专利名称：白细胞介素－2及其基因在戒毒应用中的测试方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。具体涉及白细胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒应用中的测试方法。
背景技术：
毒品，不仅严重危害人类健康，全世界吸毒者有1乙多人口，给社会带来了一系列难以解决的问题。对危害世界人们身心健康的毒品，各国政府和科学家们正不遗余力地研究、开发解除毒品产生生理/心理反应的药物及方法，使吸毒者迅速达到脱毒、脱瘾的目的。但由于毒品引发的特殊的生理及心理反应，至今未能发现一种使吸毒者安全、有效、无依赖性地脱离毒品的“灵丹妙药”。现有的治疗方法存在着难以接受的副作用，而且它的应用也常常由于成瘾性而受限。而整个对药物依赖性研究的工作仍停留在“新的吗啡类化合物取代旧的吗啡类化合物”的怪圈中，“美沙酮递减法”被发达国家作为“标准治疗”，至今仍在使用。社会迫切需要一种本身无成瘾性、有较好控制戒断症状、且毒副作用小的药物。
免疫系统中的一种重要的淋巴因子-白细胞介素-2的镇痛作用和控制吗啡戒断症状作用的发现，可能为我们提供了一个重要的工具。我国刘新垣院士等首先发现IL-2具有镇痛作用。实验表明IL-2既有中枢镇痛作用又有外周镇痛作用，临床观察发现对止痛效果不佳的晚期癌症痛患者使用IL-2后具有很好的止痛作用。实验还发现IL-2的镇痛作用可能与阿片受体有关。在吗啡耐受及对吗啡不敏感的神经病理痛模型上，IL-2较吗啡具有更为显著的镇痛作用。由于吸毒者的免疫功能低下，IL-2有望一方面提高机体的免疫功能，一方面控制戒断症状。然而IL-2在机体内活性半衰期很短，必须大剂量连续用药，医药费用高及长期注射的麻烦，从而影响了治疗效果及这一药物的广泛应用。基因治疗为解决这一问题带来了新的希望，它是一种通过基因转移的方法，将具有表达目的基因的载体导入到相关的细胞和组织中，使转录和翻译产物发挥治疗作用的方法。目前用于基因治疗的基因载体有病毒载体和非病毒载体。脂质体属于后者，它介导的转基因安全性好，可用于在体(in vivo)基因治疗；病毒载体稳定性好，转基因效率高，可转染分裂或不分裂细胞；腺病毒进入细胞核后，以附加体(episome)的形式存在，不发生整合，因此没有逆转录病毒载体潜在的致癌、致突变性，安全性较好，这些特点决定了腺病毒非常适合于神经系统的在体基因治疗。当腺病毒载体注入蛛网膜下腔后，腺病毒进入软脊膜和蛛网膜内增殖，基因表达产物以“旁分泌模式”作用于脊髓和感觉神经根，可在脊髓水平对神经进行调控，这种基因治疗方式通过腰穿即可完成，所以有希望应用于门诊患者的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于设计IL-2基因在戒毒应用中的测试方法，从而能采用IL-2蛋白、pcDNA3质粒-脂质体或腺病毒载体介导IL-2基因转移至蛛网膜下腔，达到控制吗啡戒断症状，使IL-2的戒毒功能达到临床应用的目的。
本发明提供了一种白细胞介素-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，该方法包括下列步骤(1)真核表达质粒pcDNA3-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pcDNA3载体(Invitrogen)。IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化。通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度，注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸缓冲液(PB)中；(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pCA13载体(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此时IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10(Microbix)共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒，扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的PBS中；(3)吗啡依赖(成瘾)小鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型(此组小鼠为吗啡依赖组)。吗啡依赖小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组小鼠为吗啡戒断组；(4)吗啡依赖大鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖大鼠模型(此组大鼠为吗啡依赖组)。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组大鼠为吗啡戒断组；(5)IL-2蛋白及pcDNA3质粒介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾小鼠模型，在末次给吗啡3小时后将成瘾的小鼠随机分为8组，每组10只。蛋白治疗组经第5与第6腰椎之间(蛛网膜下腔)分别注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的0.01M磷酸缓冲液(PB)。IL-2基因治疗组8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(对照组，提前24小时注射)，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治疗组，提前24小时注射)。注射总体积为10μl。注射后5分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾大鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的大鼠随机分为4组，每组5-11只，经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内(蛛网膜下腔)分别注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的PB，注射总体积为30μl。注射后5分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值；(7)腺病毒载体介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立大鼠经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内(蛛网膜下腔)分别注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射总体积为10μl。注射后一周测定腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发的戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(8)成瘾性试验a.小鼠竖尾试验小鼠随机分为六组，每组10只，分别腹腔注射吗啡20mg.kg-1(阳性对照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(阴性对照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛网膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。观察给药后2小时内小鼠有无出现S形竖尾反应；b.小鼠跳跃反应试验小鼠随机分为三组，每组10只，分别皮下注射含5％葡萄糖的PB(阴性对照组)或吗啡(阳性对照组)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。吗啡组小鼠起始剂量为2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1剂量递增；IL-2蛋白组剂量为1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次给药后2小时，腹腔注射纳洛酮10mg.kg-1，观察10分钟内小鼠跳跃反应次数；(9)统计方法采用单因素方差分析。
本发明的方法研究结果(1)蛛网膜下腔注射IL-2蛋白抑制小鼠吗啡戒断症状蛛网膜下腔注射IL-2蛋白(1×104IU)可明显延长小鼠开始跳跃的潜伏期(p＜0.01)，并明显抑制小鼠出现的跳跃次数(p＜0.01)，其效果呈剂量依赖性；IL-2蛋白(2×104IU)可明显抑制小鼠的体重减少(p＜0.05)(图1，A、B、C)。
(2)蛛网膜下腔注射IL-2基因(pcDNA3-IL-2)抑制小鼠吗啡戒断症状8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine可明显抑制小鼠的体重变化(p＜0.05)，并可延长小鼠开始跳跃的潜伏期(p＜0.01)和抑制小鼠出现的跳跃次数(p＜0.01)(图1，A、B、C)。
(3)蛛网膜下腔注射IL-2蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状蛛网膜下腔注射IL-2蛋白可明显抑制大鼠的戒断症状总分值(p＜0.05)，包括异常姿势、激惹、腹泻、流涎、体重减少；对湿狗样抖动、咬牙的评分值有减少的倾向，但无统计意义。总的结果表明，IL-2蛋白也可明显抑制大鼠大部分的吗啡戒断症状。
(4)IL-2蛋白无成瘾性a.小鼠竖尾试验吗啡组小鼠均出现S形竖尾反应，兴奋跑动，而IL-2蛋白组小鼠无竖尾反应，活动正常。
b.小鼠跳跃反应试验IL-2蛋白组(0.9±0.5)与对照组(0.4±0.3)比较相近，与吗啡组(14.1±1.6)比较则有非常显著的差异(p＜0.01)。
表1.蛛网膜下腔注射IL-2蛋白对大鼠吗啡戒断症状的影响形成吗啡依赖大鼠模型后，经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内(蛛网膜下腔)分别注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，对照组(vehicle)为含5％葡萄糖的PB，注射总体积为30μl。注射后5分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值。统计学意义定为*P＜0.05(与vehicle比较)。
表1IL-2剂量 2.0×104IU4.0×104IU 1.4×105IUvehicle动物数5 5 5 11运动性症候分值湿狗样抖动 1.60±0.75 0.80±0.49 0±0 1.27±0.49异常姿势6.40±1.60 6.80±0.49 5.6±0.75*8.00±0流涎1.20±0.49 0±0*0.4±0.4*1.82±0.12咬牙0.20±0.20 0.10±0.10 0.0±0 0.27±0.10非运动性症候分值腹泻5.60±0.98 3.20±1.50*2.4±1.6*7.27±0.49激惹1.60±1.60 0.8±0.49*0.4±0.4*3.54±0.68体重减少10.00±1.58 6.00±1.00*7.00±1.22*11.82±1.02总评分值26.60±3.01*17.70±1.74*15.8±3.43*33.95±1.06表2.小鼠注射7次IL-2蛋白(腹腔)或吗啡(皮下)后，腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发的小鼠跳跃小鼠分别皮下注射含5％葡萄糖的PB(阴性对照组)或吗啡(阳性对照组)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。吗啡组小鼠起始剂量为2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1剂量递增；IL-2蛋白组剂量为1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105及6.4×105IU。于最后一次给药后2小时，腹腔注射纳洛酮10mg.kg-1，观察10分钟内小鼠跳跃反应次数。统计学意义定为*P＜0.05(与吗啡组比较)。
表2药物及给药途径 跳跃次数(跳跃的小鼠/总数)
含5％葡萄糖的PB(皮下注射)0.4±0.3*(2/10)吗啡(皮下注射) 14.1±1.6(10/10)IL-2蛋白(腹腔注射) 0.9±0.5*(3/10)
图1(A、B、C)蛛网膜下腔注射IL-2蛋白及pcDNA3-IL-2基因对小鼠吗啡戒断症状的影响形成吗啡依赖小鼠模型后，经第5与第6腰椎之间(蛛网膜下腔)分别注射5×103、1×104，2×104、4×104、8×104IU IL-2蛋白，对照组(vehicle)为含5％葡萄糖的PB，n＝9-18；基因治疗组为8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(提前24小时注射)，其对照组为8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(提前24小时注射)，n＝10。注射总体积为10μl。注射后5分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，分别统计各组小鼠开始跳跃的潜伏期(秒)(图1A)及15分钟内小鼠出现的跳跃次数(图1B)及30分钟内小鼠体重变化(克)(图1C)，图中横坐标为蛛网膜下腔注射的IL-2浓度，纵坐标分别为潜伏期(秒)(图1A)、跳跃次数(图1B)和体重变化(克)(图1C)，统计学意义定为*P＜0.05，**P＜0.01(与vehicle比较)；#P＜0.05，##P＜0.01(与8μg pcDNA3/8μg lipofectamine比较)。
注1.对照组(vehicle)2.5×103IU IL-2蛋白3.1×104IU IL-2蛋白4.2×104IU IL-2蛋白5.4×104IU IL-2蛋白6.8×104IU IL-2蛋白7.8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine8.8μg pcDNA3/8μg lipofectamine通过本发明的测试方法结果表明蛛网膜下腔注射IL-2蛋白具有较好的戒毒作用，其效果呈剂量依赖性。其特点是本身没有成瘾性，且能同时增强机体的免疫功能，这对免疫力低下的吸毒者来说是很有益的，不成瘾，又能增强免疫功能，乃目前任何治疗方法所无法做到的。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，其效果比高剂量IL-2蛋白差，可能是由于IL-2蛋白的瞬时分泌量较低。但另一方面，由于pcDNA3-IL-2表达IL-2蛋白可持续6天(比注射的IL-2蛋白的半衰期延长约300倍)，对整个戒毒过程来说是很方便、经济的。通过对pcDNA3-IL-2基因导入条件的进一步优化，其戒毒效果可望更好，更适合实际应用。
具体实施例方式(1)真核表达质粒pcDNA3-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pcDNA3载体(Invitrogen)。IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化。通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度。注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸缓冲液(PB)中。
(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pCA13载体(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此时IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10(Microbix)共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒。扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的PBS中。
(3)吗啡依赖小鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型(此组小鼠为吗啡依赖组)。吗啡依赖小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组小鼠为吗啡戒断组。
(4)吗啡依赖大鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖大鼠模型(此组大鼠为吗啡依赖组)。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组大鼠为吗啡戒断组。
(5)IL-2蛋白及pcDNA3质粒介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾小鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的小鼠随机分为8组，每组10只。蛋白治疗组经第5与第6腰椎之间(蛛网膜下腔)分别注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的0.01M磷酸缓冲液(PB)。IL-2基因治疗组8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(对照组，提前24小时注射)，8μgpcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治疗组，提前24小时注射)。注射总体积为10μl。注射后5分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化。
(6)IL-2蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾大鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的大鼠随机分为4组，每组5-11只，经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内(蛛网膜下腔)分别注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的PB，注射总体积为30μl。注射后5分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值。
(7)腺病毒载体介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立大鼠经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内(蛛网膜下腔)分别注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射总体积为10μl.注射后一周测定腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发的戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化。
(8)成瘾性试验a.小鼠竖尾试验小鼠随机分为六组，每组10只，分别腹腔注射吗啡20mg.kg-1(阳性对照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(阴性对照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛网膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。观察给药后2小时内小鼠有无出现S形竖尾反应。
b.小鼠跳跃反应试验小鼠随机分为三组，每组10只，分别皮下注射含5％葡萄糖的PB(阴性对照组)或吗啡(阳性对照组)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。吗啡组小鼠起始剂量为2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1剂量递增；IL-2蛋白组剂量为1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次给药后2小时，腹腔注射纳洛酮10mg.kg-1，观察10分钟内小鼠跳跃反应次数。
(9)统计方法采用单因素方差分析。
权利要求
1.白细胞介素-2 IL-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)真核表达质粒pcDNA3-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入经相同酶切的pcDNA3载体Invitrogen，IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化，通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度，注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸缓冲液中；(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建人IL-2基因经EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接头的全长含信号肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入经相同酶切的pCA13载体Microbix，得到pCA13-IL-2，此时IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10 Microbix共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒，扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的PBS中；(3)吗啡依赖小鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型，此组小鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组小鼠为吗啡戒断组；(4)吗啡依赖大鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖大鼠模型，此组大鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组大鼠为吗啡戒断组；(5)IL-2蛋白及pcDNA3质粒介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾小鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的小鼠随机分为8组，每组10只，蛋白治疗组经第5与第6腰椎之间，蛛网膜下腔， 分别注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的0.01M磷酸缓冲液，IL-2基因治疗组8μg pcDNA3/8μg lipofectamine，对照组，提前24小时注射，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine，基因治疗组，提前24小时注射，注射总体积为10μl，注射后5分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾大鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的大鼠随机分为4组，每组5-11只，经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的PB，注射总体积为30μl，注射后5分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值；(7)腺病毒载体介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立大鼠经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2。注射总体积为10μl。注射后一周测定腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发的戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(8)成瘾性试验a.小鼠竖尾试验小鼠随机分为六组，每组10只，分别腹腔注射吗啡20mg.kg-1阳性对照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB阴性对照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛网膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，观察给药后2小时内小鼠有无出现S形竖尾反应；b.小鼠跳跃反应试验小鼠随机分为三组，每组10只，分别皮下注射含5％葡萄糖的PB阴性对照组或吗啡阳性对照组，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，吗啡组小鼠起始剂量为2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1剂量递增；IL-2蛋白组剂量为1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and 6.4×105IU，于最后一次给药后2小时，腹腔注射纳洛酮10mg.kg-1，观察10分钟内小鼠跳跃反应次数；(9)统计方法采用单因素方差分析。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于其中采用的给药途径为蛛网膜下腔给药。
3.根据权利要求1所述的白细胞介素-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于IL-2及pcDNA3-IL-2或Ad5-IL-2在蛛网膜下腔表达的IL-2蛋白质产物。
4.根据权利要求1所述的白细胞介素-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于其中所述的成瘾类型为阿片类物质成瘾。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域。本发明公开了一种白细胞介素－2(IL－2)及其基因在戒毒应用中的测试方法。通过本发明的方法表明蛛网膜下腔注射IL－2蛋白有较好的戒毒作用，其效果呈剂量依赖性。pcDNA3－IL－2基因也有一定的戒毒作用，通过对该基因导入条件的进一步优化，其戒毒效果可望更好，更适合实际实用。
文档编号A61K48/00GK1508265SQ02155058
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月20日 优先权日2002年12月20日
发明者刘新恒, 顾锦法, 王晋慧, 姚明忠 申请人:中国科学院上海生命科学研究院