专利名称：含奥沙培南-3-羧酸的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及奥沙培南(oxapenem)化合物，涉及含奥沙培南化合物的药物组合物及其医药用途。
β-内酰胺抗生素(例如青霉素、头孢菌素和碳青霉烯(carbapenem))众所周知用于细菌感染的治疗，但其长时间的使用，使细菌增加了抗药性。
细菌抗药性的主要机理是通过β-内酰胺酶起作用的。有四种β-内酰胺酶，称为A至D类。在临床上，A类和C类β-内酰胺是最重要的。采用β-内酰胺抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的组合疗法，已经被证明成功地阻止了一些形式的抗药性。公知的组合产品是，例如Tazocim(RTM)这是一种哌拉西林抗生素和他巴克坦抑制剂的组合，以及安灭菌(RTM)，一种阿莫西林抗生素和克拉维酸抑制剂的组合。但是，他巴克坦和克拉维酸只是对抑制A类β-内酰胺有效，离开其抗生素同伴对类型B、D和最重要的的C类β-内酰胺是不设防的。
虽然β-内酰胺抑制剂对抑制C类β-内酰胺具有活性是公知的，但迄今为止还没有市售的对抑制A类和C类β-内酰胺均具有活性的“广谱”抑制剂。
EP 0 301394公开了许多种作为抗菌剂的奥沙培南化合物。EP 0362622公开了作为广谱β-内酰胺酶抑制剂的奥沙培南化合物，所述的抑制剂对于抑制A、C和D类β-内酰胺酶具有高活性。EP 0 548790公开了奥沙培南结构的6位碳上的手性侧链对体外β-内酰胺酶的抑制活性具有明显的立体化学效应。具有(l′S)-1-羟烷基侧链的化合物，具有与沙纳霉素相对的构型，显示出对源自大肠埃希氏杆菌的TEM1β-内酰胺酶的抑制活性增加，所述的TEM 1β-内酰胺酶是常见的A类β-内酰胺酶。上述文献中没有能提供出有关体内活性的特殊证据。
实现β-内酰胺足够高的血液浓度和长的生物半衰期对于治疗细菌感染也是重要的。传统的β-内酰胺抗生素，例如在头孢菌素领域中，诸如头孢他啶和头孢曲松这样的化合物，这个问题已经得到了解决。(在人体血清中，其体内生物半衰期分别是1.7-2.1小时和5.8-8.7小时)。相反，非传统的β-内酰胺，例如卡巴培南和亚胺培南的相对应的体内生物半衰期是非常短的，分别是0.9和1.0小时。克拉维酸钾的半衰期是0.7-1.4小时。较长的生物半衰期对抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的实际应用是非常重要的。
本发明申请已经在EP 0 362622所公开的最宽范围内发现了几种新化合物，这些化合物显示出令人惊讶的高生物利用度，和出色的对A类和C类β-内酰胺酶的抑制活性。而且，发现它们具有意想不到的和出色的血清稳定性，这样就产生了提高了的血液水平和提高的生物半衰期。
根据本发明的第一个方面，提供了一种奥沙培南化合物，该化合物是或能够形成式Ia或Ib的两性离子 其中R是C1-C8支链或直链烷基，其包括质子化碱性取代基。
优选质子化碱性取代基是质子化氮碱。更优选质子化碱性取代基是质子化胺或质子化氨基亚甲基氨基取代基。
优选化合物是这些式Ia表示的化合物，其中R是-(CH2)4NH3+(以下称作化合物E)；R是-(CH2)3NH3+(以下称作化合物PFOB)；R是-(CH2)2NH3+(以下称作化合物A)；R是-(CH2)2NHCHNH2+(以下称作化合物B)；或R是-CH2NHCHNH2+(以下称作化合物D)。
应该理解上述B和D的R基团中氮的质子化可以在任一氮上进行。因此，B和D也可以通过式Ia表示，其中R是-(CH2)2NH2+CHNH和-CH2NH2+CHNH。
还优选式Ib的化合物，其中R是-(CH2)3NH3+(以下称作YOB)。
应该理解两性离子形式(即当碱性(例如胺)基团被质子化时，羧酸基团被去质子化)和非离子形式(当碱性(例如胺)基团和羧酸基团是中性时)的本发明化合物之间存在着平衡。该组合物的非离子形式，和两性离子和非离子形式的平衡混合物均在本发明范围内。因此能够形成两性离子的奥沙培南化合物包括非离子形式的奥沙培南化合物，那就是式Ia或式Ib的奥沙培南化合物，其中CO2-已经被质子化成CO2H，而R基团上的质子化碱性基团或质子化氮碱已经被去质子化。能够形成两性离子的奥沙培南化合物的实例是式Ia的化合物，其中CO2-已经被质子化成CO2H，而R基团是-(CH2)4NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)2NH2、-(CH2)2NHCHNH、或-CH2NHCHNH；和式Ib的化合物，其中CO2-已经被质子化成CO2H，而R基团是-(CH2)3NH2。
而且，能够形成两性离子的奥沙培南化合物还包括处于两性离子和非离子形式的奥沙培南化合物的混合物。
申请人已经发现(a)奥沙培南双环结构的位置5和6的特殊的立体化学结构；和(b)特殊的两性离子结构(或能够形成这样的两性离子结构)的结合；得到的化合物具有显著的生物利用度和广谱活性。
与公知的化合物相比，所要求保护的化合物显示出明显高的生物利用度。该化合物显示出对A类和C类的β-内酰胺酶明显的活性。特别是化合物YOB显示出对A类β-内酰胺酶明显高的活性和选择性。
本发明中所述的化合物和β-内酰胺抗生素对宽范围的格兰氏阳性细菌(葡萄球菌、链球菌)和格兰氏阴性菌(肠杆菌、非发酵菌种)是有抑制活性的，所述的细菌能够造成尿道、呼吸道、伤口的感染和腹内脓毒症。该奥沙培南化合物和抗生素可以并行给药，(例如以混合物的形式给药)，或例如以独立的药剂分别给药。该奥沙培南和抗生素可以在不同的时间给药。
根据本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，包括根据本发明第一个方面的药理有效量的奥沙培南化合物。优选药物组合物还包括药理有效量的抗生素。该抗生素可以是β-内酰胺抗生素(例如，头孢他啶)。
根据本发明还有的另一个方面，提供一种治疗感染的方法，包括对需要这种治疗的病人给药药理有效量的式Ia或Ib的两性离子的步骤 其中R是C1-C8支链或直链烷基，其包括质子化碱性取代基。优选质子化碱性取代基是质子化氮碱。优选质子化碱性取代基是质子化胺或质子化氨基亚甲基氨基取代基。该方法还可包括对病人给药药理有效量的抗生素的步骤。该奥沙培南化合物和抗生素可以并行给药，或在不同的时间给药。
可以通过β-内酰胺酶抑制进行所述治疗。
优选该方法是用于治疗尿道、呼吸道、伤口感染和腹内脓毒症的感染。病人可以是人或动物患者。
附图的简要说明本发明将参照以下附图进行举例说明，其中
图1显示的是在小鼠中以50mg/kg的量进行皮下给药情况下，奥沙培南类似物的血浆血液浓度水平；和图2显示的是由市售化合物合成本发明具体化合物(PFOB)的示意图。
本发明的具体说明已经合成超过40种奥沙培南类似物，并进行了体外试验。结构活性关系(SAR)研究已经对奥沙培南分子的各部分在化学稳定性、靶标结合亲和力、抗菌活性和β-内酰胺酶抑制的范围和程度方面的功能进行了确定。还没有能够由结构研究来预知生物利用度。
我们已经合成并试验了几种奥沙培南化合物，称为PFOB、YOB、A、E、B、D、U和XOB。其结构如表1中所示。可以看到PFOB、YOB、E、B、D和A是本发明的实施方案。
合成法如下所述。
表1奥沙培南化合物的结构 A.药动学测试进行组合物XOB、YOB、PFOB和YOB在小鼠(每时间点平均是3)中的血浆血液浓度水平的测定，测定是在5、10、20和30分钟的时间点进行的，按照每kg小鼠50mg的剂量进行皮下(SC)给药。结果显示在表2中，并如图1中所示。
表2
由按照皮下给药的所有时间点的血浆血液浓度水平可以清楚地看出，本发明的化合物(两性离子化合物PFOB和YOB)与盐XOB和U相比，具有明显出色的生物利用度。而且，应该注意PFOB和U，以及YOB和XOB的差异仅在于PFOB和YOB化合物中有胺取代链(代替甲基)。胺取代链允许两性离子结构。由此，该组合物非常适合于在医院中使用，进行腹膜内和皮下给药。
B.与头孢他啶(ceftazidime)组合的体外活性根据NCCLS指南(2000)，通过琼脂稀释，进行确定最小抑制浓度(MIC)的试验。在下述数据中的最低MIC说明具有最强的活性。
A类β-内酰胺酶对单独的头孢他啶(CAZ)、以及以2∶1的比例的头孢他啶与PFOB、YOB、U或XOB(CAZ+PFOB，CAZ+YOB，CAZ+U和CAZ+XOB)的分别组合就各种A类β-内酰胺酶的抑制活性进行测定。结果显示在表3中。
表3对A类β-内酰胺酶的抑制活性
可以看出当与CAZ结合使用时，所有的奥沙培南对大肠埃希氏杆菌TEM-3、TEM-6、TEM-9和TEM-10的抑制活性相比于单独使用CAZ要明显优异。
根据本发明的组合物YOB，当与XOB(一种结构上和立体化学上接近的组合物，其不是两性离子)相比时显示出显著的活性。通过对大肠埃希氏杆菌ATCC 25922和TEM-1的YOB的MIC值(0.03和0.06)与XOB(0.25和0.25)相比得到了很好的证明。应该注意到对TEM-9和TEM-10的MIC值也显示出其优越性。
C.类β-内酰胺酶对单独的头孢他啶(CAZ)、以及以1∶1的比例的头孢他啶分别与PFOB、YOB、U或XOB(CAZ+PFOB，CAZ+YOB，CAZ+U和CAZ+XOB)的组合就各种C类β-内酰胺酶的抑制活性进行测定。结果显示在表4.1中。
表4.1对肠杆菌科细菌脱抑制的C类β-内酰胺酶的抑制活性
可以看出当与CAZ结合使用时，所有的奥沙培南对所有的生物体的抑制活性相比于单独使用CAZ要明显出色。
根据本发明的组合物PFOB，当与U(一种结构上和立体化学上接近的组合物，其不是两性离子)相比时显示出明显的活性。通过对阴沟肠杆菌84-con(E.cloacae 84-con)、弗劳地氏柠檬杆菌C2-con(C Freundii C2-con)和粘质沙雷氏菌S2-con(S marcescensS2-con)的PFOB的MIC值(分别是4、0.03和0.03)与U(8、2和0.25)相比得到了很好的证明。还应该注意到YOB对粘质沙雷氏菌S2-con抑制的MIC值比XOB明显出众。
对单独的头孢他啶(CAZ)、以及以2∶1的比例的头孢他啶分别与PFOB、YOB、U或XOB(CAZ+PFOB，CAZ+YOB，CAZ+U和CAZ+XOB)的组合就各种C类β-内酰胺酶的抑制活性进行测定。结果显示在表4.2中。
表4.1对肠杆菌科细菌脱抑制的C类β-内酰胺酶的抑制活性(比例2∶1)
作为本发明的一个实施方案，PFOB当与U(一种结构上和立体化学上接近的组合物，其不是两性离子)相比再一次显示出优越的活性。通过对阴沟肠杆菌Hennessy(E.cloacae Hennessy)、阴沟肠杆菌84-con和弗劳地氏柠檬杆菌C2-con的PFOB的MIC值(分别是4、4和2)与U(8、16和4)相比得到了很好的证明。还应该注意到YOB对弗劳地氏柠檬杆菌C2-con抑制的MIC值比XOB明显优越。
概述可以看出本发明的具体组合物既具有出色的生物利用度，又具有对A类和C类β-内酰胺酶的广谱活性。
对化合物的活性和C-6取代基的立体化学结构之间的依存或关系不能简单地作出推测U和PFOB具有(1′R)-1-羟乙基侧链，而XOB和YOB具有(l′S)-1-羟乙基侧链。对PFOB和YOB的出色活性还没能作出推理结论。
C.1 XOB和YOB的化学稳定性在37℃，pH7.4的磷酸盐生理缓冲液中，通过对10-4M奥沙培南进行265nm紫外光谱分析，确定水解半衰期。
C.2 XOB和YOB在血清中的稳定性用大肠埃希氏杆菌TEM-1(青霉素抗性)，采用琼脂扩散测试对血清稳定性进行微生物学测定。用无菌的牛血清(OXOID)在37℃，以0.033％浓度对奥沙培南进行培养。在0小时、1.5小时、3小时、4.5小时和6小时，将等分样品(30ml)在市售过滤盘(OXOID)上点样，所述的过滤盘含青霉素(75mg)和余量为活性β-内酰胺酶抑制剂(奥沙培南)，由观察到的减少中的抑制直径(27-12mm)与具有青霉素(75mg)的盘所得到的直径(24-0mm)进行比较而计算，所述含有青霉素的盘其中点有多种量(10mg，5mg，2.5mg，1.25mg，0mg)的β-内酰胺酶抑制剂。
因此，在血清中两性离子化合物YOB比XOB更稳定，而相反两种化合物的化学稳定性实际上是相等的。两性离子奥沙培南YOB(当与XOB比较时，XOB是一种结构上和立体化学上接近的组合物，不是两性离子)在血清中稳定性令人意想不到的增加是最明显和重要的。这种稳定性提供了用于人和动物细菌感染治疗的高的血液浓度水平和长的生物半衰期。
D.化合物PFOB、A、E和YOB的合成D.1(5R，6R，1′R)-3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸[PFOB]的合成以下所述的合成如附图2所示。
向35L房德勒氏容器(GLMS)添加乙腈(16.7kg)和(3R，4R)-4-(乙酰氧基)-3-[(lR)-1-[[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]乙基]-2-氮杂环丁酮(3.34kg，11.6moles).。向集管烧瓶添加21％的甲硫醇钠(5.8L，17.4moles，1.5当量)。在15-20℃(需要冷却以控制放热)下，用2小时添加到批料中。在TLC分析显示出完成之后，批料接着被搅拌1小时。下层的水相被放出，而产品(乙腈)相在用以在旋转蒸发器(20L)干燥的汽提之前，用6.7L 20％盐水洗涤。该粗产品接着由己烷(13.3L)回流冷却至0℃，而结晶。该结晶产品被过滤和用己烷(1L)洗涤。真空干燥得到附图2的化合物III(2.49kg，78％)，其熔点93℃，白色针状物。
向20L玻璃容器中，添加THF(8.25L)，接着添加化合物(III)(1.65kg，6.0moles)。将配料冷却至-40℃，并在小于-25℃(一般-45至-35℃)用1小时添加2.5M丁基锂(2.4L)。使其达到-25℃。在第二个容器中添加THF(4.1L)和碘乙酸对硝基苄基酯(1.92kg，6.02moles)，接着冷却至-10℃。接着在真空下使用套管，用30分钟将化合物(III)的溶液转移到第二个溶液，并保持温度＜0℃(一般＜-8℃)。在搅拌完成(在＜-5℃下两小时)之后，配料被冷却至-10℃，并添加到含20％盐水(16L)的50L容器中。下层的水相用二氯甲烷(13L)反萃取。然后将两个有机相合并，并汽提干燥得到附图2的粗品化合物(IV)(约3kg)。添加THF(约2L)，使产品储藏为约40％的溶液。
含约40％化合物IV(1292g，2.76moles)的THF溶液(3.54L)被汽提至KF＜0.1％，接着再溶解在新鲜的THF(KF＜0.05％)7.5L中。在＜-50℃，向其中添加5-叠氮基-2，2-二甲基戊酰氯(1.23kg，6.5moles，2.35当量)。在＜-65℃，滴加双(三甲基甲硅烷基)胺化锂20％(1.04M)的溶液(6000ml，6.24moles，2.25当量)。该混合物颜色变得很深，并使其在-70℃搅拌1小时。通过添加甲苯(12.5L)和10％HCl(12.5L)，使反应停止。接着连续用25％ KHCO3(12.5L)、水(12.5L)和饱和盐水(6L)连续洗涤有机相。然后将有机相浓缩，并蒸发，得到深色浓缩溶液(约30％产品)。
25kg气相法二氧化硅(flash silica)用约50L甲苯构成层析柱，加载源自上述反应的三批配料溶于20％的己烷甲苯溶液(20L)。在0.5巴压力下洗脱，将物料负载到柱上，并再循环，直至前级分开始显露(级分1)。少量的前级分被分离进该级分，并丢弃。接着洗脱以下级分；级分2-4甲苯(各25L)级分5-6甲苯中6％的乙酸乙酯(各25L)级分7-8甲苯中8％的乙酸乙酯(各25L)级分9-10甲苯中10％的乙酸乙酯(各25L)含产品的这些级分接着汽提成为附图2的化合物V(3.51kg，68％)的25L的13.5％的溶液。
化合物V的四氢呋喃溶液在旋转蒸发器上被汽提，直至成油状物(4.44kg，含3.2kg化合物V，5.15mol，包括一些THF)。该油状物再溶解于THF(10.75L)，以形成最终溶液(KF 0.0326％)。将其添加至100L容器中，接着添加乙酸(2.98L)和氟化四正丁基铵(5.36kg，17.13mol)和更多的THF(21.5L)。在加料期间，伴随着一些起泡。将该配料加热直至处于回流状态(65℃)，并接着保持接近于回流状态16小时。样品的TLC分析只显示微量的起始物料。在用15分钟时间，再一次起泡的情况下添加1M碳酸氢钾溶液(27L)使反应停止之前，添加甲苯(32L)，并将容器内容物冷却至20℃。
用1M碳酸氢钾溶液(2×27L)、10％盐水(4×11L)和20％盐水溶液(3L)对有机相进行洗涤。该洗涤过程确保了乙酸的彻底清除。
甲苯溶液被汽提至约5L体积，并贮藏在冷库中，同时制备第二批配料得到另外的4.2kg粗产品。
使用氮气(0.5巴)，通过干燥快速柱色谱法，将粗产物料提纯。
向30cm直径柱中装填甲苯(50L)中的气相法硅胶(ChrogelSilica I 254，25kg)浆液，得到沉淀之后的80cm深的床。将甲苯洗脱直至硅石部分干燥。源自上述的粗产品(8.5kg)溶解于甲苯(20L)中，并采用氮压填充到硅石上，并装载在柱上。该产品接着用下述溶剂混合物洗脱。
100％甲苯 50L甲苯∶乙酸乙酯(98∶2) 75L甲苯∶乙酸乙酯(95∶5) 25L甲苯∶乙酸乙酯(80∶20) 100L甲苯∶乙酸乙酯(70∶30) 50L甲苯∶乙酸乙酯(60∶40) 50L甲苯∶乙酸乙酯(60∶40)+0.5％异丙醇 50L对下述级分大小进行收集级分序号 级分体积1-7 25L8-12 5L13-2025L在20L的旋转蒸发器上进行真空浓缩，得到附图2的化合物VI，状如淡红桔油(通过TLC单点，4.004kg，7.88mol，76.5％)。
向2L烧瓶添加二氯甲烷(1.02L)和甲基二硫化物(398g，4.23mol)。接着加入自由基清除剂(3-叔丁基-4-羟基-5-甲基苯基硫醚1.85g，0.005mol)，并将配料冷却至-35℃。用2小时时间将氯气(296g，8.35mol)鼓入溶液中，得到甲基次磺酰氯橙色溶液。
在-25℃至-15℃，用25分钟将该溶液添加进20L含二氯甲烷(11.4L)和化合物VI(4.97kg的在二氯甲烷中38.2％的溶液，1.9kg活性，3.74mol)的烧瓶中。接着将配料在-25℃下搅拌20分钟。当反应完成时，通过TLC显示(没有起始物料)，配料在含亚硫酸氢钠(1.196kg)和碳酸氢钠(0.975kg)的水(23L)溶液的50L烧瓶中处理。进行相分离，水相用二氯甲烷(1.5kg，2L)反萃取。用饱和盐水溶液(6L)对合并的有机相洗涤，在20L旋转蒸发器上真空浓缩成油之前，用硫酸镁(1kg)干燥，产生附图2的化合物VII，状如粗制的红油(1.74kg，3.51mol，93.7％粗产率)，其溶于四氢呋喃(2.71kg)，并贮藏在-30℃用于下一步骤。
将化合物VII(1.028kg)在真空中浓缩得到粗制的油，其溶于四氢呋喃(9.5kg，10.6L，KF值＝0.02％)，并装在20L烧瓶中。将烧瓶接着冷却至＜-50℃，并用5分钟添加三乙胺(848g，1.168L)。该配料在-50℃搅拌1小时，用两小时加热至20℃，接着在20-25℃下搅拌另外的2小时。TLC显示反应完成(起始物料消失)。向50L烧瓶中添加甲苯(17.7L)，并且将反应混合物加入其中，接着用甲苯(3.55L)洗涤。在沉淀和分裂之后，有机相用10％的盐水溶液(3×12L)，接着用饱和的盐水溶液(3L)洗涤，使用硫酸钠(1kg)干燥，真空浓缩直至得到2L附图2的化合物VIII的甲苯溶液，得到的2L甲苯溶液用甲苯加至4.5kg。
在乙醚∶正戊烷(1.5∶1)中制备的硅胶60(1500g)浆液，装填至夹套柱(80mm，内径)，并通过乙二醇在-15℃的循环流动冷却。粗制的化合物VIII(22.5-25.0％ w/w，450g溶液，101.3-112.5g活性粗制混合物)被添加进硅胶，并用预冷却至-20℃的乙醚∶正戊烷(1.5∶1)洗脱。该产品用25L混合的溶剂和2L乙醚洗脱，收集1L的级分，并在-20℃真空浓缩，得到附图2的反式化合物VIII(一般46g)，其贮存在-20℃。
向10L烧瓶添加去离子水(750ml)，10％披钯炭(JohnsonMatthey，类型87L，60％水、55g潮湿固体、2.2g钯、0.0207mol，0.0211当量)和乙酸乙酯(1750ml)。该烧瓶通氮气15分钟，然后通氢气，且配料被冷却至＜0℃。采用彻底的剧烈搅拌(450 to 500rpm)。
将反式化合物VIII(45g，0.098mol)溶解于-30℃的乙酸乙酯(300ml)，得到最终的溶液温度是-5℃。将其添加至配料，并保持反应和柱头温度＜0℃。
配料被氢化至90分钟，保持稳定的氢气流。当有机层的HPLC分析显示出没有起始物料时，认为反应结束了。
通过C盐52l(50g，用去离子水和乙酸乙酯预洗涤)尽可能快地过滤，除去催化剂，保持温度小于0℃。用过的催化剂用预冷却的0℃的乙酸乙酯(100ml)和去离子水(2×100ml)洗涤。在静置之后，分离水相，保持在0℃，并用已经冷却至-20℃的正戊烷∶甲苯(3∶1)(225ml)洗涤。
含产品的水相通过1.6mm玻璃纤维纸(GF/A级)和聚醚砜膜(孔径0.2mm，PES级)以及玻璃纤维预过滤筒依次(GFP级)过滤，产生完全清澈的淡黄-琥珀色溶液。将200ml等分试样冷冻在-78℃的500ml烧瓶壁上。在冷冻干燥72小时之后，分离出(5R，6R，1′R)-3-(4氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1′-羟基乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(一般～50％，校正产率)，得到很多灰白色至淡黄色固体。
D.2 A，E的合成通过上述PFOB合成的简单调整，制备化合物A和E。
D.3(5R，6R，1′S)-3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1′-羟基乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氯杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸[YOB]的合成在500ml Schlenk烧瓶中装配有磁性搅拌器和回流冷凝器，所述冷凝器与充满氮气的气球连接，烧瓶中装有对-硝基苄基(3S，4R)-(3-(1’(R)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(14.13g，30.15mmol)[PFOB合成中的化合物IV]、乙酸(17.3ml，302mmol)和氟化四丁铵(23.2g，88.6mmol)在无水四氢呋喃中的溶液，回流12小时。硅胶TLC显示出几乎完全转化。该混合物用甲苯(2500ml)稀释，并随后用500ml的10％ KHCO3、10％NaCl(两次)和饱和NaCl洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤且对滤液真空浓缩得到非结晶的残渣(12g)。通过硅胶(440g，40-63mm)柱色谱法，用甲苯-乙酸乙酯(2∶1，3∶2，和1∶1)提纯，使用440ml级分得到对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(R)-羟基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯，是一种源自级分10-16的结晶产品(6.38g，60％)，熔点是77-79℃。
500ml Schlenk烧瓶中装配有磁性搅拌器、橡胶隔板和充满氮气的气球，将对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(R)-羟基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(6.35g，17.93mmol)、三苯基膦(9.4g，35.86mmol)和无水四氢呋喃(134ml)添加进来。向该混合物添加无水甲酸(2.03ml，53.79mmol)，在-10℃搅拌溶液，偶氮二羧酸二异丙酯(7.03ml，35.86mmol)在30分钟时间里被缓慢添加。10分钟之后形成沉淀物。将悬浮液在0℃搅拌另外的30分钟，并再于室温下搅拌90分钟，沉淀物被再溶解。由此得到深黄色溶液。反应混合物用甲苯(1500ml)稀释，并随后用1200ml的水、10％ KHCO3和10％ NaCl洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤且在真空中去除溶剂得到油状物。使用200ml甲苯-乙酸乙酯(9∶1)级分通过硅胶(205g，63-200mm)色谱法提纯。通过硅胶TLC(氯仿-乙酸乙酯4∶1)分析级分。由级分6-15收集对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-甲酰氧基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯，一种不纯的半结晶固体(10.01g)(6.85％＝100％)。
500ml圆底烧瓶中装配有磁性搅拌器，其中添加有粗制的对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-甲酰氧基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(10.01g，由17.93mmol的前体制备)和甲醇(180ml)。向该混合物添加1N HCl(17.9ml，17.9mmol)水溶液，且溶液在室温下搅拌过夜。硅胶薄层色谱显示出完全反应。反应混合物用甲苯(1600ml)稀释，且随后用冷水(1100ml)、10％ KHCO3(500ml)和10％ NaCl(500ml)洗涤溶液。有机层用硫酸镁干燥、过滤，而得到的溶液在真空中浓缩得到油状物。使用200ml级分和甲苯-乙酸乙酯(2∶1和1∶1)，通过硅胶柱色谱法提纯，由级分9-19得到对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-羟基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯，这是一种非结晶固体(3.77g，59％)。
向100ml带有磁性搅拌器和充满氮气气球的Schlenk烧瓶中，添加对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-羟基乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(3.72g，10.50mmol)和不含乙醇的无水二氯甲烷(23ml)。在-18℃，二氯甲烷中的氯甲酸对硝基苄酯(3.08g，14.28mmol)溶液被缓慢加入。在搅拌下，用20分钟向该混合物分小批添加固体N，N-二甲基氨基吡啶(1.74g，14.28mmol)。在-18℃搅拌四小时之后，硅胶薄层色谱显示出完全反应。反应混合物用二氯甲烷(230ml)稀释，且得到的溶液随后用(120ml)的1N HCl，饱和NaHCO3和10％ NaCl少量多次洗涤。HCl相用二氯甲烷(40ml)反萃取，提取的溶液用NaHCO3洗涤。将合并的提取溶液用硫酸镁干燥，过滤和在真空中去除溶剂，得到粗制的产品(5.24g)。使用170ml甲苯-乙酸乙酯(6∶1)级分，通过硅胶(170g，63-200mm)色谱法提纯，得到非结晶固体的对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-对硝基苄氧基羰基氧乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(4.80g，86％)。
向250ml带有磁性搅拌器、橡胶隔板和充满氮气气球的Schlenk烧瓶中，添加对硝基苄基(3S，4R)-(3-(l’(S)-对硝基苄氧基羰基氧乙基)-4-甲硫基-2-氧代氮杂环丁基)乙酸酯(1.00g，1.87mmol)和无水四氢呋喃(46ml)。在-78℃向该混合物添加5-叠氮基-2，2-二甲基-戊酰氯(0.37g，1.96mmol)，随后在-78℃，将1M的双(三甲基甲硅烷基胺化)锂的四氢呋喃溶液(3.74ml，3.74mmol)用15分钟时间添加。最初形成的桔黄色溶液转变成淡黄色。在另外的15分钟搅拌之后，硅胶薄层色谱显示反应完成。用甲苯(240ml)稀释反应混合物，用220ml的2N HCl和两次饱和NaCl洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤和将滤液真空浓缩，在高度真空中短时间的干燥之后，得到非结晶粗物料(1.38g)。用甲苯-乙酸乙酯(9∶1)，采用90ml级分通过硅胶柱色谱法(92g，63-200mm)提纯，得到对硝基苄基7-叠氮基-4，4-二甲基-2-[(3S，4R)-4-甲硫基-3-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-2-氧代-1-氮杂环丁基]-3-氧代-庚酸酯，在二氯甲烷两次蒸发和在高真空中烘干得到一种淡黄色非结晶固体(1.01g，79％)。
向250ml带有磁性搅拌器、橡胶隔板和充满氮气气球的Schlenk烧瓶中，添加对硝基苄基7-叠氮基-4，4-二甲基-2-[(3S，4R)-4-甲硫基-3-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-2-氧代-1-氮杂环丁基]-3-氧代-庚酸酯(0.97g，1.41mmol)和干的、无乙醇的二氯甲烷(56ml)。在-60℃通过插入到液面下的入口管向该混合物中导入氯气。在-50℃的10分钟之后，硅胶薄层色谱显示反应完成。将该冷却的溶液注入含NaHSO3(2.82g，无水)和碳酸钠(2.23g，无水)的水溶液中。将该混合物摇动4min，收集有机相，用少量的二氯甲烷提取水相。随后有机溶液用37ml的10％ NaCl洗涤两遍，并将有机溶液合并，用硫酸镁干燥。在真空浓缩之后，得到非结晶的固体(0.95g)。用甲苯-乙酸乙酯19∶1和4∶1，采用5ml级分，通过快速的硅胶柱色谱法(2.3g，63-200mm)提纯。由级分2-14，在溶剂真空蒸发和在高真空中残余物烘干得到对硝基苄基-7-叠氮基-2-[(3S，4R)-4-氯-3-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-2-氧代-1-氮杂环丁基]-4，4-二甲基-3-氧代-庚酸酯，一种淡黄色，非结晶固体(930mg，97％)。
向100ml带有磁性搅拌器、橡胶隔板和充满氮气气球的Schlenk烧瓶中，添加对硝基苄基7-叠氮基-2-[(3S，4R)-4-氯-3-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-2-氧代-1-氮杂环丁基]-4，4-二甲基-3-氧代-庚酸酯(910mg，1.35mmol)和无水四氢呋喃(27ml)。在-30℃，向该混合物中缓慢添加0.92M的无水叔丁醇中的叔丁醇钾溶液(1.54ml，1.42mmol)。该反应混合物在-30℃搅拌150分钟。薄层色谱显示转化完成。用乙酸乙酯(150ml)稀释该深黄色溶液，并静置5min，并接着用10％ NaCl(130ml)、10％ NaCl(65ml)和饱和NaCl(65ml)洗涤。收集有机层，并用硫酸镁干燥。在过滤和真空中对溶剂蒸发之后，在90min高真空干燥之后，得到黄色油状物(860mg)。用甲苯-乙酸丁酯(19∶1)，通过低温(-13℃)，硅胶(60g，5-20mm)中压柱色谱法进行提纯，收集各30ml的级分。该级分保持在-20℃。由级分11-13，得到纯的反式对硝基苄基(5R，6R)-3-[4-叠氮基-1，1-二甲基丁基]-6-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸酯(306mg，35％)，在高真空溶剂蒸发之后得到无色非结晶固体。由级分14-21类似地获得顺式-反式异构混合物。
在100ml两颈烧瓶中带有磁性搅拌器、橡胶隔板并连接至氢化装置，乙酸乙酯(13ml)和水(13ml)中的披钯木炭催化剂(10％，300mg)在0℃预氢化20分钟。在0℃搅拌下，将乙酸乙酯(10ml)中的对硝基苄基(5R，6R)-3-[4-叠氮基-1，1-二甲基丁基]-6-[(S)-1-对硝基苄氧基羰基氧乙基]-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸酯溶液用注射器添加进来。在50分钟0℃的搅拌之后，氢的消耗达到终点(90ml的氢被消耗掉)。通过过滤去除催化剂，用少量的乙酸乙酯和水洗涤，使冷却的两相混合物分离。用3ml的冷乙酸乙酯和水洗涤两次水相，而乙酸乙酯相用3ml水反萃取两次。残余的乙酸乙酯在0℃真空中，接着在高真空中从混合的水相去除，且体积在高真空中减少到13ml。溶液在-25℃被冷冻干燥3天，得到(5R，6R)-3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-[(S)-1-羟基乙基]-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(YOB)，大量的无色粉末(98mg，75％)。
E.用作药物的制剂如下制备药物制剂。
实施例1(方法A)乳糖中的高稳定(5R，6R，1′R)-3-(4-氨基-l，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸[PFOB]药物制剂。 将30ml乙酸乙酯中3.79g(8.25mmol)的对硝基苄基(5R，6R，1′R)-3-(4-叠氮基-l，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸酯溶液，在0℃通过橡胶隔板通过注射器加到在120ml乙酸乙酯和60ml水的中的3.1g的披钯炭(％)的预氢化混合物中。在0℃的70分钟的反应时间之后，已经消耗了840ml的氢(理论值740ml)。反应混合物通过10cm直径的G5玻璃过滤器过滤，残余物用30ml的冷水和30mol的冷乙酸乙酯洗涤，并由合并的滤液除去乙酸乙酯层。在0℃用50ml的冷却乙酸乙酯和50ml的冷却甲苯洗涤水层，且得到的水性胶体溶液使用注射器，加压通过膜过滤器，从而分离各层。水层在高真空中蒸发，以便于去除残存的有机溶剂。向该水溶液(89.8ml)添加溶于180ml水的含7.20g乳糖一水合物冷溶液，且将3ml的得到的溶液加入玻璃安瓿。内容物在无水冰-丙酮浴中冷冻，且在0.01mbar、-25℃的冷冻干燥机中冷冻干燥4天，将水分去除。得到的白粉在干燥器中，在0.001mbar和室温下用五氧化磷干燥过夜，每个安瓿中得到98.3mg的白色粉末。在水中262nm的紫外光谱显示每个安瓿中含有18.2mg的目标化合物和80.1mg的乳糖。该安瓿充满干燥的氮气，并密封或用干燥剂贮存。
药物组合物也可以如下制备实施例2(5R，6R，1′R)-3-(4-氨基-l，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(PFOB)。 按照C1部分提供的方法，在-25℃(没有乳糖)简单的冷冻干燥之后和在0.001mbar和室温下用五氧化磷干燥过夜之后，得到白色粉末状的纯的目标化合物。由此得到的该化合物适合于通过公知的方法或下述方法制备的药物给药。
实施例3药物制剂的制备新的奥沙培南化合物可以用于药物组合物。该奥沙培南化合物可以通过常规方法制成药物组合物/药剂，例如公开于EP 0 301394中的那些方法。其它制备药剂的方法包括下述通过将300mg的(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)-3-(4-氨基-l，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(PFOB，实施例1)的共冷冻干燥物和120mg的头孢克洛(Cefaclor)及5mg的硬脂酸镁混合，将425mg混合物添加到明胶No.3胶囊。从而制备一个单元剂量形式的药剂。类似的，如果共冷冻干燥物采用具有较高含量的奥沙培南-3-羧酸，同样可以制备其它剂形，并填充进No.3明胶胶囊；且混合超过425mg成分，还可以制备出较大的胶囊、片剂和丸剂。下述实施例是对药物制剂制备的举例说明。
表5(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)-625mg3-(4-氨基-l，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸共冷冻干燥物头孢克洛 250mg玉米淀粉V.S.P. 200mg磷酸二钙 60mg硬脂酸镁 60mg将共冷冻干燥物和其它活性成分(头孢克洛)用磷酸二钙和约一半的玉米淀粉混合，该混合物接着制粒并粗筛。在45℃干燥，并通过1.0mm宽度网眼的筛(16号筛)进行再筛分。剩下的玉米淀粉和硬脂酸镁被添加进来，并将该混合物压成各重1195mg，直径是1.27cm(0.5 in.)的片剂。肠胃外溶液安瓿1250mg(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)-3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2烯-2-羧酸共冷冻干燥物头孢他啶(ceftazidime)500mg无菌水(在使用之前，用注射器由各 5ml安瓿添加)眼科溶液(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)- 625mg3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2烯-2-羧酸共冷冻干燥物头孢他啶 250mg羟丙基甲基纤维素 15mg无菌水(在使用之前，用注射器由各 2ml安瓿添加)眼用溶液(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)- 250mg3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2烯-2-羧酸共冷冻干燥物头孢他啶 100mg苯扎氯铵 0.1mg无菌水(在使用之前，用注射器由各 2ml针药管添加)局部乳膏或软膏(4∶1)乳糖一水合物和(5R，6R，1′R)- 250mg3-(4-氨基-1，1-二甲基丁基)-6-(1’-羟乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2烯-2-羧酸共冷冻干燥物头孢他啶 100mg聚乙二醇4000 V.S.P. 800mg聚乙二醇400 V.S.P. 200mgYOB，A，B，D和E可以通过简单地代替上述制剂中的PFOB，以类似的实施例用作药物活性剂。
应该注意的是，在与其它试剂混合之前，活性奥沙培南(PFOB，YOB等)与载体(例如，乳糖)，不是必须进行共冷冻干燥，虽然共冷冻干燥能增强稳定性。
在上述制剂中的活性成分可以单独混合或与其它生物活性成分，例如林可霉素、青霉素、链霉素、新生霉素、庆大霉素、新霉素、粘菌素和卡那霉素一起混合，或与其它治疗剂例如丙磺舒混合。
应该理解说明书和实施例只是举例说明，并不是对本发明的限制，而在本发明实质范围内的其它实施方案对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
权利要求
1.一种奥沙培南化合物，该化合物是或能够形成式Ia或Ib的两性离子 其中R是C1-C8支链或直链烷基，其包括质子化碱性取代基。
2.根据权利要求1的奥沙培南化合物，其中所述质子化碱性取代基是质子化氮碱。
3.根据权利要求1或2的奥沙培南化合物，其中所述质子化碱性取代基是质子化胺或质子化氨基亚甲基氨基。
4.根据权利要求1、2或3的奥沙培南化合物，其是式Ia表示的化合物，其中R是-(CH2)4NH3+、-(CH2)3NH3+、-(CH2)2NH3+、-(CH2)2NHCHNH2+或-CH2NHCHNH2+。
5.根据权利要求1至4任一项所述的奥沙培南化合物，其是式Ia表示的化合物，其中R是-(CH2)3NH3+。
6.根据权利要求1、2或3的奥沙培南化合物，其是式Ib表示的化合物，其中R是-(CH2)3NH3+。
7.一种药物组合物，包括根据前述任一权利要求所述的药理有效量的奥沙培南化合物。
8.一种β-内酰胺酶抑制剂，其包含权利要求1至6任一项所述的奥沙培南化合物。
9.根据权利要求7的药物组合物，其还包含药物有效量的抗生素。
10.一种治疗感染的方法，包括对需要此治疗的病人给药药理有效量的式Ia或Ib的两性离子的步骤 其中R是C1-C8支链或直链烷基，其包括质子化碱性取代基。
11.根据权利要求10所述的治疗方法，其中式Ia表示的两性离子中，R是-(CH2)4NH3+、-(CH2)3NH3+、-(CH2)2NH3+、-(CH2)2NHCHNH2+或-CH2NHCHNH2+，或式Ib表示的两性离子中，R是-(CH2)3NH3+。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中还包括对病人给药药理有效量的抗生素的步骤。
13.式Ia或Ib的两性离子在制备用于治疗感染的药物中的用途 其中R是C1-C8支链或直链烷基，其包括质子化碱性取代基。
14.根据权利要求13的用途，其中式Ia表示的两性离子中，R是-(CH2)4NH3+、-(CH2)3NH3+、-(CH2)2NH3+、-(CH2)2NHCHNH2+或-CH2NHCHNH2+，或式Ib表示的两性离子中，R是-(CH2)3NH3+。
全文摘要
一种奥沙培南化合物，该化合物是或能够形成式Ia或Ib的两性离子(Ia)、(Ib)，其中R是C
文档编号A61K9/14GK1469744SQ0181762
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月11日 优先权日2000年10月19日
发明者H·R·普芬德, I·N·辛普森, H R 普芬德, 辛普森 申请人:阿姆拉有限公司