种可溶性蛋白，吸附剂可以包含配体。
在本发明的优选实施方案中，吸附剂可以包含对在含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一种或多种可溶性蛋白具有亲和力的一种或多种配体。
在本发明的上下文中，术语“配体”涉及共价连接吸附剂且具有吸附一种或多种可溶性蛋白的功能的化合物。
配体可以为低分子量化合物，以及在本发明的实施方案中，配体的分子量可以为至多1000道尔顿，如至多750道尔顿，例如至多500道尔顿、如至多250道尔顿、例如至多100道尔顿、例如至多50道尔顿。
在本发明的实施方案中，当存在于碱性介质时，配体为化学稳定的配体和/或吸附剂在碱性介质中是化学稳定的吸附剂。具有化学稳定的配体和/或化学稳定的吸附剂的优势为：可以减少配体部分至一种或多种级分的渗漏；可以避免或减少可能的毒性问题和/或可以保持色谱支持物的高性能。在本发明的优选实施方案中，在暗处，于37℃下，在1M NaOH中孵育3天，色谱支持物保持至少75％的配体浓度、如至少80％、例如至少85％、如至少90％、例如至少95％。
在本发明的实施方案中，配体与色谱支持物通过共价结合，优选地，强的共价结合偶联，提供化学稳定的配体和/或化学稳定的吸附剂。
在本发明的实施方案中，强的共价结合可以通过包含吸附剂与配体之间的一种或多种活化剂提供。此类合适的活化剂的实例包括表氯醇、表溴醇、烯丙基-缩水甘油醚；双环氧化物；卤素取代的脂肪族化合物；醛类；醌类；氯-三嗪类；噁唑酮；和马来酰亚胺。优选的活化剂为环氧化合物，如表氯醇、烯丙基-缩水甘油醚和丁烷二醇二缩水甘油醚。
在本发明的上下文中，术语“混合模式配体”涉及具有多种行为的配体，例如当操作混合模式配体时，色谱行为基于例如蛋白和配体的静电性质和疏水性质的组合。
在本发明的上下文中，术语“多种行为”涉及配体与可溶性蛋白通过多种类型的分子相互作用，如疏水相互作用、离子相互作用、π-π相互作用、范德华相互作用等相互作用的能力。
根据本发明，混合模式配体可以包含至少一个疏水性部分和至少一个芳族氮部分。
在本发明的优选实施方案中，色谱支持物包含具有共价连接的一种或多种混合模式配体的多孔有机聚合物基体基质，所述一种或多种混合模式配体包含疏水性部分和非芳族氮部分。
在本发明的实施方案中，配体还包含至少一个可带电部分。优选地，根据本发明，混合模式配体包含至少一个疏水性部分、至少一个可带电部分和至少一个非芳族氮部分。
在本发明的实施方案中，至少一个可带电部分为pKa值是至多11.0、如至多10.0、例如至多9.0、如至多8.0、例如至多7.0、如至多6.0、例如至多5.0的碱性部分。
在含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶的pH，优选地在pH 6-8范围中的pH值下，至少一个可带电部分可以为完全或部分带正电荷的部分(在pH等于pKa值下，该可带电部分为50％带电的)。
在本发明的实施方案中，可带电部分可以为羧酸或胺，所述胺选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基。
在本发明的实施方案中，疏水性部分可以为烃基部分或任选取代的芳族或杂芳族部分或者烃基-芳族或杂芳族部分的组合。
如果疏水性部分为烃基部分，则烃基部分可以为无支链的烃基部分。在本发明的进一步实施方案中，烃基部分可以包含至少3个碳原子、如至少4个碳原子、例如至少5个碳原子。
在本发明的另一实施方案中，非芳族氮部分中的氮与烃基部分中的碳之间的比率为至少1:3、如至少1:4、例如至少1:5、如至少1:6、例如至少1:7、如至少1:8、例如至少1:9、如至少1:10。
在本发明的上下文中，氮与碳之间的比率可以通过原子数目来限定，例如非芳族氮与碳之间至少1:3的比率意指1个非芳族氮原子相对于至少3个碳原子。
在本发明的实施方案中，可带电部分形成非芳族氮部分的一部分。
在本发明的另一实施方案中，非芳族氮部分可以为至少一个氮原子、至少一个伯氨基、至少一个仲氨基、至少一个叔氨基或至少一个季氨基。
在本发明的实施方案中，配体包含可带电部分或形成非芳族氮基团的一部分的可带电部分。可带电部分可以在任何pH值下是带电的，或者可带电部分可以在任何pH值下是可带电的。在本发明中，在任何pH值下是带电的可带电部分可以为季氨基。在本发明的实施方案中，在任何pH值下是可带电的可带电部分可以为伯氨基、仲氨基或叔氨基。
为了改善容量、纯度和回收率，配体浓度也是重要的。所以，在本发明的优选实施方案中，配体浓度可以在20-300微摩尔/ml沉降的吸附剂范围内，例如25-100微摩尔/ml沉降的吸附剂、如30-80微摩尔/ml沉降的吸附剂、例如40-70微摩尔/ml沉降的吸附剂、例如50-200微摩尔/ml沉降的吸附剂、如75-175微摩尔/ml沉降的吸附剂、例如100-160微摩尔/ml沉降的吸附剂、如120-145微摩尔/沉降的吸附剂。
在本发明的上下文中，术语“沉降的吸附剂”或“吸附剂颗粒”意指在其完全溶剂化(例如水合)状态的吸附剂，与干燥的吸附剂的配体浓度相对。
透过物级分
当使含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物接触时，一种或多种可溶性蛋白可以被色谱支持物保留，然而聚集的酪蛋白保持未结合的，流过色谱支持物并且可以见于透过物级分中。
透过物级分还可以包含至少一种选自以下的化合物：乳铁蛋白、乳过氧化物酶、聚集的酪蛋白、矿物质、维生素、碳水化合物和脂肪。
矿物质可以选自钙、磷、碘、镁、锌和钾。甚至更优选地，矿物质可以为钙和选自磷、碘、镁、锌和钾的第二矿物质。
透过物级分中存在的矿物质可以优选地为来自含有聚集的酪蛋白的材料的矿物质。优选地，透过物级分中50％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，例如如透过物级分中至少75％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，如透过物级分中至少90％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，例如透过物级分中至少92％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，如透过物级分中至少95％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，例如透过物级分中至少98％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料，如透过物级分中100％的矿物质来自含有聚集的酪蛋白的材料。
在本发明的实施方案中，相对于含有聚集的酪蛋白的材料中矿物质的总量，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的至少20％(w/w)的矿物质，如至少30％、例如至少40％、如至少50％、例如至少70％、如至少80％例如至少90％、如至少95％、例如至少98％、如至少99％例如至少99.5％、如至少99.9％的矿物质存在于透过物级分中。
可以使透过物级分经历另外的分级步骤。优选地，从透过物级分分离乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶。例如从透过物级分分离乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的方法为本领域技术人员众所周知的。
在本发明的实施方案中，从另外的分级步骤获得的乳铁蛋白的收率为含有聚集的酪蛋白的材料和/或透过物级分中存在的乳铁蛋白的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的乳铁蛋白级分，或可以将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用乳铁蛋白级分，或者可以将其用于婴儿配方、乳制品、运动和健身营养品、药物产品、营养食品产品、治疗产品、体重管理、即食热餐、加工肉类、化妆品、口腔卫生用品或动物饲料产品的组成中。
在本发明的进一步实施方案中，从另外的分级步骤获得的乳过氧化物酶的收率为含有聚集的酪蛋白的材料和/或透过物级分中存在的乳过氧化物酶的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的乳过氧化物酶级分，或者将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用乳过氧化物酶级分，或者将其用于乳制品、肥皂产品如洗发露、化妆品、口腔卫生用品如牙膏、针对痤疮的产品、植物保护产品、杀菌剂或杀真菌剂的组成中。
去除乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的另外的分级步骤可以在含有聚集的酪蛋白的材料上进行，产生乳铁蛋白/乳过氧化物酶耗尽的含有聚集的酪蛋白的材料。在本发明的上下文中，术语“乳铁蛋白/乳过氧化物酶耗尽的含有聚集的酪蛋白的材料”涉及以透过物级分的干物质基础计，存在至多0.05mg/ml、如至多0.02ml/mg、例如至多0.01ml/mg、如至多0.005mg/ml乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶。
如果本发明的步骤(i)中提供的含有聚集的酪蛋白的材料为乳铁蛋白/乳过氧化物酶耗尽的含有聚集的酪蛋白的材料，则透过物级分包含酪蛋白聚集体、矿物质、维生素、碳水化合物和脂肪。
在本发明的实施方案中，可以将透过物级分、第二透过物级分和/或乳铁蛋白/乳过氧化物酶耗尽的含有聚集的酪蛋白的材料用于制备范围广泛的乳制品，如奶酪、酸奶、饮用乳制品、发酵乳制品、烘焙食品、甜品和奶精。具体地，从β-乳球蛋白的完全耗尽或部分耗尽获益的产品是优选的，如婴儿配方、低变应原性产品和技术人员已知的某些类型的奶酪。
另外的分级步骤导致至少一种保留的乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶级分、包含单独成分的两种级分或包含两者组合的级分以及包含酪蛋白聚集体的第二透过物级分。随后，可以使透过物级分和/或第二透过物级分经历凝乳的形成，并且例如被用于奶酪的生产。
在本发明的实施方案中，凝乳的形成可以通过以下提供：将凝乳酶添加至透过物级分和/或第二透过物级分，导致凝乳级分和糖巨肽级分(GMP-级分)的形成。在将凝乳酶添加至透过物级分和/或第二透过物级分之后，酪蛋白聚集体开始沉淀，形成固体凝乳级分和进入液相的糖巨肽级分。可以通过过滤、离心和/或滗析分离凝乳级分和GMP-级分。
在本发明的另一实施方案中，凝乳的形成可以通过以下提供：向透过物级分和/或第二透过物级分添加酸或添加酸与加热的组合，导致固体凝乳级分的形成。
奶酪生产过程可以遵循技术人员已知的传统的奶酪生产过程。在传统的奶酪生产期间，在切割沉淀的酪蛋白之前，测定沉淀的酪蛋白的适当坚度是重要的，以便排干乳清。传统上，奶酪制造者进行一系列测试以鉴定用于切割的最佳坚度。在本发明的实施方案中，切割沉淀的酪蛋白以便排干乳清的步骤可以省略或显著减少。
在奶酪制造中使用获得自本发明的沉淀的酪蛋白的优势为透过物级分和/或第二透过物级分耗尽或基本上耗尽纤溶酶原。该耗尽或基本耗尽导致更稳定的酪蛋白结构以及更可靠且可重现的奶酪生产过程。
在本发明的实施方案中，还可以例如通过膜过滤、吸附色谱法或它们的组合分离包含糖巨肽(GMP)的级分。
在本发明的进一步实施方案中，相对于蛋白总量，糖巨肽(GMP)的收率为至少50％的GMP、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的上下文中，第二透过物级分不同于透过物级分。优选地，第二透过物级分与透过物级分的不同之处在于至少一种可溶性蛋白，例如可溶性蛋白乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶已经被去除，并且基本上不存在于第二透过物级分中。
在本发明的上下文中，术语“基本上不存在”涉及可溶性蛋白，如可溶性蛋白乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶中的至少一种，最初存在于透过物级分中，但已经通过另外的分级步骤将所述可溶性蛋白从透过物级分中分离。在本发明的上下文中，术语“基本上不存在”涉及相对于透过物级分中可溶性蛋白，例如乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的总量，存在至多10％、例如至多5％、如至多3％、例如至多1％、如至多0.1％的可溶性蛋白，例如乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶。
在本发明的实施方案中，第二透过物级分包含至多0.015g乳铁蛋白/L第二透过物级分、如至多0.01g乳铁蛋白/L第二透过物级分、例如至多0.005g乳铁蛋白/L第二透过物级分、如至多0.001g乳铁蛋白/L第二透过物级分、例如至多0.0005g乳铁蛋白/L第二透过物级分。
在本发明的另外实施方案中，第二透过物级分包含至多0.003g乳过氧化物酶/L第二透过物级分、如至多0.001g乳过氧化物酶/L第二透过物级分、例如至多0.0005g乳过氧化物酶/L第二透过物级分、如至多0.00001g乳过氧化物酶/L第二透过物级分。
洗涤
在含有聚集的酪蛋白的材料已经与色谱支持物接触，并且已经允许一种或多种可溶性蛋白与吸附剂结合之后，根据本发明的方法还可以涉及使用洗涤缓冲液进行任选的洗涤步骤。因此，提供至少一种分离的可溶性蛋白级分的方法还可以包括以下步骤：
(iv)任选地洗涤色谱支持物。
可以通过使用洗涤缓冲液进行洗涤色谱支持物的步骤，由此可以获得洗涤级分。
一旦含有聚集的酪蛋白的材料已经与色谱支持物接触，可以使用洗涤缓冲液洗涤色谱支持物。洗涤缓冲液的pH可以依赖于过程、待分离的可溶性蛋白和使用的配体。
在本发明的优选实施方案中，洗涤缓冲液可以为酸或水，如自来水、纯净水、去离子水、软化水或蒸馏水。可适用于调节洗涤缓冲液的pH值的酸可以选自低成本的矿物酸，如盐酸、磷酸和硫酸，但也可以来自食品级有机酸，如乙酸、柠檬酸和乳酸。
在本发明的实施方案中，用于洗涤步骤的流速可以选自先前将含有聚集的酪蛋白的材料装载至色谱支持物所概述的范围。
洗脱
为了获得被色谱支持物保留的一种或多种可溶性蛋白，可以使色谱支持物经历洗脱缓冲液。
在本发明的上下文中，术语“洗脱缓冲液”涉及这样的组合物，其能够将色谱支持物从吸附本发明的可溶性蛋白的状态改变至释放和洗脱本发明的至少一种可溶性蛋白级分。
为了控制洗脱，使用pH的改变、疏水性的改变、电导率的改变(例如添加盐)或它们的组合是可能的。
可以提供不同的洗脱策略。使用选择性洗脱程序，或许全部保留的蛋白可以被同时洗脱，或者可选地保留的蛋白可以被依序洗脱。在本发明中，通过改变pH，改变电导率，保留的可溶性蛋白可以被同时或依序洗脱。改变可以为瞬时改变或逐渐改变。
优选地，可以通过改变pH洗脱至少一种可溶性蛋白级分。在本发明的优选实施方案中，洗脱缓冲液的pH可以促进吸附至色谱支持物的可溶性蛋白的最佳解吸。在本发明的优选实施方案中，待分离的可溶性蛋白为β-酪蛋白，以及洗脱缓冲液的pH低于6.0。在本发明的另一实施方案中，待分离的可溶性蛋白为使用pH 6.0或以上的洗脱缓冲液的β-乳球蛋白、α-白蛋白和/或免疫球蛋白G。在本发明的实施方案中，待分离的可溶性蛋白为使用pH低于6.0的洗脱缓冲液的β-酪蛋白，以及待分离的可溶性蛋白为使用pH 6.0或以上的洗脱缓冲液的β-乳球蛋白、α-白蛋白和/或免疫球蛋白G。
在本发明的实施方案中，洗脱缓冲液可以包含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、甲酸铵、磷酸钾、磷酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、碳酸钠或它们的任何组合。优选地，洗脱缓冲液优选包含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵或它们的任何组合。
可溶性蛋白级分
取决于提供的洗脱策略，至少一种可溶性蛋白级分可以为包含全部保留的可溶性蛋白的单一可溶性蛋白级分，或者可以将保留的可溶性蛋白洗脱成两种或更多种不同的可溶性蛋白级分，其包含单独的可溶性蛋白或特定组群的可溶性蛋白。
根据本发明，至少一种可溶性蛋白级分可以包含一种或多种可溶性蛋白。
在本发明的实施方案中，一种或多种可溶性蛋白可以选自免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶、脂肪酶和可溶性酪蛋白如β-酪蛋白。
如果两种或更多种保留的可溶性蛋白发现于相同的可溶性蛋白级分中，则可优选色谱支持物保留的可溶性蛋白之间的相对比率基本上与含有聚集的酪蛋白的材料中的同一可溶性蛋白的相对比率相同。
在本发明的实施方案中，至少一种可溶性蛋白级分包含与含有聚集的酪蛋白的材料的蛋白概况基本上类似的蛋白概况。所述蛋白概况可以包含被色谱支持物保留的两种或更多种可溶性蛋白、如3种或更多种可溶性蛋白、例如4种或更多种可溶性蛋白、如5种或更多种可溶性蛋白、例如6种或更多种可溶性蛋白，所述可溶性蛋白选自免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶、脂肪酶和可溶性酪蛋白。
在本发明的上下文中，术语“基本上相同”和“基本上类似”涉及至少一种可溶性蛋白级分中存在的可溶性蛋白的量与含有聚集的酪蛋白的材料中相同的可溶性蛋白的量之间具有至多10％、如至多5％、例如至多3％、如至多1％的差异。
在本发明的实施方案中，可溶性级分中一种或多种可溶性蛋白的收率可以为含有聚集的酪蛋白的材料中存在的可溶性蛋白的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的优选实施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的至少可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一种可以被色谱支持物保留。
根据本发明，通过色谱支持物的分离提供透过物级分和至少可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一种的保留物。
在本发明的实施方案中，分离涉及提供至少一种可溶性蛋白级分的过程，所述可溶性蛋白级分包含可溶性蛋白的混合物，如至少免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一种。
根据本发明的至少一种可溶性蛋白级分可以包含可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白中的至少一种以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一种。
在本发明的另一实施方案中，分离涉及提供包含单独的可溶性蛋白级分的两种或更多种不同的可溶性蛋白级分。
如果提供两种可溶性蛋白级分，则它们可以包含：
-一种可溶性蛋白级分包含β-乳球蛋白级分，以及另一种可溶性蛋白级分可以包含免疫球蛋白G级分或组合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白级分；
-一种β-乳球蛋白级分，以及另一种可溶性蛋白级分可以包含β-酪蛋白级分；
-一种组合的β-乳球蛋白/β-酪蛋白级分，以及另一种可溶性蛋白级分可以包含免疫球蛋白G级分；α-乳白蛋白级分或组合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白级分；
-一种可溶性蛋白级分包含免疫球蛋白G级分，以及另一种可溶性蛋白级分包含α-乳白蛋白级分或β-乳球蛋白级分或组合的α-乳白蛋白/β-乳球蛋白级分；或
-一种可溶性蛋白级分包含α-乳白蛋白级分，以及另一种可溶性蛋白级分包含免疫球蛋白G级分或组合的免疫球蛋白G/β-乳球蛋白级分。
在本发明的实施方案中，还可以将组合的级分，如组合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白级分；组合的β-乳球蛋白/β-酪蛋白级分；组合的α-乳白蛋白/β-乳球蛋白级分和/或组合的免疫球蛋白G/β-乳球蛋白级分分级成两种单独的蛋白级分。
如果提供3种可溶性蛋白级分，则一种级分可以包含免疫球蛋白G级分；一种级分包含β-乳球蛋白级分；以及一种级分包含α-乳白蛋白级分。
如果提供4种可溶性蛋白级分，则一种级分可以包含免疫球蛋白G级分；一种级分包含β-乳球蛋白级分；一种级分可以包含β-酪蛋白级分，以及一种级分包含α-乳白蛋白级分。
在本发明的实施方案中，可以获得两种可溶性蛋白级分，第一可溶性蛋白级分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，以及第二可溶性蛋白级分包含一种或多种选自以下的可溶性蛋白∶免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶和脂肪酶。
在本发明的另一实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的可溶性酪蛋白级分，如β-酪蛋白级分，或者可以将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用可溶性酪蛋白级分，并且特别是β-酪蛋白级分，或者可以将其用于以下组成中：婴儿配方；乳化剂组合物；发泡剂；口腔卫生，如牙膏；酶活化，特别是核酸酶活化；乳制品；赖氨酸和/或色氨酸的来源，例如动物饲料，如猪或家禽的动物饲料；化妆品；功能食品、饮食产品；头发修复；流变学和/或粘性降低；或增加肠中矿物质摄取、低血压、阿片样物质活性、ACE-抑制活性、对抗RSV、对抗流感的药物或营养食品组合物。
根据上文的实施方案，优选第一可溶性蛋白级分中获得的可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白的收率为含有酪蛋白的材料中存在的可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白的量的至少10％、20％、30％40％、50％，如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的实施方案中，获得三种可溶性蛋白级分，第一可溶性蛋白级分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白级分包含β-乳球蛋白，以及第三可溶性蛋白级分包含一种或多种选自以下的可溶性蛋白∶免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶和脂肪酶。
根据上文的实施方案，优选第二可溶性蛋白级分中获得的β-乳球蛋白的收率为含有酪蛋白的材料中存在的β-乳球蛋白的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的另一实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的β-乳球蛋白级分，或者可以将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用β-乳球蛋白级分，或者将其用于以下组成中：乳制品、饮料、即食热餐、加工肉类、烘焙食品、稳定化产品、或者维生素或矿物质载体。
在本发明的进一步实施方案中，获得四种可溶性蛋白级分，第一可溶性蛋白级分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白级分包含β-乳球蛋白，第三可溶性蛋白级分包含免疫球蛋白G，以及第四可溶性蛋白级分包含一种或多种选自以下的可溶性蛋白：α-乳白蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶和脂肪酶。
根据上文的实施方案，第三可溶性蛋白级分中获得的免疫球蛋白G的收率为含有酪蛋白的材料中存在的免疫球蛋白G的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的另一实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的免疫球蛋白G级分，或者可以将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用免疫球蛋白G级分，或者可以将其用于以下组成中：婴儿配方、乳制品、运动和健身营养品、药物或营养食品产品、体重管理、化妆品、营养免疫疗法或被动免疫。
在本发明的另外实施方案中，获得五种可溶性蛋白级分，第一可溶性蛋白级分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白级分包含β-乳球蛋白，第三可溶性蛋白级分包含免疫球蛋白G，第四可溶性蛋白级分包含α-乳白蛋白，以及第五可溶性蛋白级分包含一种或多种选自以下的可溶性蛋白∶血清白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、骨桥蛋白、纤溶酶原、转铁蛋白、蛋白胨如PP3、碱性磷酸酶和脂肪酶。
根据上文的实施方案，第四可溶性蛋白级分中获得的α-乳白蛋白的收率为含有酪蛋白的材料中存在的α-乳白蛋白的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本发明的另一实施方案中，可以单独使用根据本发明分离的α-乳白蛋白级，或者可以将其用于技术人员已知的应用的组成中。具体地，可以单独使用α-乳白蛋白级分，或者可以将其用于以下组成中：婴儿配方；人乳化婴儿食品；营养产品；运动和健身营养产品；乳制品；饮料；例如针对减少压力、阿片样物质活性、细胞生长的调节、抗溃疡活性、免疫调节、抗高血压、抗腹泻、睡眠障碍、情绪障碍和压力/抑郁问题的药物和/或营养食品组合物。
可以优选地从含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物之间的单次接触获得可溶性蛋白的这些高回收率。在本发明的上下文中，术语“单次接触”涉及使含有聚集的酪蛋白的材料与色谱支持物仅接触一次，并且没有使透过物级分或至少一种可溶性蛋白级分再循环至色谱支持物以改善分离。
根据洗脱缓冲液的组成和洗脱程序，可以在至少一种可溶性蛋白级分中获得其他可溶性蛋白和可溶性蛋白的不同洗脱顺序。
为了改善含有聚集的酪蛋白的材料中蛋白的稳定性，被色谱支持物保留的一种或多种可溶性蛋白可以为纤溶酶原。
可以将从去除纤溶酶原获得的透过物级分优选地用于奶酪生产、长效乳、UHT-乳或UHT-奶油。
在本发明的实施方案中，可以使获得的至少一种可溶性蛋白级分经历第二浓缩步骤。此类第二浓缩步骤可以包括超滤、纳滤、微滤、吸附色谱法、离心或它们的任何组合。第二浓缩步骤可以导致包含至少一种可溶性蛋白级分中存在的一种或多种可溶性蛋白的第二浓缩的保留物级分，以及主要包含水的第三浓缩的透过物级分。在本发明的进一步实施方案中，可以将在第三浓缩的透过物级分中获得的水优选地再用于根据本发明的方法中。
在本发明的实施方案中，至少一种可溶性蛋白级分可以为液体、浓缩液或粉末。
另外的实施方案
在大多数现有技术中，蛋白的变性并不被认为是一个问题，并且实施可能危及天然蛋白质的功能的过程条件。
本发明可以从可溶性蛋白的非常温和的处理中受益，并且可优选地期望保持或基本上保持分离的可溶性蛋白的天然功能。
不同的条件可引起可溶性蛋白的变性，以及含有聚集的酪蛋白的材料中的一些蛋白可能比其他蛋白更敏感。可引起变性的条件的实例可以暴露于小于3以及大于11的pH值；高盐浓度；加热；和化学品。
因此，为了避免可溶性蛋白的变性，优选地使含有聚集的酪蛋白的材料不经历巴氏灭菌。
虽然应避免高温以便不会使可溶性蛋白处于变性的风险，但根据本发明的方法可以在高于环境温度的温度有利地进行。在本发明的进一步实施方案中，步骤(ii)至(v)中的至少一个可以在高于25℃、如高于27℃、例如高于30℃、如高于35℃、例如高于40℃、如高于45℃、例如约50℃、如在25-80℃范围内、例如在30-70℃范围内、如在35-65℃范围内、例如在40-60℃范围内、如在45-55℃范围内的温度进行。
可溶性β-酪蛋白可以结合胶束酪蛋白。然而，在低温下，β-酪蛋白分子可以从胶束酪蛋白离解或部分离解。因此，在本发明的实施方案中，步骤(i)和/或(ii)中的含有聚集的酪蛋白的材料的温度可以在1-10℃范围内，如在2-7℃范围内，例如在3-5℃范围内。可选地，含有聚集的酪蛋白的材料的温度可以在与色谱材料接触之前保持较低，即上文提及的1-10℃范围内的温度下，但在与色谱支持物接触之前立即升高至高温，如上文提及的25-80℃范围内。
如本发明中所述的从含有聚集的酪蛋白的材料获得的可溶性蛋白的纯度、收率和回收率可以由乳清材料通过色谱支持物的单个循环提供。
在本发明的上下文中，术语“单个循环”涉及色谱支持物与含有聚集的酪蛋白的材料之间仅具有一次接触。透过物级分、第二透过物级分或至少一种可溶性蛋白级分并没有再循环至色谱支持物以便提供级分中存在的成分的进一步分离。
在本发明的实施方案中，可以通过使两个色谱支持物串联连接提供至少一种可溶性蛋白级分。因此，可以提供一系列的至少2个色谱支持物，并且其中第一色谱支持物装载有含有聚集的酪蛋白的材料，以及第二色谱支持物装载有从第一色谱支持物获得的流过级分，透过物级分。
在本发明的实施方案中，相对于混合模式配体能够结合的可溶性蛋白，第一色谱支持物可以超负载有被色谱支持物保留的可溶性蛋白。
在本发明的实施方案中，此类超负载可以优选地导致在第二色谱支持物上保留可溶性蛋白免疫球蛋白G和/或任选地α-乳白蛋白，以及在第一色谱支持物上保留可溶性蛋白β-乳球蛋白和任选地β-酪蛋白。
在本发明的优选实施方案中，可以将根据本发明的至少一种可溶性蛋白级分和/或根据本发明的乳铁蛋白/乳过氧化物酶级分、糖巨肽级分和/或凝乳级分用作食物产品、饲料产品、饮食产品、药物产品、营养食品产品、治疗产品、饮料产品、护肤品、化妆品、针对营养免疫疗法的产品或针对被动免疫的产品中的成分。
应注意，在本发明的方面之一的上下文中或在本发明的实施方案之一中所述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面或其他实施方案。
本申请中引用的所有专利和非专利参考据此通过引用整体并入。
实施例
实施例1
从脱脂乳中直接分离β-乳球蛋白。脱脂乳是未经历酪蛋白去除的未巴氏灭菌的脱脂乳。
脱脂乳中基本上所有的可溶性蛋白被色谱支持物保留，以及聚集的酪蛋白、矿物质、维生素、碳水化合物和脂肪流过色谱支持物。随后从色谱支持物洗脱β-乳球蛋白级分，并对其进行分析。
原材料
使用的原材料是从生鲜乳(牛科动物)获得的、未经巴氏灭菌的以及由当地农民收集的脱脂乳。通过离心从生鲜乳中去除奶油。脱脂乳的pH为pH 6.58，并且无需任何pH调节(牛奶的天然pH)。
吸附剂
使用的吸附剂为基于苄胺的混合模式配体。
吸附剂基于5％的琼脂糖和掺入的10％的碳化钨颗粒，密度为大约2.9g/ml，以及颗粒大小在40-250μm范围内。混合模式吸附剂与表氯醇交联，并且与苄胺偶联。配体浓度：大约42mmol混合模式组/L吸附剂。
过程参数
将13.2升吸附剂(混合模式吸附剂)填充在直径为15cm的色谱柱中。填充模式的床高为75cm。
用75升水平衡吸附剂。
将132升原材料(脱脂乳)装载在色谱柱上，导致装载率为1∶10(吸附剂(升)：原材料(升))。流速，重力：20cm/min，导致两倍的床膨胀(至150cm膨胀的床高度)。
用75升水洗涤吸附剂。
用25升20mM NaOH洗脱β-乳球蛋白。用1M盐酸中和洗出液。通过改变洗脱缓冲液可以依序洗脱来自脱脂乳并且结合色谱材料的其他可溶性蛋白。
在50℃进行实验。
结果
结果显示：获得20.08mgβ-乳球蛋白/ml洗出液，以及获得总计562gβ-乳球蛋白。色谱材料(和混合模式配体)显示每ml吸附剂的容量是42.6mgβ-乳球蛋白。
凝胶过滤分析显示高纯度的β-乳球蛋白级分，参见图1，其显示从本实施例获得的β-乳球蛋白级分的纯度。虚线示出从色谱支持物直接获得的β-乳球蛋白级分的纯度，以及实线示出从色谱支持物获得，随后进行随后的微滤步骤获得的β-乳球蛋白级分的纯度。
用SDS-PAGE技术估算不同级分中不同蛋白(例如在洗出液中(β-乳球蛋白级分))的收率。根据下述通用程序进行SDS-PAGE凝胶电泳：
将25μL样品与25μL tris-甘氨酸样品缓冲液(LC2676,Novex by Life Technologies,USA)混合。在非还原条件下，将所得溶液在水中煮沸5min。将20μL煮沸的样品上样至预制的SDS-PAGE凝胶夹盒(4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶(1mm),(EC6025,Novex by Life Technologies,USA)中。将凝胶在200V，400mA下运行1小时。用考马斯蓝染色剂对凝胶进行染色过夜(SimplyBlueTMSafeStain,LC6060)。
基于SDS-PAGE的分析显示β-乳球蛋白级分包含小于5％(以重量/重量计)的α-乳白蛋白以及仅痕量的免疫球蛋白。
因此，提供具有高纯度、高收率和高回收率的β-乳球蛋白级分。
参考
WO 92/00799
WO 92/18237
WO 97/17132
WO 00/57982
WO 98/33572