专利名称：从软骨鱼类分离的蛋白多糖及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种从软骨鱼类分离的蛋白多糖及其制造方法。具体地说，涉及一种维持健康、提高生活质量而且在医药领域有用的蛋白多糖及其制造方法。
背景技术：
癌是苦恼人类的共同的疾病，其治疗正在成为全世界的课题。在日本，主要的死亡原因正在从感染性疾病向生活习惯关联性疾病移行，特别是癌已经成为日本人死亡原因的第1位，作为疾病对策上的最重要课题，研究正在进行之中。癌能够在所有的脏器、组织中发生，所以因体质、性别、年龄、地域和生活习惯不同而异。另外，以转移或增殖能力为主的所有的性质根据癌的种类而不同，所以至今还没有确立具有决定性的治疗方法。
癌细胞的特征是伴随血管新生来确保营养成分，进行无规则的自主性增殖、通过转移和浸润在身体的各部位产生新的癌组织。在此基础上，癌性恶液质会导致宿主衰弱至死。作为目前正在进行的癌的治疗方法，有切除或使用抗癌药、免疫疗法、温热疗法、放射线照射等，而疗效因癌的种类而不同，或者因原发灶部位而不能利用，进而宿主在副作用的作用下变得衰弱。因此，抑制固体癌中共通的血管新生或转移、浸润的治疗方法正受到注意(Folkman J.，Nat.Med.127-31，1995)。
已知在癌细胞转移或浸润、血管新生时，为了破坏包围细胞的细胞外基质或基底膜，主要使用Matrix Metallo Protease(MMP)。以上述为基础，作为目前癌治疗的新目标，使用通过阻碍MMP来阻碍癌的转移、浸润和血管新生以抑制癌的进展的方法，还开发有各种合成的MMP抑制剂(IkiK.等、Carcinogenesis，1999 Jul；20(7)1323-9、RasmussenA.H.等、International Business Communications(1997)、Naito K.等、Int J Cancer1994 Sep 1；58(5)730-5)。但是，作为副作用，报道有骨髓毒性、细胞毒性、关节痛，在实用中存在问题。
另一方面，作为相对于天然物的最近的趋势，在中药或食品中发现有在各种疾病的预防、进展中有效的成分，其中的一部分被厚生劳动省确认作为特定保健用食品而显示出有效。即使在癌治疗中，来源于食品的成分也被关注，各种食品中的成分的抑癌效果正在研究中。其中，由于没有在软骨组织中形成血管，所以认为在软骨组织中含有血管新生抑制活性物质。事实上，在将软骨提取物注入到肿瘤的周边的实验中，可见抑制肿瘤的增殖或血管新生(Lee A.等、Science 1983Sep 16；221(4616)1185-7)。作为鲨鱼软骨的血管新生抑制功能之一，可以举出MMP的抑制，有报道在活体外(in vitro)可见MMP的抑制(Moses，M.A.等、J.Cell.Biochem.47230-235，1991；Gingras D.等、Anticancer.Res.200119(1-2)83-6)，另外，即使在向动物经口投放的实验中亦可见血管新生的抑制(Davis PF.等、Microvasc Res 1997 Sep；54(2)178-82)。以这些观点为基础，鲨鱼是软骨鱼类，可以比硬骨动物更多地采集品质良好的软骨，所以鲨鱼软骨粉有希望推迟或抑制癌的进展，癌患者经口使用的替代疗法和临床研究正在进行中(Ernst E.、Lancet 351298 1998)。但是，通过鲨鱼软骨的经口摄取的体内的鲨鱼软骨的肿瘤抑制效果的构造几乎不清楚，另外，也未能得出通过鲨鱼软骨的经口摄取而鲨鱼软骨在组织中抑制MMP的观点。
作为从鲨鱼软骨得到有效成分的方法，已知有使鲨鱼软骨成为微粉末状而直接用作有效成分的方法(特开2001-48795号公报)或者粉碎鲨鱼的软骨而进行水提取得到的冻结干燥物的制造方法(特表平9-512563号公报，美国专利第4473551号说明书)。
发明内容
但是，为了取得效果，在上述方法中得到的来源于鲨鱼软骨的成分必须通过过量摄取或者通过与其它有效成分并用，才能发挥抗肿瘤活性或抗炎症活性，其效果的作用机制尚没有得到证明。
因此，本发明的目的在于，提供一种少量摄取即能发挥效果而且效果的作用机制明确的软骨提取物和其制造方法。
本发明人等为了达到上述目的，对有效地从软骨提取有效成分的条件和有效成分的特性进行了潜心研究，结果发现通过满足下述条件的成分和其制造方法可以达到需要的目的，以至完成本发明。
即，本发明的分离的蛋白多糖的特征在于，来源于软骨鱼类的软骨的水提取物且主成分的分子量为500kDa以上。
上述蛋白多糖优选不溶于醇。
上述蛋白多糖优选葡糖氨基葡聚糖部分以硫酸软骨素(chondroitinsulfate)C为主成分。
上述蛋白多糖优选相对于Matrix Metallo Protease具有抑制活性。
在上述Matrix Metallo Protease为MMP-9的情况下，上述抑制活性优选是使已摄取0.4重量％添加饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性的减少得到恢复的作用，或者使已摄取0.4重量％添加饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。
上述蛋白多糖优选通过有效量的生体内摄取而具有使相对于组织蛋白酶B的抑制活性上升的作用。
上述蛋白多糖优选通过有效量的生体内摄取而具有使血清中的结合珠蛋白量增大的活性。
本发明的组合物的特征在于，含有上述蛋白多糖。
上述组合物优选用于提高生活质量。
本发明的药物组合物的特征在于，含有上述蛋白多糖作为有效成分。
本发明的蛋白多糖的制造方法的特征在于，包括将来源于软骨鱼类的软骨粉碎为平均粒径在100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水来提取水溶性成分的工序、分离含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。
图1是表示在实施例1中得到的鲨鱼软骨水提取物的组成的图。
图2是表示利用实施例1的凝胶过滤HPLC得到的MMP-9抑制活性区域的氨基酸组成图。
图3是表示在实施例1中得到的鲨鱼软骨水提取物的MMP-2和MMP-9抑制活性的图。
图4是表示通过等电点电泳的各区域的pH与MMP-9抑制活性的相关的图。
图5是表示凝胶过滤(Superdex(注册商标)75)的流程图。
图6是表示检测通过凝胶过滤(Superdex(注册商标)75)的各区域的MMP-9抑制活性的电泳图。
图7是表示醋酸纤维素膜电泳的结果的图。
图8是表示凝胶过滤(Superdex(注册商标)200)的流程图。图8B是表示Superdex(注册商标)200的洗脱时间与分子量之间的关系的图。图8C是表示通过Superdex(注册商标)200的各区域的MMP-9抑制活性的图。
图9是表示比较本发明品与硫酸软骨素C和市售鲨鱼软骨的MMP-9抑制活性的图。表示向10μl的活性型MMP-9中加入样品水溶液5μl而在37℃下反应24小时时的MMP-9的残存活性。
图10是表示在实施例1中的化学致癌仓鼠的抑癌效果的图。表示用基础食或实验食饲育50天时的肿瘤数量。★p＜0.05。
图11是表示在实施例3中的胰癌患者的血清中的MMP-9抑制活性的图。
图12是表示对在实施例3中的胰癌患者的血清中的IV型胶原片段进行定量的结果的图。
具体实施例方式
本发明的分离的蛋白多糖来源于软骨鱼类的软骨的水提取物，主要成分的分子量500kDa以上。
对成为上述蛋白多糖的原料的软骨鱼类没有特别限定，可以包括板鳃类和全头类，例如作为板鳃类，可以举出鲨鱼、魟鱼等，作为全头类可以举出银鲛等。
在本发明中作为原料的软骨只要来源于上述软骨鱼类，就没有特别限定，可以使用。
“主成分”是指利用凝胶过滤亲和层析在具有500kDa以上的分子量的区域中产生主要峰值。
因而，“500kDa以上的分子量”是指通过凝胶过滤亲和层析估计的分子量，具体地说是使用Superdex(注册商标)200进行测量的500kDa直到排除极限1300kDa为止的分子量。
本发明的蛋白多糖优选不溶于醇。作为上述醇，优选甲醇、乙醇、异丙醇等低级醇。
即，本发明的蛋白多糖优选为如上所述的高分子化合物，对醇为不溶性。
在这里，蛋白多糖是指葡糖氨基葡聚糖与蛋白质的共价结合化合物。上述葡糖氨基葡聚糖部分优选以硫酸软骨素C为主成分。上述蛋白质部分优选具有如在后述的实施例1和图2中记载的氨基酸组成。
本发明的蛋白多糖优选相对于Matrix Metallo Protease(MMP)具有抑制活性。该蛋白多糖优选具有通过有效量的生体内摄取使相对于MatrixMetallo Protease(MMP)的抑制活性上升的作用。
作为MMP，只要来源于动物就没有特别限定，作为上述动物，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类，鸡、兔、牛、羊、猪、马等家畜类或人等。作为MMP的种类，可以举出MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-12、MMP-13等诱导型MMP，MMP-2、MMP-14等常在型MMP，从涉及肿瘤的血管新生的观点出发，优选作为对构成衬托血管的基底膜的IV型胶原或V型胶原的明胶酶组进行分解的MMP-2或MMP-9。
在本发明中，“有效量”是指在动物活体内足以发挥MMP抑制活性的上升作用、组织蛋白酶B抑制活性的上升作用或血清中的结合珠蛋白量的增大活性的量，根据动物的种类、年龄、性别、体重等个体差别而不同，为了使仓鼠体内的MMP抑制活性上升，例示每天1～50mg左右。为了使人体内的MMP抑制活性上升，例示每天1～15g左右。
当上述MMP为MMP-9时，MMP-9的抑制活性的增加优选是使摄取了已添加0.4％重量的蛋白多糖的饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性的减少得到恢复的作用，或者使摄取了已添加0.4％重量的蛋白多糖的饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。上述MMP-9的抑制活性的增加更优选为20％以上。这样，可以有效地抑制癌的成长或转移。
血清中的MMP-9的抑制能力可以由本发明人等预先测量，在规定量的V型胶原和MMP-9中混合血清并用SDS-PAGE和Western印迹进行分析之后，利用光密度分析法(densitometry)对V型胶原的量进行定量，由此可以来测量。将MMP-9的活性定义为将在37℃下且24小时的反应下使V型胶原分解10％的活性作为1mU。因而，可以将血清中的MMP-9的抑制活性定义为将抑制1mU的MMP-9的活性的活性作为1mU。
本发明的蛋白多糖优选具有通过有效量的生体内摄取而使相对于组织蛋白酶B的抑制活性上升的作用。可以通过相对于组织蛋白酶B的抑制作用，发挥抗癌作用。作为组织蛋白酶B的种类，可以举出与上述MMP相同的动物种来源。
组织蛋白酶B的抑制活性可以使用生体内摄取的动物的血清并按照Methods of Enzymology 1981；80卷、p.535-561中记载的方法测量。上述活性以与本发明的蛋白多糖摄取前的血清相比而在摄取后的血清中显著增大作为指标。
另外，本发明的蛋白多糖优选通过有效量的生体内摄取具有使血清中的结合珠蛋白量增大的活性。通过使血清中的结合珠蛋白量增大，可以通过相对于上述组织蛋白酶B的抑制作用发挥抗癌作用。作为结合珠蛋白的种类，可以举出与上述MMP相同的源自于动物种的结合珠蛋白。
血清中的结合珠蛋白量是通过将生体内摄取的动物的血清提供到SDS-PAGE进行染色并利用光密度计(densitometer)进行定量。上述活性以与本发明的蛋白多糖摄取前的血清相比，在摄取后的血清中显著增大作为指标。
本发明提供含有上述蛋白多糖的组合物。本组合物中含有的蛋白多糖的比例可以根据目的适宜设定，通常为0.001～99.9重量％。
本组合物中含有的其它成分可以根据目的适宜选择。例如，当组合物为食品时，可以在通常的食品的原材料中混合一定量本发明的蛋白多糖作为食品。另外，在组合物为辅助食品(即补充品)时，可以根据需要使本发明的蛋白多糖与淀粉等增添剂、葡萄糖、砂糖、糖浆等甜味料，香料或水等混合，成为易于食用的形状例如片剂、胶囊、液体。在上述组合物中也可以含有来源于软骨鱼类的软骨的任意成分，例如软骨粉碎物(含有匀浆)本身、来源于软骨水提取物的其它成分(分子量不到500kDa的蛋白多糖、硫酸软骨素、透明质酸、胶原、矿物质等)，或蜂王浆、牡蛎提取物、维生素类、氨基葡萄糖、壳多糖壳聚糖、酵母等不是来源于软骨鱼类的软骨的成分而对健康有好处的成分。
上述组合物由于含有通过生体内摄取而发挥特定功能的蛋白多糖，所以优选用于提高包括维持、提高健康状态或者改善不健康的状态(包括罹患疾病的状态)的生活质量。
本发明提供一种含有上述蛋白多糖作为有效成分的药物组合物。成为本发明的药物组合物的对象的疾病是，伴随血管新生或脉管形成的疾病，例如可以举出癌的生长、癌的转移、慢性风湿性关节炎等关节炎、糖尿病性视网膜病、血管新生青光眼、干癣和伴随血管构成成分的炎症疾病，但不限于这些。
本发明的药物组合物可以为上述蛋白多糖本身，也可以与自身公知的药学中可以使用的载体(包括赋形剂、增添剂、结合剂、润滑剂等)或常用的添加剂等混合而调制。该药物组合物可以根据调制的形态(片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、糖浆剂等经口给药剂或注射剂，点滴剂、外用剂、栓剂等非经口给药剂)等经口给药或非经口给药。另外，给药量根据有效成分的含量、给药途经、给药对象或患者的年龄、体重、症状等而不同，不能一概而论，通常作为1天的给药用量，可以1天1～数次给药数mg～20g左右。
本发明提供上述蛋白多糖的制造方法。该制造方法的特征在于，包括将来源于软骨鱼类的软骨粉碎成平均粒径为100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水来提取水溶性成分的工序、
分离含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。
下面对包括上述工序的本发明的制造工序进行说明。
(1)原料及其前处理成为原料的软骨只要来源于上述软骨鱼类就没有特别限定，可以使用。最好预先除去附着在软骨周围的肉、皮等没有用的部分。对软骨的部位没有特别限定，可以举出中骨、鳍、头部软骨等。软骨可以使用生软骨、干燥软骨和它们的冷冻品中的任意1种，而从易于供应原料的观点出发，优选干燥软骨或其冷冻品。软骨的干燥可以通过晒干或利用60℃左右的干燥机。
(2)将软骨粉碎成平均粒径为100μm以下的粉碎物的工序为了有效地进行下述提取工序，粉碎上述软骨。作为粉碎方法，可以举出干式粉碎或湿式粉碎。干式粉碎可以使用干燥软骨或其冷冻品进行。湿式粉碎可以单独使用生软骨进行或在生软骨或干燥软骨中添加水进行。从控制粉碎物粒径的容易度出发，优选干式粉碎。
作为用于干式粉碎的装置，可以举出冷冻粉碎机、喷射研磨机等。
作为用于湿式粉碎的装置，可以举出匀浆器、湿式介质研磨剂等。
粉碎物的平均粒径为0.1～100μm，优选为1～50μm。如果不到0.1μm，则生产效率有降低的趋势，如果超过100μm，则提取效率有降低的趋势。
在这里，平均粒径是指体积与体积基准分布为中央值(相对于累积分布的50％的粒径)的颗粒相同的球的直径，可以通过激光衍射法、离心沉淀法等粒度分布测量装置进行测量。
为了提高生产效率，可以在预先粗粉碎软骨之后，进行上述粉碎。对粗粉碎的方法和装置没有特别限定，例如可以使用锤击式粉碎机等粗粉碎机进行。只要将粉碎物的平均粒径粗粉碎为0.5～10mm左右即可。
(3)向上述粉碎物中添加水来提取水溶性成分的工序向上述粉碎物中添加水。对添加的水没有特别限定，可以举出自来水离子交换水或蒸馏水等。对水的温度也没有特别限定，另外，对水的pH也没有特别限定，可以不用特别调整pH而使用。
水的添加量通常相对于粉碎物的重量为1～10倍的量。
提取条件是一边搅拌粉碎物和水，一边通常进行1分～24小时左右。如果不到1分钟则不能进行充分提取，如果为24小时以上则生产效率有降低的趋势。另外，提取次数可以为1次、也可以为多次，但为了使得到的水相的容量在一定的范围内，可以设定水的添加量和提取次数。
(4)分离含有上述已提取的水溶性成分的水相的工序提取工序结束之后，从悬浊提取液中分离含有已提取的水溶性成分的水相。分离方法也可以进行通常的固液分离。例如，可以举出离心分离、过滤、倾析(decantation)等。
(4’)浓缩工序可以根据需要浓缩在工序(4)中得到的水相。对浓缩方法没有特别限定，可以举出加热浓缩、冻结浓缩、利用超滤膜的浓缩等。浓缩的程度可以根据得到的水相的容量适宜设定，但通常浓缩至原来的容量的75％以下。
(5)在上述水相中添加醇得到沉淀物的工序向在工序(4)或(4’)中得到的水相中添加醇，使不溶于醇的成分析出，得到沉淀物。
添加的醇可以举出甲醇、乙醇、异丙醇，而在食品用途中优选使用乙醇。醇的添加量只要添加到可以目视到不溶成分析出的程度即可，而通常相对于水1为1～3倍容量。对析出条件没有特别限定，只要在0～60℃下静置1分钟～24小时左右即可。
(6)回收沉淀物的工序通过离心分离、过滤等回收在工序(5)中得到的沉淀物。为了除去醇和水分，最好使回收的沉淀物干燥。干燥方法可以举出风干或冻结干燥等。
(7)对沉淀物进行制粒的工序为了使得到的沉淀物的保存性和处理性更好，最好进一步除去水分而粉末化。干燥水分值只要为容易保存的程度即可。进而，也可以根据用途进行粉碎、造粒等。
(8)分取分子量为500kDa以上的区域的工序在工序(6)中回收的沉淀物实际上由本发明的蛋白多糖构成。可以根据用途利用凝胶过滤进一步纯化工序(6)的沉淀物。纯化方法可以通过使用分取用凝胶过滤亲和层析(例如Superdex(注册商标)200)分取500kDa以上的区域而进行。另外，也可以通过在浓缩工序中进行去除量为500kDa以上的膜滤过，来代替工序(8)。
(9)通过等电点电泳分取pI为5.5以下的区域的工序在工序(6)中回收的沉淀物或在工序(8)中纯化的纯化物，实际上由本发明的蛋白多糖构成。根据用途不同，可以通过等电点电泳进一步纯化工序(6)的沉淀物或工序(8)的纯化物。纯化方法可以通过使用分取用等电点电泳装置(例如Rotofor、Bio-Rad Laboratories公司制)分取pI为5.5以下的区域来进行。分取的区域优选pI为5.0以下，更优选为2～3。
通过工序(8)或工序(9)分取的区域可以在除去溶媒之后，提供到工序(7)的制粒工序中。
如此得到的本发明的蛋白多糖可以单独使用，或作为食品或药品的有效成分利用。本发明的蛋白多糖，如果摄取有效量到动物体内，通过MMP抑制活性的上升作用、组织蛋白酶B抑制活性的上升作用、结合珠蛋白的表达亢进作用，可以有助于提高包括疾病预防、治疗在内的生活质量(QOL)。
实施例下面对具体地显示本发明的构成和效果的实施例等进行说明，但本发明不受这些实施例等的任何限制。
实施例1来源于鲨鱼软骨的蛋白多糖的分离(1)鲨鱼软骨提取物的调制利用粗粉碎机(细川密克朗(株)制、FM-1)将晒干干燥的鲨鱼软骨(蓝鲨鱼的软骨)粗粉碎成平均粒径为5mm左右。利用冷冻粉碎机(细川密克朗(株)制、LX-1)将得到的粗粉碎物连同液氮一起粉碎，得到平均粒径为25μm的微粉末。平均粒径是使用Microtrac 9320HRA(Leedsand Northrup公司制)测量的。向得到的微粉末3kg中加入蒸馏水15kg，在室温下搅拌20分钟之后进行离心分离(5分钟、3000rpm)得到上清。向残余的残渣中进一步加入10kg的蒸馏水，在室温下搅拌20分钟之后，与上述同样地进行离心分离得到上清。将上述得到的上清合在一起，通过超滤膜(区域分子量6kDa、SIP-1053、ID1.4mm、旭化成制)将其浓缩至约为65％的容量。向得到的浓缩液中加入3倍容量的乙醇，在室温下静置2个小时，析出沉淀物。通过离心分离(5分钟、3000rpm)回收析出的沉淀物，在40℃下干燥。利用咖啡粉碎机粉碎已干燥的鲨鱼软骨提取物，用于下述实验中。
(2)水分量测量通过常压加热干燥法算出水分含量。测量已充分干燥的坩锅的皮重，正确地在其中称量在上述(1)中得到的样品1g。利用120℃的样品干燥机干燥1个小时，自然冷却后称量。反复进行直至重量一定，然后，从重量的减少量算出各样品中的水分含量(图1)。
(3)灰分量测量测量坩锅的皮重，在其中称量在上述(1)中得到的样品0.2g。利用燃烧器烧坩锅，直至烟不出来时停火，放入到干燥器中，置于设定为500℃的电炉内。放置24小时之后，自然冷却，称量，从重量变化算出灰分量(图1)。
(4)氨基酸分析将在上述(1)中得到的样品的水溶液(200μg/ml)100μl和标准品30μl(氨基酸混合标准溶液H型为10μl、2.5μmol/ml Hyp为10μl、2.5μmol/ml Hyl为10μl)加入各自不同的干净小试管(6mm×5cm)中，离心真空干固。然后，加入到具备mininert阀的15ml反应瓶(reactive vial)中，与300μl的6N HCL一起在减压下(0.1-0.2Torr)且在150℃下水解1个小时。接着，为了除去HCL而进行真空干固。
添加已调制成甲醇∶三乙胺∶蒸馏水＝7∶2∶1的混合液各10μl，进行真空干固。接着，添加由甲醇∶三乙胺∶蒸馏水∶苯基异氰酸酯＝7∶1∶1∶1构成的诱导化液各20μl，在室温下诱导化20分钟之后，真空干固。然后，将含有10％乙腈的5mM磷酸缓冲液(pH7.4、Waters公司制、Pico-Tag样品稀释液)500μl添加到标准品中，200μl添加到样品中。接着，用Parafilm密封试管，利用超声波破坏苯基异氰酸酯的结晶，用0.45μm的过滤器过滤后，进行离心分离(12000rpm、3分钟)，利用反相HPLC分析上清(标准品为10μl、样品为20μl)。柱使用Superspher 100PR-18(e)(Merck公司制)，洗脱液使用含有A液含有5％乙腈的150mM醋酸铵缓冲液(pH6.0)、B液60％乙腈。梯度构成中，洗脱液B为0-2分钟；0％、2-20分钟；10-47.5％、20-25分钟；47.5-100％、25-37分钟；100％、37-50分钟；0％，检测为254nm，流速为0.8ml/min，柱温度为40℃。结果显示于图1中。
(5)利用咔唑硫酸法的硫酸软骨素量的测量将在上述(1)中得到的样品的水溶液(200μg/ml)0.25ml置于试管中，一边用冰水冷却搅拌一边滴下1.5ml的硫酸溶液(将四硼酸钠10水合物0.95g溶于100ml的浓硫酸中)，加入0.05ml的0.125％咔唑溶液(将12.5mg的咔唑溶于10ml的乙醇中)，充分混合之后，用玻璃球盖上，在沸腾水中加热20分钟。在室温下冷却后，利用分光光度计(SPECTROPHOTOMETER DU640，BECKMAN公司制)测量530nm的吸光度(T.Bitter，H.M.Muir，Anal.Biochem.，4，330，1962)。在标准品中使用硫酸软骨素C(20、40、100、200μg/ml)，进行同样的操作。
如图1所示，在上述(1)中得到的鲨鱼软骨水提取物的组成如下以蛋白质和硫酸软骨素为主成分(分别为30.8％和44.2％)，水分为5.8％，灰分为19.2％。另外，在鲨鱼软骨提取物中含有的蛋白质的氨基酸组成为含有大量Gly，含有胶原特有的羟基脯氨酸(Hyp)和羟基赖氨酸(Hyl)。该组成与鲨鱼软骨II型胶原的组成大致一致。与II型胶原一起富含Ser等，所以表明含有蛋白多糖的蛋白质成分。
接着，利用与上述(4)相同的方法对用后述的凝胶过滤纯化得到的MMP-9抑制活性的区域进行氨基酸分析。将结果显示于图2中。从图2可知，由于几乎不含有羟基脯氨酸，所以上述区域以该蛋白质成分为主来源于蛋白多糖。
(6)鲨鱼软骨水提取物的MMP-2或者MMP-9抑制活性向0.6ml微管中加入含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35(ICI公司制)的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.86)10μl，0.1％V型胶原(来源于牛胎盘的胃蛋白酶分解、株式会社YAGAI制)溶液10μl，在上述(1)中得到的样品(调制成0.01～2.0％水溶液)5μl，MMP-2溶液或MMP-9溶液10μl；在37℃下催化反应24小时。其中，作为阴性对照(NC)，使用除了样品和MMP-9以外的物质，作为阳性对照(PC)，使用除了样品以外的物质，加入50mM Tris-HCl缓冲液并使其为相同量来代替之。反应后，分别加入0.5M乙二胺四乙酸(pH7.5)20μl、10％十二烷基硫酸钠5μl和0.1％溴酚蓝5μl，用热水加热。将其中10μl提供到SDS-PAGE中，接着利用Western印迹法转印到PVDF膜上，利用POD Immunostain Set(和光纯药工业株式会社制)分离、鉴定V型胶原及其分解产物的带。利用光密度计测量各带浓度，求得相对于V型胶原的α1、α2链的分解产物的带链(α1’、α2’链)的丰度比(Int OD％S’)。分解抑制率是通过从100减去将阳性对照(PC)分解产物的丰度比(PC’)设为100时的比，来求得抑制率(图3)。
从图3可知，在上述(1)中得到的鲨鱼软骨提取物浓度依赖性地抑制MMP-2活性和MMP-9活性，以2％的浓度大约抑制90％。
(7)通过等电点电泳的分区将在上述(1)中得到的鲨鱼软骨提取物0.5g溶解于50ml的蒸馏水中，利用等电点电泳装置Rotofor(Bio-Rad Laboratories公司制)，12W泳动120分钟。对各片段进行pH测量，通过与上述(6)相同的方法检测MMP-9抑制活性(图4)。
从图4可知，MMP-9抑制活性在等电点为酸性的区域高，特别是在pH 2.0～3.0的区域的MMP-9抑制活性高。
(8)利用Superdex(注册商标)75凝胶过滤HPLC的分区对在上述(7)的等电点电泳中MMP-9抑制活性高的区域进行离心分离(12000rpm、30分钟)，通过0.45μm的过滤器过滤其上清，然后通过凝胶过滤HPLC对200μl进行分区。分离条件为洗脱液使用含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris-HCl(PH7.86)，柱使用Suerdex(注册商标)75(Amersham Biosceinces公司制)。流速为0.5ml/min，在波长为230nm处进行检测(图5)。在产生峰值之前10分钟，每1分钟利用FRACTION CORECTORE(Bio-Rad Laboratories公司制)分取，通过与上述(6)相同的方法检测MMP-9抑制活性(图6)。
从图5和图6可知，MMP-9的抑制活性存在于分子量为100kDa以上的高分子区域(图中、用※表示)。
(9)醋酸纤维素膜电泳向MMP-9抑制活性区域中添加30倍容量的0.5N NaOH，在4℃下反应24小时。然后利用1N HCl进行中和，添加4.5ml的链霉蛋白酶缓冲液，使其热变性(100℃、10分钟)。冷却到50℃后加入百里酚(thymol)。然后，在50℃下反应48小时。为了除去蛋白，加入4.5ml的30％三氯醋酸溶液，在4℃下反应1个小时。将上述溶液离心分离(8000×g、15分钟)，相对于蒸馏水透析该上清，冻结干燥。对于该干燥物，进行使用了醋酸纤维素膜的电泳。作为电泳用缓冲液，使用含有0.1M吡啶、0.47M甲酸的吡啶-甲酸缓冲液。作为标记物，使用硫酸软骨素C、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)和透明质酸(图7)。
从图7可知，具有MMP-9抑制活性的高分子区域在链霉蛋白酶处理前，作为宽带被检测出，而通过链霉蛋白酶处理在与硫酸软骨素C(CSC)相同的位置被检测出。因而，表明具有MMP-9抑制活性的酸性且亲水性的高分子区域含有硫酸软骨素C，并且与蛋白质结合。
(10)利用Superdex(注册商标)200凝胶过滤HPLC的分区将在上述(1)中得到的鲨鱼软骨提取物溶解于蒸馏水中成为1mg/ml，进行离心分离(12000rpm、30分钟)，通过0.45μm的过滤器过滤其上清，然后通过凝胶过滤HPLC对200μl进行分区。分离条件为洗脱液使用含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris-HCl(PH7.86)，柱使用Suerdex(注册商标)200(Amersham Biosceinces公司制)。流速为0.5ml/min，在波长为230nm处检测(图8)。利用FRACTION COLLECTOR(Bio-Rad Laboratories公司制)在每1分钟进行分取，通过与上述(6)相同的方法检测MMP-9抑制活性。
从图8可知，MMP-9的抑制活性存在于分子量为500kDa以上的高分子区域。
比较例1利用实施例1(6)中记载的方法，检测在实施例1(8)中得到的酸性且亲水性的高分子区域(本发明品)、硫酸软骨素C和市售的鲨鱼软骨的MMP-9抑制活性。将其结果显示于图9中。
从图9可知，硫酸软骨素C和市售的鲨鱼软骨几乎不具有MMP-9抑制活性。为了比较本发明品与市售的鲨鱼软骨的成分，检测各自的硫酸软骨素量和氨基酸量。结果，硫酸软骨素量没有显著差异，而氨基酸量在本发明品中绝对多。硫酸软骨素C单独存在时几乎没有MMP-9抑制活性，所以表示与糖链相比，MMP-9抑制活性更存在于蛋白质部分中。
实施例2相对于载癌仓鼠的鲨鱼软骨提取物摄取的效果(1)实验食的调制作为基础食，使用从日本CLEA株式会社买入的CE-2粉末，作为实验食，使用的是在基础食中添加0.2重量％或0.4重量％的在实施例1(1)中调制的鲨鱼软骨提取物(下面有时将重量％简写为％)。下述仓鼠可以自由摄食上述基础食和实验食。水也可以自由摄取。检测摄取了实验食的各仓鼠的体重和饵的摄取量。在相同组之中未见明显的体重差以及饵的摄取量的差异。
(2)实验动物从日本SLC株式会社买入叙利亚金黄仓鼠(6周龄)。在调节为室温24±1℃、湿度60±5％的12小时明暗周期的饲育室中将每4～5只仓鼠放入1个塑料笼中饲育。为了顺应环境，从动物搬入开始进行1周非实验饲育。另外，动物实验是在奈良县立医科大动物实验设施中，遵守相同设施的动物实验伦理规定进行的。
(3)利用N-亚硝基双(2-氧丙基)胺(BOP)的胰管癌诱发仓鼠向全部动物每1kg体重皮下注射50mg的BOP，伴随着短期胰癌发生系(Mizumoto K.等、J.Natl.Cancer Inst.801546-57，1988)，投入缺胆碱食物，反复进行2次由每1kg体重腹腔内给500mg的乙基硫氨酸、每1kg体重腹腔内给800mg的蛋氨酸以及每1kg体重皮下给20mg的BOP构成的一系列操作，制作出胰管癌诱发仓鼠。从实验开始算起，从第50至第100天为止，投入上述实验食(村田奈保牛和鲨鱼软骨水提取物对仓鼠胰管癌发生的影响奈良医学杂志53(5、6)241-52 2002)。
实验期间的体重在各组之间没有见到差异，在最终体重、胰和肝的重量和饵的摄取量方面也没有看到显著差异。除外在被实验物质开始之后在0.4％鲨鱼软骨食组马上有1只死亡以外，在实验期间没有见到动物的死亡。另外，0.4％组与其它组相比，毛光泽等动物的一般状态良好。
图10是表示对摄取实验食50天且生存100天的所有动物进行屠杀剖检时的胰癌病变和胰管癌的数目。可见每1只动物的胰管上皮增生和异型性增生的发生数目为0.2％，在0.4％组中有减少倾向，而与基础食组比较，没有见到显著差异。胰管癌的发生数目在基础食组中为3.1±2.0个，在0.2％组中为2.6±2.1个，在0.4％组中为1.4±0.9个，可见与鲨鱼软骨提取物的用量相关，有减少的倾向。0.4％组与基础食(0％)组相比，胰管癌的发生数目优先减少(图中★表示P＜0.05)。
(4)胰癌组织移植仓鼠对向仓鼠的后背部左右2处传代移植N-亚硝基双(2-羟基丙基)胺(BHP)诱发胰癌组织的部位进行细区分，使用金属制套针(trocar)进行移植。在投入实验食时，不是观察移植癌的存活抑制效果而是为了观察肿瘤的增大抑制效果而设置1个星期的癌存活延迟期间。随后3周投入实验食。作为观察肿瘤增大的计算方法，由于与椭圆形近似而从测量的长径和短径并通过4/3×π×(长径/2)×(短径/2)2求得体积，进行比较。将一部分仓鼠作为非载癌仓鼠进行实验食投入。
结果，癌存活后经过3周，实验食组与基础食组相比更抑制肿瘤的生长。
(5)血清与组织提取实验期间结束后，在乙醚麻醉的基础上，从仓鼠的腹部主动脉采集全部血液，对通过常温静置后分离出的上清进行离心分离(20分钟、3000rpm)，得到血清。根据需要还采集肿瘤和非肿瘤组织，冻存于-80℃。作为从组织的MMP提取法，相对于组织10mg添加含有1％Tween和300mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液500μl，在微管内进行均质化，在冰中孵育15分钟。然后以3000rpm进行离心分离30分钟，将得到的上清作为组织提取液。实验是通过全部灭菌操作进行的。
(6)摄取了鲨鱼软骨提取物的非载癌或载癌仓鼠血清的MMP-9抑制活性测量制作含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.86)和将其2倍稀释的50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，使用该50mM缓冲液将血清稀释为适当的浓度(5～20倍)，提供到MMP抑制活性测量。
向0.6ml微管中加入含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.86)10μl、0.1％V型胶原(来源于牛胎盘胃蛋白酶分解株式会社ャガィ制)溶液10μl、血清样品5μl、MMP-9溶液10μl，在37℃下催化反应24小时。其中，作为阴性对照(NC)使用除了血清、MMP-9以外的物质，作为阳性对照(PC)使用除了血清以外的物质，代替以加入50mM Tris-HCl缓冲液并成为相同量。反应后，分别加入0.5M乙二胺四乙酸(pH7.5)20μl，10％SDS 5μl和0.1％BPB 5μl，用热水加热。进行SDS-PAGE随后通过Western印迹法将其中10μl转印到PVDF膜上，利用POD Immunostain Set(和光纯药工业株式会社制)分离、鉴定V型胶原及其分解产物的带。利用光密度计测量各带浓度，求得相对于V型胶原的α1、α2链的分解产物的带链的丰度比(IntOD％S’)。分解抑制率是通过从100减去将阳性对照(PC)分解产物的丰度比(PC’)作为100时的比而求得抑制率的，进而从稀释倍率(D’)和供应量(A’)表示血清1ml中的抑制活性。
非载癌仓鼠摄取2周实验食(0.4％)或基础食时的血清中的MMP-9的V型胶原分解抑制活性(U/ml)，在实验食组中为4.95±0.06，基础食组为4.13±0.59。通过摄取鲨鱼软骨提取物，可见针对MMP-9的抑制活性有增加的倾向。
载癌仓鼠摄取3周实验食(0.4％)或基础食时的血清中的MMP-9的V型胶原分解抑制活性(U/ml)，在实验食组中为4.1±0.3，基础食组为3.2±0.7。
从这些结果可知，在仓鼠中，通过致癌使MMP-9的抑制活性从4.1U/ml到3.2U/ml大约降低20％，而通过摄取鲨鱼软骨提取物，与载癌仓鼠一起显著恢复。另外，即使在健康的非载癌仓鼠中，也可知通过摄取鲨鱼软骨提取物，MMP-9抑制活性大约增加20％。
实施例3仓鼠血清中的结合珠蛋白量利用SDS-PAGE分离非载癌仓鼠摄取2周鲨鱼软骨提取物时的血清，进行CBB染色。结果，与基础食组相比，在实验食组大约80kDa的带增加。切下上述80kDa的带，进行结构分析(蛋白测序PPSQ21、岛津制作所制)，可知为仓鼠内源性结合珠蛋白(α链VDLSNDAMDTADDS(序列号1)、β链IIGGSLDAKGSFPW(序列号2))。
结合珠蛋白具有结合通过溶血产生氧化血红蛋白、中和氧化性血管障碍毒性等功能，以溶血为代表，最近正在成为癌的恶性度等很多疾病的指标蛋白(Pathol Oncol Res.1998；4(4)271-6、Br J Cancer.1991 Aug；64(2)386-90)。另外，还有报道针对提示与癌的转移、浸润有关联的组织蛋白酶B(Chin Med J(Engl).1998Sep；111(9)784-8、FEBS Lett.1999Jul 23；455(3)286-90)的抑制活性能(Can J Biochem.1982 Jun；60(6)631-7)或结合珠蛋白-血红蛋白复合体诱导癌细胞的凋亡(ScandJ Clin Lab Invest.1995 Oct；55(6)529-35)。目前，对于结合珠蛋白难以解释，而作为解释之一，通过摄取鲨鱼软骨提取物可以使血清中的结合珠蛋白增加，可以看出有保持肝功能良好的可能性。
实施例4针对癌患者的摄取鲨鱼软骨提取物的效果对于患有胰癌的男性志愿者(50～60岁)，每日经口摄取2g在实施例1(1)中调制的鲨鱼软骨提取物并经过4个月，对摄取前和摄取后的血清进行分析。由于如果向该患者投入其它抗癌药，副作用的影响会很大，所以不进行。
(1)摄取了鲨鱼软骨提取物的载癌人血清的MMP-9抑制活性测量将该患者血清稀释成20倍，用与实施例2(6)相同的手法检测MMP-9的抑制活性。将其结果显示于图11。
如果比较NC(Negative Control＝只有V型胶原基质溶液的阴性对照)和PC(Positive Control＝将MMP-9加入到V型胶原基质溶液中进行孵育的阳性对照)，在PC中可见通过MMP-9分解的低分子量的V型胶原。
(图中用箭头表示)在Before(摄取鲨鱼软骨提取物前的患者的血清)可见与PC相同的分解产物，在After(摄取鲨鱼软骨提取物4个月之后)分解物明显减少，可以确认通过摄取鲨鱼软骨提取物，即使在患者中对MMP-9的抑制活性也增加。
(2)通过ELISA法的胰癌患者的IV型胶原分解物量的测量在患者中，如果MMP-9、2的活性高，则IV型胶原被分解，其片段在血清中增加。所以，通过使用作为ELISA法检测试剂盒的Panassay IV-C(第一Fine chemical株式会社制)，检测血清中的IV型胶原的片段量，评价MMP-9的活性。
采集鲨鱼软骨提取物摄取前和摄取后的患者的血清和作为对照的3名健康人的血清。在加入了稀释成20倍的血清50μl和酶标抗体液300μl的试管中，放入抗体结合珠，混合后静置1小时。静置后，反复进行4次将清洗液加到试管中并用吸气器吸引除去反应液的工序。在残余的珠上加入显色液300μl，进而加入100μl基质液，混合后，静置30分钟。静置后，加入1mL终止液，将水作为对照在波长450nm下测量吸光度。以预先准备的校准线为基础，从吸光度求得血清中的IV型胶原片段量。将结果显示于图12中。(“正常人”是指3名健康人的平均值)与正常人相比，鲨鱼软骨提取物的摄取前的胰癌患者的血清IV型胶原量为相当高的值。所以，可以推测IV型胶原受到分解，产生癌的转移浸润、增殖。其在鲨鱼软骨提取物的摄取后确实减少了。从这些可知，鲨鱼软骨提取物的摄取具有抑制MMP的活性的效果。
工业上的可利用性与从前报道的MMP合成抑制剂的OPB-3206中的胰致癌抑制实验(Carcinogenesis.1999 Jul；20(7)1323-9)相比，本发明的蛋白多糖的胰致癌抑制实验显示出与合成抑制剂相匹敌的抑癌效果。此外，由于没有见到被实验动物的体重减少或运动能力降低等MMP合成抑制剂特有的明显的副作用，所以来源于鲨鱼软骨的本发明品可以作为来源于天然物的癌进展抑制物质。另外，本发明的蛋白多糖的制造方法，可以容易地制造具有这样的特性且作用机制明确的蛋白多糖。
序列表<110>细川密克朗集团<120>从软骨鱼类分离的蛋白多糖及其制造方法<130>PGT0410HM<150>JP/2003/77778<151>2003-03-20<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>14<212>PRT<213>仓鼠<400>1Val Asp Leu Ser Asn Asp Ala Met Asp Thr Ala Asp Asp Ser1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>仓鼠<400>2Ile Ile Gly Gly Ser Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp1 5 10
权利要求
1.一种蛋白多糖，其特征在于，是从软骨鱼类的软骨的水提取物分离出来的，且主成分具有500kDa以上的分子量。
2.根据权利要求1所述的蛋白多糖，其特征在于，不溶于醇。
3.根据权利要求1或者2所述的蛋白多糖，其特征在于，葡糖氨基葡聚糖部分以硫酸软骨素C为主成分。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的蛋白多糖，其特征在于，具有针对Matrix Metallo Protease的抑制活性。
5.根据权利要求4所述的蛋白多糖，其特征在于，所述Matrix Metallo Protease为MMP-9，所述抑制活性是使已摄取0.4重量％添加饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性的减少得到恢复的作用，或者使已摄取0.4重量％添加饵料的载癌动物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的蛋白多糖，其特征在于，通过有效量的生体内摄取而具有使相对组织蛋白酶B的抑制活性上升的作用。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的蛋白多糖，其特征在于，通过有效量的生体内摄取而具有使血清中的结合珠蛋白量增大的活性。
8.一种组合物，其特征在于，含有根据权利要求1～7中任意一项所述的蛋白多糖。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，用于提高生活质量。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～7中任意一项所述的蛋白多糖作为有效成分。
11.一种权利要求1～7中任意一项所述的蛋白多糖的制造方法，其特征在于，包括将来源于软骨鱼类的软骨粉碎成平均粒径为100μm以下的粉碎物的工序、向所述粉碎物中添加水来提取水溶性成分的工序、分离含有所述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向所述水相中添加醇得到沉淀物的工序。
全文摘要
本发明提供一种蛋白多糖，它来源于软骨鱼类的软骨的水提取物且主成分具有500kDa以上的分子量；还提供含有上述蛋白多糖的组合物；还提供含有上述蛋白多糖作为有效成分的药物组合物；以及还提供蛋白多糖的制造方法，包括将来源于软骨鱼类的软骨粉碎成平均粒径为100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水来提取水溶性成分的工序、分离含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。由此本发明提供即使摄取少量也能够发挥效果且效果的作用机制明确的软骨提取物及其制造方法。
文档编号A61P43/00GK1761686SQ200480007528
公开日2006年4月19日 申请日期2004年3月15日 优先权日2003年3月20日
发明者佐藤健司, 堤雅弘, 野村义宏, 村田奈保, 近藤直幸 申请人:细川密克朗集团