某些[1,4]二氮杂并[6,7,1-ij]喹啉衍生物的代谢产物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：某些[1,4]二氮杂并[6,7,1-ij]喹啉衍生物的代谢产物及其制备方法和用途的制作方法
专利说明某些[1，4]二氮杂并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代谢产物及其制备方法和用途 发明领域 本发明涉及用作抗精神病和抗肥胖药物的某些[1，4]二氮杂并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代谢产物、其制备方法、包含它们的药物组合物及其使用方法。

背景技术：
精神分裂症影响了约500万人。目前，精神分裂症最普遍的治疗是使用“非典型”抗精神病药，其拮抗多巴胺(D2)受体和5-羟色胺(5-HT2A)受体。尽管有报道非典型抗精神药物在效能和副作用方面优于典型抗精神药物，但是这些化合物不能充分治疗精神分裂症的所有症状，并伴有难以处理的副作用包括体重增加(Allison，D.B.，等，Am.J.Psychiatry，1561686-1696，1999；Masand，P.S.，Exp.Opin.Pharmacother.I377-389，2000；Whitaker，R.，Spectrum Life Sciences.Decision Resources.21-9，2000)。有效治疗精神分裂症中的心境障碍或认知障碍而不引起体重增加的新型抗精神病药物将代表精神分裂症治疗的重大进步。
5-HT2C激动剂和部分激动剂代表了精神分裂症治疗的新方法。几个方面的证据表明激动5-HT2C受体是一种治疗精神分裂症的方法。对5-HT2C受体拮抗剂的研究表明这些化合物增加突触多巴胺水平，并且在帕金森氏病动物模型中是有效的(Di Matteo，V.，等，Neuropharmacology 37265-272，1998；Fox，S.H.，等，ExperimentalNeurology 15135-49，1998)。由于精神分裂症的正向症状与多巴胺水平升高有关，具有与5-HT2C拮抗剂相反作用的化合物如5-HT2C激动剂和部分激动剂应降低突触多巴胺水平。最近的研究已证明5-HT2C激动剂降低额前皮质和伏核中的多巴胺水平(Millan，M.J.，等，Neuropharmacology 37953-955，1998；Di Matteo，V.，等，Neuropharmacology 381195-1205，1999；Di Giovanni，G.，等，Synapse3553-61，2000)，人们认为额前皮质和伏核是药物如氯氮平调节关键性抗精神病作用的大脑区域。相反，5-HT2C激动剂不降低纹状体中的多巴胺水平，纹状体是与锥体外系副作用最密切相关的大脑区域。另外，最近的研究表明5-HT2C激动剂降低腹侧被盖区(VTA)而非黑质中的点燃作用。相对于黑质纹状体通路，5-HT2C激动剂在中脑边缘通路的不同作用表明5-HT2C激动剂将具有边缘选择性并且几乎不可能产生与典型抗精神病药物相关的锥体外系副作用。
非典型抗精神病药物对5-HT2C受体具有高亲和力，用作5-HT2C受体拮抗剂或反相激动剂。体重增加是与非典型抗精神病药(如氯氮平和奥氮平)相关的难以处理的副作用，并且有人认为5-HT2C拮抗作用是体重增加的原因。相反地，已知刺激5-HT2C受体引起食物摄入减少和体重降低(Walsh等，Psychopharmacology 12457-73，1996；Cowen，P.J.，等，Human Psychopharmacology 10385-391，1995；Rosenzweig-Lipson，S.，等，ASPET abstract，2000)。因此，5-HT2C激动剂和部分激动剂将几乎不可能引起与目前非典型抗精神病药相关的体重增加。实际上，5-HT2C激动剂和部分激动剂对于肥胖的治疗非常有用，肥胖是一种以过量体脂肪和脂肪组织为特征的医学疾病，并同时伴有如II型糖尿病、心血管疾病、高血压、高脂血症、中风、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、胆囊疾病、痛风、某些癌症、某些不育症和早死。
化合物(9aR，12aS)-4，5，6，7，9，9a，10，11，12，12a-十氢-环戊[c][1，4]二氮杂[6，7，1-IJ]喹啉(以下为DCDQ)
是有效的5-HT2C激动剂。见相关公开申请WO03/091250和US2004/0009970，其各自全文通过引用并入本文。DCDQ还能有效治疗与精神分裂症相关的心境障碍或认知缺损。在一些体内和体外模型中，DCDQ被转化为一些代谢物。由此可见，这些代谢物可用于治疗由DCDQ本身或转化为DCDQ的前体药物可治疗的那些疾病、障碍或症状。这些代谢物还可以用于进一步研究DCDQ的效应。本发明涉及这些以及其它的重要的目标。
发明概述 本发明的一些实施方案包括式I化合物
其中 对于各Rn和Rn′，其中n是1-8 各Rn和Rn′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O-、-OSO3H或-O-G；或者 Rn和对应的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，与它们连接碳一起结合形成C＝O；或者 Rn连同对应的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起结合在其连接的碳之间形成双键，并且各对应的Rn′和R(n+1)′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G； G具有下式
其中用＊标记的氮可任选形成N-氧化物； X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10； R9是氢、羟基或-OSO3H； R10是氢、乙酰基、-SO3H、-G或-C(O)-OG； Z是氢、羟基、-OSO3H或-O-G； 条件是当Z是羟基时，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氢；或者(b)X-Y不是CR9HNR10；并且 另外的条件是当X-Y是CHR9NR10时，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一个不是H。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中Z和R1～R8中至少一个是-OH。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一个是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中R1～R9和Z中至少一个是-OSO3H。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中X-Y是CR9HNR10，其中R9是H和R10是-SO3H。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中Rn和对应的Rn′，与其连接的碳一起结合形成C＝O。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中X-Y是C(O)NH。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中X-Y是CH＝N。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物，其中至少一个Rn和其对应的Rn+1在与其连接的碳之间一起形成双键，其中n＝1-5，并且各Rn和Rn+1独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。
在一些实施方案中，本发明提供了式I化合物的分离的或基本上纯的形式，其纯度至少为75％。在其它实施方案中，本发明提供了纯度至少为80％的式I化合物。在其它的实施方案中，本发明提供了纯度至少为85％的式I化合物。在其它的实施方案中，本发明提供了纯度至少为90％的式I化合物。在其它的实施方案中，本发明提供了纯度至少为95％的式I化合物。
在一些实施方案中，本发明提供了包括式I化合物的药物组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗与5HT2C相关的症状、疾病或障碍的方法，通过给予需要这种治疗的患者式I化合物或包含式I化合物的药物组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种制备式M6化合物的方法
包含 在偶合剂存在下，在充足条件下，化合物6a
其中各L、L1和L2是离去基团； 和DCDQ
反应得到化合物7
并除去所述的离去基团L1和L2形成化合物M6。
在一些实施方案中，本发明提供的方法中，其中L具有下式
在一些实施方案中，本发明提供的方法中，其中L1和L2独立地选自低级烷基和乙酰基，如L1是甲基和各L2是乙酰基。
优选的偶合剂是(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种进一步包含脱保护化合物7的方法，经除去化合物7的葡糖醛酸基部分的L1和L2保护基团，从而形成M6代谢产物。在一些实施方案中，所述脱保护步骤在碱存在下，优选NaOH、LiOH或KOH存在下，在醇中，优选在低级烷基醇中进行。在一些优选的实施方案中，使用在MeOH/H2O/THF中的LiOH·H2O，其优选的比例约为2.5∶1.0∶0.5。在一些实施方案中，脱保护反应在0℃进行1小时。
在一些实施方案中，化合物6与偶合试剂和DCDQ的反应在胺，优选许尼希氏碱存在下进行。这一反应优选在溶剂如CH2Cl2中进行。
在一些实施方案中，化合物7在脱保护之前经柱色谱法纯化。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了纯化M6代谢产物的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了化合物6a的制备方法，其通过使用催化剂和亲核试剂，优选吗啉，除去化合物5
的烯丙基保护基团。在一些实施方案中，所述催化剂是Pd(PPh3)4。
在一些实施方案中，本发明提供了化合物5的制备方法，其中羧酸2
和DPPA在充足的条件下反应得到酰基叠氮化合物中间体； 在充足的条件下加热生成的酰基叠氮化合物中间体得到异氰酸酯3

以及 在充足的条件下用2，3，4-三乙酰基-1-羟基葡萄糖醛酯4
处理所述加热步骤的产物得到化合物5。在一些实施方案中，此反应步骤在碱，优选Et3N存在下进行。
在一些实施方案中，本发明提供了化合物2的制备方法，在催化剂，优选DMAP存在下，经联苯二甲酸酐和过量的丙烯醇，优选丙-2-烯-1-醇反应制备。
经阅读本公开内容，本发明的这些和其它实施方案对于本领域内的技术人员是显然的。
附图简述

图1是一流程图，其提出了在体内和体外研究中确定的DCDQ的代谢途径。
图2是另一个流程图，其提出了在大鼠胆汁排泄研究中确定的DCDQ的代谢途径。
图3是另一个流程图，其提出了在小鼠中确定的DCDQ的代谢途径。
图4是另一个流程图，其提出了在人血浆中确定的DCDQ的代谢途径。
图5描述了如在大鼠胆汁排泄研究中确定的DCDQ、M7、M9和M13的结构及NMR编号图解。
发明详述 一些方面中，本发明涉及DCDQ的代谢产物、其制备方法和使用它们治疗各种疾病的方法。
一些方面中，本发明提供了式(I)化合物
其中 对于各Rn和Rn′，其中n是1-8 各Rn和Rn′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；或者 Rn和对应的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，与其连接的碳一起结合形成C＝O；或者 Rn连同对应的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起结合在它们连接的碳之间形成双键，并且各对应的Rn′和R(n+1)′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G； 其中用＊标记的氮可任选形成N-氧化物； G具有下式
X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10； R9是氢、羟基或-OSO3H；并且 R10是氢、乙酰基、-SO3H、-G或-C(O)-OG； Z是氢、羟基、-OSO3H或-O-G，条件是当Z是羟基时，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氢；或者(b)X-Y不是CR9HNR10； 另外的条件是当X-Y是CHR9NR10时，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一个不是H。
制备DCDQ(即，式I化合物，其中X-Y是CHR9NR10和各Z和R1～R10是H)的方法公开于美国专利申请公开US2004/0009970中，因此其全文通过引用并入本文。DCDQ本身不打算在本文公开的式I化合物之内。
在一些实施方案中，本发明提供了式I的羟基化合物。优选地，Z和R1～R8中至少一个是羟基。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了式I的羟基化合物，其中X-Y是CR9HNR10。这类羟基化合物的一些实例包括那些化合物，其中 R9和R10各自是H； R7和R8中至少一个是-OH； R6是-OH； R3和R4中至少一个是-OH；或者 R1、R5、R6、R7和Z中至少一个是-OH。
在其它的实施方案中，本发明提供了式I的羟基化合物，其中X-Y是CR9NHR10和R10是乙酰基。这类羟基化合物的一些优选实例包括那些化合物，其中 R7和R8中至少一个是-OH； 在其它的实施方案中，本发明提供了式I的羟基化合物，其中X-Y是C＝N。在一些优选的实施方案中，R1～R6中至少一个-OH。在其它优选的实施方案中，R2～R4中至少是-OH。
在其它的实施方案中，本发明提供了根据式I的葡糖醛酸基化合物，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一个是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了葡糖醛酸基化合物，其中X-Y是CR9HNR10。在一些优选的实施方案中，R9和R10是H。在其它优选的实施方案中，Z、R3和R4中至少一个是-O-G。在其它优选的实施方案中，R1～R6、R9和Z中至少一个是-O-G。
在另一个实施方案中，本发明提供了式I的葡糖醛酸基化合物，其中R2连同R3一起结合在其连接的碳之间形成双键，并且R3′和R4中至少一个是-O-G。
在其它的实施方案中，本发明提供了式I化合物的葡糖醛酸基化合物，其中R10是-C(O)O-G或-G。在一些实施方案中，进一步提供了此类化合物，其中R4和R4′与其连接的碳一起结合形成C＝O。
在一些实施方案中，本发明提供了葡糖醛酸基化合物，其中X-Y是-CHR9NR10，其中R10是-C(O)-O-G。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了式I化合物，其中Z、各Rn和Rn′是H，X-Y是-CHR9NR10。在一些这样的实施方案中，R9是H。在优选的实施方案中，R9是H且R10是-C(O)-O-G。
在其它的实施方案中，本发明提供了式I的葡糖醛酸基化合物，其中R10是乙酰基。在优选的实施方案中，进一步提供了这种衍生物，其中R1～R6、R9和Z中至少一个是-O-G。在另外其它的实施方案中，R7和R8中至少一个是-O-G。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的硫酸酯化合物，其中R1～R9和Z中至少一个是-OSO3H。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了上述硫酸酯化合物，其中X-Y是-CHR9NR10。在一些这样的实施方案中，R9和R10各自是H。在一些这样的实施方案中，R1～R6中至少一个是-OSO3H。在另外的实施方案中，R2和R3中至少一个是-OSO3H。在一些实施方案中，R3是-OSO3H。
在一些实施方案中，本发明提供了式I的硫酸酯化合物，其中R9和Z中至少一个是-OSO3H。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的氨基磺酸酯化合物。在一些实施方案中，本发明提供了这种氨基磺酸酯化合物，其中X-Y是CR9HNR10，且R10是-SO3H。在其它的实施方案中，本发明提供了这种氨基磺酸酯化合物，其中至少两个Rn及其对应的Rn+1在其连接的碳之间形成双键，其中n＝1-5。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的酮类化合物，其中Rn及其对应的Rn+1与其连接的碳一起结合形成C＝O。在一些优选的实施方案中，n＝4。在另外优选的实施方案中，X-Y是CR9HNR10，并且优选地R10是-G。在其它的实施方案中，R9和R10是H。
根据式I的酮类化合物的其它实施方案提供了其中X-Y是C(O)NH的化合物。
在一些实施方案中，本发明提供了根据式I的亚胺化合物。在一些实施方案中，X-Y是CH＝N。在一些这样的实施方案中，R1～R6中至少一个是-OH。在其它这样的实施方案中，R2～R4中至少一个是-OH。在另外其它的这种实施方案中，化合物可以是N-氧化物，其中在R6和R7连接的碳之间的氮形成N-氧化物。
在另外的实施方案中，本发明提供了式I的脱氢化合物，其含有一个或多个双键。在这些实施方案中，提供了这种化合物，其中Rn及其对应的Rn+1一起在其连接的碳之间形成双键，其中n＝1-5，并且各Rn′和R(n+1)′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。在一些优选的实施方案中，n＝2。在另外优选的实施方案中，n＝2，R2′＝H及R3′或R4是-O-G。在另外的实施方案中，X-Y是CHR9NR10，其中R9和R10优选是H。
在其它的实施方案中，提供了式I的二脱氢化合物，其中至少两个Rn，各所述Rn及其对应的Rn+1一起在它们连接的碳之间形成双键，其中n＝1-5。在一些优选的实施方案中，本发明进一步提供了X-Y＝CHR9NR10的化合物。在另外的实施方案中，R10是H；且Z或R9是-OSO3H。在另外其它的实施方案中，X-Y＝CHR9NR10，及R9＝R10＝H。
在一些实施方案中，本发明提供了式I的这种二脱氢化合物，其中R10是-SO3H或乙酰基。
本发明的一些方面中，提供了式I化合物的分离的形式。
本发明的其它方面中，提供了式I化合物的基本上纯的形式，其纯度至少为75％。在其它的方面，所述化合物的纯度至少为80％。在其它方面，所述化合物的纯度至少为85％。在其它方面，所述化合物的纯度至少为90％。在其它方面，所述化合物的纯度至少为95％。
如本文使用的，乙酰基是指CH3-C(＝O)-。
如本文使用的，烷基是指脂肪族烃基链，例如含有1-6个碳原子，并且包括但不限于直链和支链如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基和异己基。低级烷基是指含有1-3个碳原子的烷基。
BOP是指(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐。
如本文使用的，氨基甲酰基是指-C(＝O)N＜基团。
DCC是指N，N′-二环己基碳二亚胺。
DIBAH和DIBAL可互换，是指氢化二异丁基铝。
DMAP是指4-二甲基氨基吡啶。
DPPA是指叠氮化磷酸二苯酯。
EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
如本文使用的，葡糖醛酸基是指下式基团
如本文使用的，卤素(或卤代)是指氯、溴、氟和碘。许尼希氏碱是N，N-二异丙基乙胺，本文也表示为i-Pr2NEt。
PyBOP是指(苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷 六氟磷酸盐。
本发明的化合物含有不对称碳原子，因此产生旋光异构体和非对映体。本发明包括这些旋光异构体和非对映体；以及外消旋和拆分的对映体纯R和S立体异构体；以及R和S立体异构体的其它混合物及其可药用盐。
当优选一种对映体时，在某些实施方案中其可以基本没有对应的对映体。因此，基本没有对应对映体的对映体是指通过分离技术分离的一种化合物或者制备出的没有对应对映体的一种化合物。如本文使用的，“基本没有”是指该化合物主要由一种对映体构成。在优选的实施方案中，化合物的组成中优选对映体至少占约90％(重量)。在本发明的其它实施方案中，所述化合物的组成中优选对映体至少占约99％(重量)。可以用本领域技术人员已知的任何方法，包括高效液相色谱法(HPLC)以及生成并结晶手性盐，从外消旋混合物中分离出优选的对映体，或通过本文所述的方法制备。参见例如Jacques等，Enantiomers，Racemates and Resolutions(Wiley Interscience，NewYork，1981)；Wilen，S.H.等，Tetrahedron 332725(1977)；EMeI，E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill，NY，1962)；Wilen，S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutionsp.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，IN1972)。
本领域的技术人员也能识别出可能存在的式(I)的互变异构体。本发明包括所有这些互变异构体，尽管在式(I)中没有显示出来。
本发明中使用的化合物还包括式(I)化合物的可药用盐。“可药用盐”表示经加成可药用碱和式(I)化合物形成的任意化合物，以形成对应的盐。术语“可药用”表示可在药物应用中使用而没有毒理学作用及不与活性成分发生不利的相互作用的物质。可药用盐包括单-和二盐，是与以下酸形成的盐有机和无机酸例如但不限于乙酸、乳酸、枸橼酸、肉桂酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、杏仁酸、苹果酸、草酸、丙酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙醇酸、丙酮酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、苯甲酸和类似已知的可接受的酸。
式I化合物的非限制性实例包括那些经本文详述的体外和体内研究所确证的化合物，以及在图1-4中所述的代谢途径中显示的化合物。这些实例包括下文所示的那些化合物。尽管给出的取代基的连接如方框中所述，但是标明的取代基打算可连接于方框中的任意一个或多个可用的碳原子上。
羟基代谢物
葡糖醛酸基代谢物
硫酸酯代谢物
氨基磺酸酯代谢物
酮类化合物
亚胺代谢物
脱氢化合物
示范性合成 推荐羟基代谢产物M1的合成
推荐羟基代谢产物M2的合成
推荐N-氧化物代谢产物M5的合成
氨基甲酰基葡糖醛酸基代谢产物M6的合成
推荐羟基代谢产物M3和M4、酮类代谢产物M7以及硫酸酯代谢产物M8和M13的合成

推荐硫酸酯代谢产物M8的另外组分的合成
推荐葡糖醛酸基代谢产物M9的合成
推荐羟基代谢产物M10和N-乙酰基羟基代谢产物M11的合成
推荐氨基磺酸酯代谢产物M12的合成
推荐氨基磺酸酯代谢产物M12、二-脱氢氨基磺酸酯代谢产物M14以及N-乙酰基二-脱氢代谢产物M21的合成
推荐酮类代谢产物M18的合成
推荐羟基亚胺代谢产物M15和M29-M31的合成
推荐氨基磺酸酯代谢产物M16的合成
推荐亚胺代谢产物P3的合成
这些推荐合成仅仅是示范性的。本领域内的技术员应当意识到其它的合成可以用于制备本发明的各种化合物。另外，本领域的技术人员应当意识到在上述任意方案中的中间体可以是根据式I的一种化合物，并且可以收集和纯化，如果需要，无需继续下一步。例如，上述氮碳基可以被分离和纯化。此外，本领域的技术人员应当意识到可以改变这些合成以得到本文所述的式I化合物的相关化合物。认为上述方法、化合物和中间体的这些和其它改变或改进在本发明在此公开的范围和精神之内。
治疗方法 DCDQ及相关化合物的亲和力在相关公开申请WO03/091250和US2004/0009970已被充分证实，上述各申请通过引用并入。因此，同DCDQ类似，在给予DCDQ后形成的代谢产物也能用于治疗精神病和其它疾病。
本发明的化合物是大脑5-羟色胺受体2C亚型的激动剂和部分激动剂，因此可用于治疗精神疾病，包括精神病，如精神分裂症包括偏执型、错乱型、紧张型以及混合型，精神分裂症样精神障碍，情感分裂性精神障碍，妄想性精神障碍，物质诱发的精神病和其它未分类的精神病；L-DOPA-诱发的精神病；阿尔茨海默氏痴呆相关性精神病；帕金森氏病相关性精神病；Lewy体病相关性精神病；双相性精神障碍如I型双相性精神障碍、II型双相性精神障碍和循环型双相性障碍；抑郁症如严重抑郁症、情绪恶劣性障碍、物质诱发的情感障碍和其它未分类的抑郁症；情绪发作如严重抑郁症发作、躁狂发作、混合型发作和轻度躁狂发作；焦虑症如惊恐发作、广场恐怖症、恐慌症、特定恐惧症、社交恐惧症、强迫症、创伤后应激障碍、急性应激障碍、泛化性焦虑症、分离性焦虑症、物质诱发性焦虑症和其它未分类的焦虑症；适应障碍如伴有焦虑和/或抑郁性情绪的适应障碍；智力缺陷疾病如痴呆、阿尔茨海默氏病和记忆缺陷；进食障碍(例如过食症、神经性暴食症或神经性食欲缺乏)以及哺乳动物可能出现的上述精神疾病的混合型。例如，心境障碍如抑郁症或双相性精神障碍常伴有精神疾病如精神分裂症。上述精神疾病的更详细说明可以参见Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders，第4版，Washington，DC，American Psychiatric Association(1994)。
本发明的化合物也可用于治疗癫痫；偏头痛；性功能障碍；睡眠障碍；胃肠疾病，如胃肠蠕动障碍；以及肥胖及其伴发病包括II型糖尿病、心血管疾病、高血压、高脂血症、中风、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、胆囊疾病、痛风、某些癌症、某些不育症及早死。本发明的化合物还能用于治疗例如创伤、中风和脊髓损伤相关的中枢神经系统缺陷。因此，在所述疾病或创伤期间或之后，本发明的化合物可用于改善或抑制中枢神经系统活性的进一步退化。上述改善包括维持或改善运动和运动性技能、控制、协调和力量。
因此，本发明提供了治疗哺乳动物优选人类的上述各种疾病的方法，此方法包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的本发明化合物。本文使用的“治疗”表示部分或完全减轻、抑制、预防、改善和/或缓解疾病。例如，本文使用的“治疗”包括部分或完全减轻、抑制或缓解所述症状。本文使用的“哺乳动物”是指温血脊椎动物，如人。本文使用的“提供”表示直接给予本发明的化合物或组合物，或者给予将在体内形成等量的活性化合物或物质的衍生物或类似物。
药物组合物 本发明还包括用于治疗或控制中枢神经系统的疾病状态或症状的药物组合物，其包含至少一种式I化合物、其混合物和/或其药用盐及可药用载体。这样的组合物根据药学上可接受的方法制备，如在Remingtons Pharmaceutical Sciences，第17版，ed.Alfonoso R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)中所述。可药用载体是那些与制剂中其它成分相容以及生物学上可接受的载体。
本发明的化合物可以单独或结合常规药用载体经口服或胃肠外给予，根据化合物的溶解度和化学特性、选择的给药途径和标准药理学实践来确定药用载体的比例。药用载体可以是固体或液体。
合适的固体载体可以包括一种或多种物质，其也可以作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、助压缩剂、粘合剂或片剂崩解剂或包囊剂。粉剂中，载体是与微细活性成分混合的微细固体。片剂中，活性成分以适当比例与具有必要压缩特性的载体混合，并压缩为所需的形状和大小。粉剂和片剂优选含有至多99％的活性成分。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。
液体载体可用于制备溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆和酏剂。本发明的活性成分可以溶于或混悬于可药用液体载体如水、有机溶剂、两者的混合物或可药用油或脂肪中。液体载体可以含有其它合适的药用添加剂如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。口服或胃肠外给药的合适的液体载体的实例包括水(特别包含上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油(例如分馏的椰油和花生油)。对于胃肠外给药，载体还可以是油性酯如油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体用于胃肠外给药的无菌液体形式组合物。增压组合物的液体载体可以是卤化烃或其它可药用的推进剂。
无菌溶液或混悬液的液体药物组合物可以经例如肌内、腹膜内或皮下注射给药。无菌溶液还可以经静脉给予。口服给药可以是液体或固体组合物形式。
本发明的化合物可以常规栓剂形式经直肠或阴道给予。对于鼻内或支气管内吸入剂或吹入剂，本发明的化合物可以制成水性或部分水性溶液，然后可将其以气溶胶形式使用。本发明的化合物还可以通过使用含有活性化合物和载体的透皮贴剂经皮给予，所述载体对于活性化合物是惰性的，对皮肤无毒性，并且可使药物经由皮肤全身吸收入血。载体可以采取许多形式如乳膏和软膏、糊剂、凝胶和封闭装置。乳膏和软膏可以是粘稠液体或者油包水或水包油型半固体乳剂。包含活性成分的分散于石油或亲水性石油中的可吸收粉末的糊剂也是合适的。各种封闭装置可以用于将活性成分释放入血流中，如半透膜覆盖的贮库，所述贮库中含有活性成分，有或没有载体，或含有活性成分的基质。其它封闭装置在文献中是已知的。
优选药物组合物是单位剂型例如片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂或栓剂。在这样的剂型中，组合物细分为含有适量活性成分的单位剂量；单位剂型可以是包装的组合物，例如包装的粉末、小瓶、安瓿、预灌装的注射器或含有液体的小药囊。例如，单位剂型可以是胶囊或片剂本身，或者可以是包装的适量的任何这样的组合物。
剂量需要量随使用的具体组合物、给药途径、症状的严重程度和受治疗患者的具体情况而变化。根据标准药理学测试得到的结果，活性化合物的预计日剂量应为约0.02μg/kg-约4000μg/kg，或最高至500mg/day。应当理解这些剂量范围只是估算，并且本领域内的技术人员将能根据众多因素包括患者体重、症状的严重程度和其它因素确定合适的剂量。治疗的初始剂量通常为小于化合物最佳剂量的小剂量。然后，将剂量增加至达到这种情况下的最佳效果；经口、胃肠外、鼻或支气管内给予的精确剂量由主治医师根据经验与受治疗个体的情况而确定。
实施例 代谢产物化合物 在一些体外和体内模型中通过使用放射标记的DCDQ，[14C]DCDQ，研究了DCDQ的代谢。这些研究显示了几条代谢途径和一些重要的代谢产物。这些研究在下文的实验部分进行了更详细的说明。
用雄性和雌性CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬和交叉性别混合物的人肝微粒体以及冷冻保存的男性人肝细胞经培养研究[14C]DCDQ的代谢。在微粒体培养和人肝细胞中，DCDQ被转化为氧化代谢产物，包括M1、M2、M3、M4、M5和氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。
在四只比格犬中，单次给予[14C]DCDQ盐酸盐肠溶胶囊14.1～16.7mg/kg后，进一步研究了[14C]DCDQ在体内的代谢。在血浆中观察到的主要代谢产物包括羟基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮类DCDQ(M7)、羟基DCDQ亚胺(M15)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。羟基DCDQ的硫酸酯缀合物(M16)和二氮杂基DCDQ羧酸(M17)在血浆中未检出，在尿样中可见。羟基DCDQ代谢产物(M2、M3和M19)、酮类DCDQ(M18)和羟基DCDQ亚胺(M15)在粪便排泄物中检出。DCDQ在犬中被广泛代谢，氧化代谢是其主要的代谢途径，尽管也检测到形成了DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。
在雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠中，单次经口给予(5mg/kg)后，进一步研究了[14C]DCDQ的体内代谢。在血浆中检出的代谢产物包括羟基DCDQ代谢产物(M1、M2、M3、M4和M10)、酮类DCDQ(M7)和II相代谢产物DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二-脱氢DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羟基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化的羟基DCDQ(M11)。DCDQ在大鼠中被广泛代谢为主要氧化代谢产物。
因此，DCDQ的代谢产物经几条代谢途径产生，其中一些是几种种属交叉共有的。这些代谢产物可用于治疗由5HT2C受体引起的障碍和疾病和/或那些可通过给予DCDQ治疗的障碍和疾病。
合成氨基甲酰基葡糖醛酸基代谢产物(M6)
在偶合试剂和CH2Cl2中的胺存在下，M6代谢产物可以通过DCDQ和葡糖醛酸基载体6偶合获得，以得到化合物7。产物，化合物7可以根据本领域内已知的方法纯化，并优选通过柱色谱法纯化，优选用EtOAc/庚烷作为洗脱液。偶合试剂可以选自任意合适的偶合试剂，包括但不限于BOP、DCC和EDC。BOP是优选的偶合剂。合适的胺包括但不限于Et3N、吡啶和许尼希氏碱。优选许尼希氏碱。葡糖醛酸基载体6可以通过领域内技术人员已知的方法制备。L1是脂肪族的离去基团，如但不限于C1～C6烷基、甲基、乙基和丙基，优选甲基。各L2是离去基团，独立地选自乙酰基和苄基，优选乙酰基。葡糖醛酸基载体6优选是仲胺葡糖醛酸基氨基甲酯6，如那些可以根据在Ruben G.G.Leeders，Hans W.Scheeren，Tetrahedron Letters 2000，41，9173-9175中讨论的Scheeren氏方案设计的化合物。
葡糖醛酸基氨基甲酰基代谢产物M6
然后，化合物7被碱水解，导致所有在糖部分2，3，4-位的离去基团L2以及L1脱保护，得到终产物M6代谢产物。碱水解使用碱如NaOH、LiOH和KOH，在C1-C3脂肪醇中进行。LiOH是优选的碱，且MeOH是优选的醇。可以除去有机溶剂并冷冻脱水以得到定量的粗品产物M6。然后，粗品M6的纯化可以经本领域内技术人员已知的方法进行。葡糖醛酸基载体，化合物6
化合物6可以经化合物5中的烯丙基基团脱保护制备，优选使用Pd(PPh3)4催化，并使用吗啉作为亲核基团。优选新配制的催化剂。另外，N2可以任选在加入催化剂之前吹入反应溶液中。这样，得到定量的粗品葡糖醛酸基载体6，无需进一步纯化。
化合物5
化合物可以在一锅反应中以高的收率制备。在Et3N的甲苯溶液存在下，化合物2用DPPA、NaN3或TMSN3中之一处理原位生成酰基叠氮化物10，其经加热，优选至80℃加热1.5小时，得到异氰酸酯3。化合物3无需分离，接着用1-羟基葡糖醛酸酯4处理，优选于室温下过夜，获得标题化合物5(方案3)。化合物4可以经US6,380,166B1所述的方法制备，该专利通过引用并入本文。30℃时的1H NMR显示由于围绕Ar-Ar键的旋转受限所有信号都是双峰。
在化合物4中，L1是脂肪族离去基团，如但不限于C1～C6烷基、甲基、乙基和丙基，优选甲基。各L2是离去基团，其独立地选自乙酰基和苄基。优选乙酰基。
化合物2 为了制备一烯丙基酯2，选取联苯二甲酸酐作为起始原料，并且在催化剂存在下，用过量烯丙醇处理。合适的催化剂包括Et3N、许尼希氏碱、吡啶、胺、NaOH、LiOH、KPH及其它的无机碱。可以得到定量的化合物2。
化合物5
化合物可以在一锅反应中以高的收率制备。在Et3N的甲苯溶液存在下，化合物2用DPPA、NaN3或TMSN3中之一处理原位生成酰基叠氮化物10，其经加热，优选至80℃加热1.5小时，得到异氰酸酯3。化合物3无需分离，接着用1-羟基葡糖醛酸酯4处理，优选于室温下过夜，获得标题化合物5(方案3)。化合物4可以经US6,380,166B1所述的方法制备，该专利通过引用并入本文。30℃时的1HNMR显示由于围绕Ar-Ar键的旋转受限所有信号都是双峰。
在化合物4中，L1是脂肪族离去基团，如但不限于C1～C6烷基、甲基、以及和丙基，优选甲基。各L2是离去基团，其独立地选自乙酰基和苄基。优选乙酰基。
氨基甲酰基葡糖醛酸基代谢产物(M6)的示范性合成 DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸代谢产物(M6)的示范性合成如方案1中所示
一般方法 在Varian Inova 300上于300MHz(1H和13C)记录了NMR谱，并且相对于TMS内标，在ppm级确定了化学位移。分析和制备型TLCs在得自EM Science的硅胶60F-254预涂布板上进行。使用UV于254nm处或10％KMnO4水溶液指示剂使化合物显影。HPLC分析在配有PDA(2996型)UV检测器的Waters Alliance 2695HPLC仪上进行。在Finnigan质谱仪上记录质谱。
联苯基-2，2′-二羧酸2′-烯丙基酯2
向1-L烧瓶中加入联苯二甲酸酐(40g，178mmol)、烯丙醇(300mL)和DMAP(2.18g，17.8mmol，10mol％)。将反应混合物搅拌12h。在减压下于40℃蒸发过量的烯丙醇。残余物再溶于EtOAc(400mL)中，并用NaHSO4水溶液(0.5N，200mL)、盐水(200mL×3)和水(200mL×3)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，通过硅胶垫(500g)，用EtOAc(1L)清洗，减压下浓缩至干燥。痕量烯丙醇经用庚烷蒸馏除去，以得到一烯丙基酯2(50g，100％)，无色油状物。1H NMR(300MHz，CDCl3)8.03-7.99(m，2H)，7.56-7.39(m，4H)，7.19-7.16(m，2H)，5.74-5.61(m，1H)，5.17-5.06(m，2H)，4.52-4.49(m，2H)。
3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-烯丙氧基羰基联苯-2-基氨甲酰基氧基)四氢-吡喃-2-羧酸甲酯5
在氮气气氛下，向500-mL烧瓶中加入联苯基-2，2′-二羧酸2′-烯丙基酯2(5.2g，18.4mmol)、甲苯(100mL)、DPPA(4.8mL，22.1mmol，1.2eq)和Et3N(3.1mL，22.1mmol，1.2eq)。将反应混合物于室温下搅拌过夜，然后加热至85℃保持1.5h，以原位生成中间体异氰酸酯3。混合物冷却至室温。向此混合物中加入2，3，4-三乙酰基-1-羟基葡糖醛酸甲酯4(3.7g，11mmol，0.6eq)，并搅拌过夜。混合物用EtOAc(500mL)稀释，接着用NaHSO4水溶液(0.5N，200mL)、饱和NaHCO3(200mL)、盐水(200mL×2)和水(200mL)洗涤。有机层经无水NaSO4干燥，并在减压下浓缩。残余物(11g)与硅胶(22g)混合，装载于用硅胶(500g)填充的柱(4.5×50cm)上。此柱用EtOAc/庚烷(2∶8，6L；3∶7，4L；4∶6，4L)冲洗。收集各馏份(60mL/馏份)，并蒸发溶剂得化合物5(5.5g，82％)。HPLC，RT＝7.73min；纯度81.44％。由于围绕Ar-Ar键的旋转受限，所有信号都是双峰，1HNMR(300MHz，CDCl3)8.03-7.93(m，2H)，7.64-7.48(m，2H)，7.40-7.23(m，2H)，7.18-7.05(m，2H)，6.49，6.42(2s，1H，NH)，5.74，5.73(2d，J＝8.1Hz，1H，β-异构体)，5.70-5.57(m，1H)，5.33-5.01(m，5H)，4.54-4.48(m，2H)，4.16(d，J＝9.9Hz，1H)，3.73，3.72(2s，3H)，2.04-1.95(3s，9H)。MSm/z[636M+Na]+。
3，4，5-乙酰氧基-6-(2′-羧基联苯-2-基氨基甲酰氧基)四氢吡喃-2-羧酸甲酯6
向500-mL烧瓶中加入3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-烯丙氧羰基联苯-2-基氨基甲酰氧基)四氢-吡喃-2-羧酸甲酯5(5.3g，8.65mmol)、THF(400mL)和吗啉(3.8mL，43.3mmol，5eq)。将反应混合物于室温下搅拌2h，同时向溶液中吹入氮气。然后，加入Pd(PPh3)4(300mg，0.26mmol，3mol％)。将反应混合物进一步搅拌15min，用Et2O(1L)稀释，并用NaHSO4(0.5N，300mL)、盐水(300mL×2)、水(400mL×2)洗涤。有机层经MgSO4干燥并蒸发以获得化合物6(5.3g，100％，HPLC84％纯度)。该化合物无需进一步纯化就应用于下一步中。由于围绕Ar-Ar键的旋转受限，所有信号都是双峰，1HNMR(300MHz，CDCl3)8.05-7.15(m，8H)，5.72，5.70(2d，J＝8.1Hz，1H)，5.36-5.02(m，2H)，4.18，4.13(2d，J＝9.9Hz，1H)，3.77-3.73(m，1H)，3.72(s，3H)，2.03-1.98(3s，9H)。MSm/z572[M-H]-。
化合物7
向500-mL烧瓶中加入3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-羧基联苯-2-基氨基甲酰氧基)四氢吡喃-2-羧酸甲酯6(5.0g，8.7mmol)、CH2Cl2(200mL)和BOP(4.2g，9.6mmol，1.1eq)。在氮气气氛下于室温将混合物搅拌以变成溶液。10min内向该溶液中逐滴加入DCDQ(2.5g，9.6mmol，1.1eq)和N，N-二异丙基-N-乙胺(7.6ml，43.5mmol，5eq)的CH2Cl2(200ml)溶液。将反应混合物搅拌过夜，并经celite过滤。将有机层用水(200ml)洗涤，经MgSO4干燥并蒸发。残余物经柱色谱法(柱4.5×50cm，硅胶500g，溶剂EtOAc/庚烷(2/8，4L)，(3/7，8L)，50mL/馏份)纯化，得到化合物7(4.0g，HPLC74％)，进一步在CH2Cl2中调成浆液以得到化合物7(3.52g，68.8％，HPLC96％)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)7.12-7.08(m，1H)，6.98-6.96(m，1H)，6.86-6.77(m，1H)，5.81，5.79(2d，J＝8.1Hz，1H，β-异构体)，5.10-4.90(m，2H)，4.63-4.36(m，2H)，4.17-4.12(m，1H)，3.88-3.68(m，1H)，3.64，3.59(2s，3H)，3.40-3.21(m，1H)，3.04-2.59(m，4H)，2.30-2.14(m，1H)，2.05-1.95(3s，9H)，1.70-1.20(m，5H)。MSm/z 589[M+H]+. DCDQ的M6代谢产物
将MeOH(319mL)和H2O(70mL)加入化合物7(5.0g，8.5mmol)的THF(64mL)溶液中。将该溶液冷却至0-5℃(冰水浴)。并在20min内逐滴加入LiOH·H2O(2.1g，51mmol，6eq)的H2O(58mL)溶液
。反应混合物在N2气氛下于0-5℃搅拌2小时。在反相TLC(SiO2-C18 MeCN/H2O，3/7)中监测脱保护进程。反应混合物用H2O(500mL)稀释，并于20℃经加入HOAc(3.1g，51mmol)中和。溶剂于22℃减压下浓缩，并将得到的水混悬液低压冻干，得到M6代谢物粗品(6.2g，100％)。使用Biotage硅胶柱色谱法(Horizon)，2CHCl3/MeOH/H2O作为洗脱液，将粗品化合物(1.2g)进一步纯化，得到M6(400mg)，纯度95％(HPLC)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6，D2O交换)7.13-6.99(m，2H)，6.87-6.80(m，1H)，5.09(d，J＝7.8Hz，1H，β-异构体)，4.77-4.58(m，1H)，4.19-4.12(m，1H)，3.93(m，1H)，3.40-2.87(9m，9H)，2.68-2.60(m，1H)，2.24-1.99(m，3H)，1.63-1.20(m，4H)；13C(75MHz，DMSO-d6)173.3，173.1，154.6，154.0，147.3，132.5，132.4，130.9，130.6，130.1，127.9，127.7，121.4，121.1，96.9，96.3，77.1，76.9，75.3，73.2，72.9，72.6，56.9，56.1，55.6，50.9，50.4，48.7，41.7，35.0，34.9，32.5，32.3，29.8，24.1；LC/MS(ESI)，m/z 449[M+H]+. 参考文献 1.HPLC仪器Waters 2690 样品制备向2mL乙腈中加入2-3滴反应混合物，充分振摇得溶液并进行HPLC分析。
HPLC条件 柱Alltima C18 3μm 7×53mm 柱温25℃ 流动相溶剂A＝1900mL H2O，100mL CH3CN，1mL H3PO4； 溶剂B＝1900mL CH3CN，100mL H2O，1mL H3PO4 表1W2690梯度表 UV215nm 注射体积10μL 2.最终纯化M6的Biotage Flash-12(Horizon)法 流动相 ACHCl3∶MeOH∶H2O(8∶2∶0.2) BCHCl3∶MeOH∶H2O(7∶3∶0.5) 经柱体积表示的梯度(CV，120mL/CV) 2(CV)A 100％ 5(CV)A 100％→B100％ 3(CV)B 100％ 样品载荷将1.2g M6粗品溶于8ml流动相A中，并倾到入samplet中。
流速40mL/min UV254nm 馏份12mL/馏份，总计96份馏份 体外/体内代谢产物研究 DCDQ是有效的5-HT2C激动剂，在一些预测抗精神病活性的动物模型中是有效的，具有非典型抗精神病特性。在这些模型中DCDQ的行为分布与非典型类抗精神病活性一致，并降低锥体外系副作用的易感性。5-HT2C激动剂DCDQ还可以有效治疗与精神分裂症相关的心境障碍或认知缺损。
在体内和体外模型中确定了一些DCDQ的代谢产物。不限于所述途径背后理论的限制，图1-4表明了生成这些化合物的代谢途径。[14C]DCDQ在小鼠、大鼠、犬和人肝微粒体，以及在冷藏保存的人肝细胞中的体外代谢 用来自雄性和雌性CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬的肝微粒体和交叉性别混合的人肝微粒体，以及冷藏保存的男性人肝细胞培养来研究[14C]DCDQ的代谢。使用人肝微粒体，形成主要氧化代谢物M1和氨基甲酰基葡糖苷酸M6的Km值分别为10.8和56.1μM。
在DCDQ的代谢中可见种属差异。在肝微粒体培养中，氧化代谢是DCDQ的主要代谢途径。DCDQ的一些羟基代谢物(M1、M2、M3和M4)在NADPH存在下可在人肝微粒体中检出。在其它种属中未检出代谢物M1。代谢物M2和M3在犬和大鼠中也可见。代谢物M4也可以在大鼠中检出，但是在小鼠和犬中未检出。小鼠中的代谢似乎不如其它种属广泛，并且M2是小鼠肝微粒体中唯一可检出的代谢产物。DCDQ亚胺(M5)的N-氧化物在犬和人中检出，而在小鼠或大鼠肝微粒体中未检出。在所有种属的肝微粒体中DCDQ亚胺(P3)和现在仍不确定的产物P1和P2的形成是非NADPH-依赖性的，并需要进一步研究。在小鼠、大鼠和犬微粒体的培养中未观察到性别差异。
在UDPGA存在下，DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在犬和人中检出，而在小鼠和大鼠肝微粒体中未检出。尽管在NADPH和UDPGA存在下，羟基代谢产物的形成是人肝微粒体的主要代谢途径，但是在人肝细胞中于50μM DCDQ浓度时氨基甲酰基葡糖苷酸是主要的代谢产物。
总之，在微粒体培养和人肝细胞中，DCDQ转化为氧化代谢产物和氨基甲酰基葡糖苷酸。
引言 本研究研究了在肝微粒体和人肝细胞中DCDQ的体外生物转化。研究了细胞色素P450和UDP-葡萄糖苷酸基转移酶的依赖途径，并且DCDQ代谢产物经LC/MS定性。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ盐酸盐(批号L25073-42)由Wyeth Research(PearlRiver，NY)的放射合成小组合成。[14C]DCDQ的放射性化学纯度为98.9％，且经UV检测的化学纯为99.9％。[14C]DCDQ的比活性为222.9μCi/mg(以盐酸盐计)。[14C]DCDQ的化学结构以在14C标记的位置表示。未标记DCDQ盐酸盐(批号PB3312)化学纯为98.6％，由Wyeth Research(Pearl River，NY)合成。除另有说明外，当提到DCDQ或[14C]DCDQ时，均假定为盐酸盐。

冷藏保存的人肝细胞、肝细胞混悬介质和肝细胞培养基自In VitroTechnologies(Baltimore，MD)处获得。肝细胞来自两位男性个体(编号070，57岁及编号DRL，44岁)，经In Vitro Technologies检测，其睾酮6β-羟化酶活性分别为55和43pmol/106个细胞/min。下表2所列的CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠和比格犬的肝微粒体也自得InVitro Technologies。
表2 小鼠、大鼠和犬肝微粒体的特性 来自受试者3、6、15、17、18和19的人肝微粒体由得自IIAM(Exton，PA)的肝制备。由Dr.Andrew Parkinson制备上述微粒体并定性，描述于Parkinson A中。人肝微粒体的制备和定性，Wyeth-AyerstResearch GTR-25617，1994，通过引用并入本文。微粒体制品以250-500μL等份于约-70℃贮存至使用时。下表列出了本研究中所使用的人肝微粒体的特性。
表3 个体人肝微粒体的特性 Ultima Gold、Ultima Flo、Permafluor E+-闪烁鸡尾酒和Carbo-SorbE二氧化碳吸收器购自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。高效液相色谱(HPLC)级水和乙腈购自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。尿核苷5′-二磷酸葡糖醛酸三铵盐(UDPGA)和EDTA购自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。乙酸铵和氯化镁购自MallinckrodtBaker Inc.(Phillipsburg，NJ)。所有其它试剂都是分析级或更高级别的。
方法 培养[14C]DCDQ和小鼠、大鼠、犬和人肝微粒体 [14C]DCDQ同非放射性标记的DCDQ在培养基中混合(1∶3或1∶5)。微粒体培养基包括[14C]DCDQ、氯化镁(10mM)和肝微粒体，后者在0.5mL 0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.4中培养。将[14C]DCDQ(20μL)水溶液加入含有缓冲液、氯化镁溶液和微粒体的培养试管中。混合后，将试管在振摇的水浴中于37℃预温育2分钟。反应自加入UDPGA或NADPH再生系统开始。将UDPGA以20mM水溶液50μL等份加入培养基中，得到的终浓度为2mM。将NADPH再生系统(30μL)加入培养基中以评估CYP450介导的代谢。NADPH再生系统包括葡萄糖-6-磷酸(2mg/mL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(0.8单位/mL)和NADP+(2mg/mL)。对照培养基在同样的条件下进行，除不加入NADPH再生系统、UDPGA或微粒体外。所有培养均一式两份进行。培养通过加入0.5mL冰冷的甲醇而停止。将样品涡旋混合。变性蛋白通过4℃ 4300rpm离心10分钟分离(T21型超速离心机，Sorvall)。蛋白片状沉淀物用0.5mL甲醇提取。将各样品的上清液合并，混合并在氮气流下于Zymark TurboVap LV蒸发仪中(Caliper Life Science，Hopkinton，MA)蒸发至体积为约0.3mL。将浓缩的样品离心，将各等份进行放射性检测，并经HPLC分析。此方法从反应混合物回复平均92.1％的放射性。
在NADPH或UDPGA存在下，测定了用人肝微粒体培养的DCDQ代谢的初始比例条件。培养时间曲线研究包含20μM[14C]DCDQ和0.5mg/mL微粒体蛋白，并在37℃培养伴温和振摇0、5、10、20、30、40、50和60分钟。蛋白依赖性研究用培养20分钟的20μM[14C]DCDQ和0、0.1、0.25、0.5、0.75和1.0mg/mL微粒体蛋白进行。
Km值用0.5mg/mL人肝微粒体测定，所述微粒体与[14C]DCDQ和NADPH再生系统培养20分钟或和UDPGA培养10分钟。使用的[14C]DCDQ的浓度为0.5、1、5、10、25、50、75和100μM。
为在细胞色素P450-和UGT-介导的代谢中评估种属差异，将[14C]DCDQ和0.5mg/mL小鼠、大鼠、犬或人肝微粒体蛋白在NADPH再生系统或UDPGA存在下培养20分钟。测定条件与上述条件相同，并且对于细胞色素P450-和UGT-介导的代谢，DCDQ浓度分别为12μM和56μM。
样品通过放射性流检测和LC/MS分析代谢产物。
人肝细胞制备 含有冷藏保存的人肝细胞的小瓶在37℃水浴中融化，并温和振摇，至冰完全融解。将小瓶从水浴中取出，室温下继续温和振摇30-60秒直至完全融化。将各小瓶中的肝细胞混悬液立即转移至预先冷却的50mL冰上的烧杯中。向各烧杯中逐滴加入12mL冰冷的肝细胞混悬介质，历经1分钟，并用手不时温和振摇，以防止细胞沉降。将细胞混悬液转移至15mL试管中，并于4℃ 100g力离心3min(T21型超速离心机，Sorvall)。弃去上清液，并将片状沉淀重新悬浮于4mL冰冷的肝细胞培养基中。细胞混悬液含有约3.1×106活性肝细胞/mL。使用Trypan Blue排除和血细胞计数器测定的平均活性为76.0％。
培养[14C]DCDQ和人肝细胞 细胞混悬液以1.0mL/孔的浓度分布于12-孔板中。使用来自2位供者的混合肝细胞进行培养。将[14C]DCDQ的水溶液以终浓度10或50μM加入肝细胞混悬液中。培养在充入了5％CO2的温育器中于37℃进行4小时。培养结束时，反应通过加入200μL冷甲醇至各孔中停止。将各孔的内容物转移至15mL离心管中，并声处理30秒。与6mL甲醇涡旋混合并离心后，将上清液转移至干净的试管中并在TurboVap蒸发仪中蒸发至约0.5mL。残余物经HPLC和LC/MS分析。
HPLC分析 装有自动采样器的Waters 2690型HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分离在配有筒式滤器(4×2mm)的PhenomenexLuna C18(2)柱(2×150mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。可调波长UV检测器设置为250nm检测，且带有250μL LQTR流动池的Flo-One β型A525放射性流量探测仪(Perkin Elmer)用来获取数据。Ultima Flow M闪烁液的流速为1mL/min，条件是闪烁鸡尾酒和流动相的混合比率为5∶1。自动采样器的样品室维持在4℃，而柱温为室温，约20℃。流动相包括10mM乙酸铵，pH4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min流出。线性梯度条件如下 表4 液相色谱法/质谱法 Agilent 1100型HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)包括自动采样器和二极管阵列UV检测器，用于LC/MS分析。UV检测器设置为200-400nm检测。对于选择性LC/MS分析，使用装配有固态闪烁流动池的β-Ram 3型放射性流量探测仪(IN/US Systems Inc.，Tampa，FL)来获取放射性色谱图。在与如上所述相同的条件下，分离在Phenomenex Luna C18(2)柱(2×150mm，5μm)上完成。
用于代谢产物定性的质谱仪为Micromass Q-TOF-2极时间-飞行串联质谱仪(Nature Corp.)。所述质谱仪配有电喷射离子化(ESI)接口，并且以阳离子模式操作。碰撞能量设置为5和30eV，分别用于所有MS和MS/MS扫描。质谱仪的设置列于下表中。
表5 数据分析 使用Flo-One分析软件(Perkin Elmer，version 3.6)积分放射性峰。计算机程序Microsoft Excel97用于计算平均和标准偏差，并用于进行t检验。Micromass MassLynx软件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS数据。
结果 测定人肝微粒体Km值 测定人肝微粒体中的初始比例条件和由[14C]DCDQ形成的代谢产物的Km值。在时间-依赖性研究中，形成主要氧化代谢物(M1、M2、M3和M4)的NADPH-依赖性在20分钟内是线性的，并且形成氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在10分钟内是线性的(数据未列出)。在蛋白-依赖性研究中，氧化代谢和氨基甲酰基葡糖苷酸形式直至0.5mg/mL微粒体蛋白都是线性的。在人肝微粒体中，主要氧化代谢物M1和氨基甲酰基葡糖苷酸M6形成的Km值分别是10.8和56.1μM。在人肝微粒体中，代谢物M2、M3和M4形成的Km值为8.9～13.8μM。人肝微粒体中，代谢物M5形成的Km值是36.2μM。
[14C]DCDQ通过小鼠、大鼠、犬和人肝微粒体的代谢 对于微粒体培养中的种属比较，P450-和UGT-介导的代谢的DCDQ浓度分别为12和56μM，该值约与Km值相当。在NADPH再生系统存在下，四个羟基代谢物(M1、M2、M3和M4)用人肝微粒体检测。代谢物M1在其它种属中未检出。代谢物M2和M3用犬和大鼠可观察到。代谢物M4也可在大鼠中检出，但在小鼠或犬中未检出。小鼠似乎没有其它种属的代谢广泛，并且M2是小鼠肝微粒体中唯一可检出的代谢物。DCDQ亚胺的N-氧化物(M5)在犬和人中检出，而在小鼠或大鼠中未检出。三个其它的峰(P1、P2和DCDQ亚胺P3)也可见于微粒体培养物中。P1、P2和P3的形成不是NADPH-依赖性的。由于这些产物在未加微粒体的对照培养基中未形成(数据未列出)，所以它们的形成可以经非P450-酶催化。
在UDPGA存在下，DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸的形成可在犬和人肝微粒体中检出，而在小鼠或大鼠中未检出。当DCDQ(20μM)在NADPH和UDPGA都存在下用人肝微粒体培养时，形成羟基代谢物是主要的代谢途径，并且仅有少量氨基甲酰基葡糖苷酸被检出。在小鼠、大鼠和犬的微粒体培养中未观察到性别差异。
[14C]DCDQ通过人肝细胞的代谢 当DCDQ用人肝细胞培养时，DCDQ浓度为50μM时氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)是最主要的代谢产物。在DCDQ浓度为50μM时，也可观察到氧化代谢产物，尽管相对于氨基甲酰基葡糖苷酸其量较少。含有10μM DCDQ的人肝微粒体培养产生氧化代谢产物，其量接近于氨基甲酰基葡糖苷酸。除在人微粒体培养中形成的代谢物外，还可检出另一种代谢产物(M7)。在微粒体中形成的DCDQ亚胺(p3)也可以在肝细胞培养中观察到。
代谢物经LC/MS分析定性 经LC/MS和LC/MS/MS分析得到DCDQ及其代谢物的质谱。这些化合物的结构确证概括于表6中。
表6 经肝微粒体和肝细胞代谢生成的Dcdq代谢产物 在各研究进行的DCDQ及其代谢产物的质谱定性在下文进一步讨论。
讨论 在DCDQ的代谢中可见种属差异。在肝微粒体培养中，氧化代谢是DCQ的主要代谢途径。在NADPH存在下，DCDQ的一些羟基代谢物(M1、M2、M3和M4)可在人肝微粒体中检出(图1)。代谢物M2和M3也可在犬和大鼠肝微粒体中观察到。小鼠没有其它种属的代谢广泛，且M2是小鼠肝微粒体中唯一可检出的代谢产物。DCDQ亚胺的N-氧化物(M5)可在犬和人微粒体培养基中检出，而在小鼠或大鼠肝微粒体中未检出。在UDPGA存在下，DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在犬和人中检出，而在小鼠或大鼠中未检出。氨基甲酰基葡糖苷酸M6是人肝细胞中DCDQ浓度50μM时的主要代谢产物，而羟基代谢物是NADPH和UDPGA二者都存在时人肝微粒体中的主要代谢途径。除P450外的酶系统也可以通过形成DCDQ亚胺(P3)和其它产物(P1和P2)促进DCDQ代谢。产物P1、P2和P3的形成是非NADPH-依赖性的，并需要进一步研究，因为它们通常存在于所有肝微粒体和肝细胞的培养基中。在小鼠、大鼠或犬的微粒体培养基中未观察到性别差异。
总之，在微粒体培养基和人肝细胞中DCDQ转化为氧化代谢产物和氨基甲酰基葡糖苷酸。
单剂量(5mg/kg)口服灌胃给药后，[14C]DCDQ在雄性和雌性SD大鼠中的体内代谢 概要 本研究研究了单剂量口服给药(5mg/kg)后，[14C]DCDQ在雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠的体内代谢。给药后2、4、8和24小时从雄性大鼠及给药后2和8小时从雌性大鼠采集血液、血浆和脑。给药后0-8和8-24小时间隔从雄性大鼠收集尿液和粪便。
在雄性大鼠中，在给药后2、4、8和24小时，血浆放射性浓度分别为632±144、659±16.5、465±43.1和46.9±8.30ng当量/mL。对于雌性大鼠，给药后2小时，平均血浆放射性浓度为658±189ng当量/mL，与雄性大鼠相似，而给药后8小时的平均血浆放射性浓度为338±60.7ng当量/mL，低于雄性大鼠。给药后2-8小时的平均血液/血浆比值为约1.1，表明DCDQ及其代谢产物有限分配进入血细胞。
给药后2-8小时DCDQ代表平均13％-20％血浆放射性。由于放射性浓度较低，未分析24小时血浆样品曲线。代谢物曲线的变化随时间不明显。在血浆中检出的代谢物包括羟基DCDQ代谢物(M1、M2、M3、M4和M10)、酮类DCDQ(M7)以及II相代谢产物DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二脱氢DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羟基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及乙酰化羟基DCDQ(M11)。血浆代谢产物特征出现性别相关性差异。在雌性大鼠中，羟基DCDQ代谢物(M3)、羟基DCDQ硫酸酯(M8)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基磺酸酯(M12)是主要的代谢产物，而在雄性大鼠血浆中，羟基DCDQ代谢物(M1、M2和M3)、酮类DCDQ(M7)和羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)是主要代谢产物。主要的性别差异是在硫酸酯或氨基磺酸酯的形成中。
尿排泄是口服给予DCDQ的主要消除途径，为给药量的66.7％。在血浆样品中观察到的主要代谢产物在尿液中也被检出，其中DCDQ的量低于给药量的1％。在尿液中羟基代谢物(M1和M3)、酮类DCDQ(M7)及葡糖苷酸(M9)是主要的代谢产物。给药量活性平均21.1％在粪便中回复。在雄性大鼠粪便中可检出代谢产物M3、M8、M9、M10、M11和仅有痕量的DCDQ。
给药后2、4和8小时，脑组织中的放射性明显高于血浆中的。给药后2、4、8和24小时，雄性大鼠脑部的放射性浓度分别为5.12±1.28、4.94±0.44、3.25±0.99和0.037±0.002μg当量/g组织，而雌性大鼠给药后2和8小时的浓度分别为6.38±2.22和2.85±0.68μg当量/g组织。给药后2-8小时平均脑/血浆的放射性比率为6.9-9.6，表明被脑组织显著吸收。给药后24小时，平均脑/血浆放射性比率降低至0.8。给药后2-8小时，对于雄性和雌性大鼠DCDQ表示有平均超过脑放射性的90％。根据脑放射性的放射性浓度和色谱分配，估算平均脑/血浆的DCDQ比率为49.9-56.1。给药后2-8小时，随时间没有明显的性别差异或改变。在雄性或雌性大鼠脑中仅检出少量代谢产物M1、M3、M7、M10和M11。上述数据表明DCDQ很容易穿过血脑屏障，而吸收进入脑组织的代谢产物是有限的。脑/血浆放射性比率也表明从脑部的清除在给药后8小时快速发生，因为比率在给药后24小时从6.9降至0.8。
总之，DCDQ在大鼠中广泛代谢为主要氧化产物。对于DCDQ及其氧化代谢物的硫酸酯和氨基磺酸酯缀合物，雄性和雌性大鼠的血浆曲线不同。在脑中，DCDQ是相关成分的主要药物，而仅检出少量代谢产物，并且性别差异不明显。DCDQ很容易穿过血脑屏障，而代谢产物的吸收受限于少量的氧化代谢物。
引言 以前的质量平衡研究显示在大鼠中尿液是主要的排泄途径，在尿液中给药量放射性回复平均为64.3％。肝微粒体的体外研就显示氧化代谢是大鼠中DCDQ的主要代谢途径。(Iwasaki K，Shiraga T，TadaK，Noda K，Noguchi H.Age-and sex-related changes in aminesulphoconjugation in Sprague-Dawley strain rats.Comparison withphenol and alcohol sulphoconjugations.Xenobiotica.1986；16717-723.)。本研究研究了大鼠中单剂量口服给予5mg/kg后[14C]DCDQ的代谢。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ盐酸盐由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小组合成，如在上文讨论的体外研究中所述。Ultima Gold、UltimaFlo、Permafluor E+-闪烁鸡尾酒和Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器购自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。聚山梨醇酯80得自Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)，以及甲基纤维素来自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色谱分析用溶剂是HPLC或ACS试剂级的，来自EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 药物给予和标本收集 剂量配制、动物给药和标本收集在Wyeth Research，Collegeville，PA进行。药物赋形剂包含2％(w/w)吐温80和0.5％甲基纤维素的水溶液。给药当天，[14C]DCDQ(12.2mg)和未标记的DCDQ(36.5mg)溶于赋形剂中以使终浓度为约2mg/mL。
给药时，雄性大鼠体重为218-345g，雌性大鼠为227-255g，均购自Charles River Laboratories，Wilmington，MA。未禁食大鼠通过灌胃法一次性给予5mg/kg(～300μCi/kg)DCDQ，体积为2.5mL/kg。给予动物Purina大鼠饲料，任意饮水，并分开关在代谢笼中。雄性大鼠在给药后2、4、8和24小时处死。雌性大鼠在给药后2和8小时处死。
处死时，经心脏穿刺将血样收集于含有EDTA(作为抗凝血剂)的试管中，并将其置于冰上。取出50μL等份用于氧化并测定放射性含量。将剩余的血液于4℃离心立即得到血浆。用50mL已冷冻的无菌盐水灌注后，分离脑。给药后在0-8和8-24小时间隔在干冰上收集尿样。给药后在0-8和8-24小时间隔于室温收集粪便，并如前所述制成匀浆。生物标本和给药前后的药物溶液贮存于约-70℃至分析时。
放射性测定 血浆(20μL)和尿液(50μL)等份用于分析放射性浓度。用Tri-Carb 3100型TR/LL液体闪烁计数器(LSC)(Perkin Elmer)，使用10mL Ultima Gold作为闪烁液，测定药物、血浆和尿液的放射性。
脑和粪便样品称重，并以体重/重量比率分别约为1∶1和5∶1在水中均质化。将血液等份(50μL)、脑匀浆(0.1g)和粪便匀浆(0.2g)置于带有Combusto-垫的Combusto-cone中并氧化。307型Tri-Carb样品氧化器，配有Oximate-80自动取样器(Perkin Elmer)，用于氧化。释放的14CO2吸收入Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器中，与PermaFluorE+液体闪烁鸡尾酒混合，并用Tri-Carb 3100型TR/LL液体闪烁计数器(Perkin Elmer)计数。此氧化剂的氧化效率为98.2％。
带有250μL LQTR流动池的Flo-One β型A525放射性检测器(Perkin Elmer)用于HPLC的线内放射性检测。Ultima Flow M闪烁液的流速为1mL/min，条件是闪烁鸡尾酒/流动相的混合比率为5∶1。检测限为约1ng当量/g脑、2ng当量/mL血浆、5ng当量/g粪便和10ng当量/mL尿液。
剂量分析 给药前后的溶液等份用25％甲醇水溶液稀释，并如上所述分析放射性浓度。在10μL稀释液中的约100,000DPM经HPLC分析放射性纯度和化学纯度。为测定药物混悬液的比活性，非放射性标记的DCDQ溶于甲醇中，用25％甲醇水溶液稀释，同时经HPLC分析以得到标准曲线。稀释的药物溶液等份(10μL)注入HPLC柱中，UV检测后以1分钟的间隔收集馏份。测定各馏份中的放射性。还收集空白注射的馏份以得到放射性的背景水平。
血浆代谢产物特征 经HPLC分析血浆样品以得到代谢产物。1.5mL血浆等份与3.0mL甲醇混合，置于冰上约10分钟，然后离心。将上清液转移至干净的试管中。蛋白片状沉淀用3.0mL甲醇提取一次。将来自沉淀和提取后的各样本的上清液合并、混合，并在氮气下于22℃在Zymark TurboVapLV(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸发至约0.3mL。将浓缩的提取物离心，测定上清液体积，并通过分析一式两份10μL等份的放射性测定提取效率。上清液(50-200μL)等份用带有放射性流检测器的HPLC分析。血浆提取物也经LC/MS分析。
分析粪便和尿液 粪便匀浆用于分析代谢产物。粪便匀浆1g等份与2mL甲醇混合，置于冰上约10分钟并离心。将上清液转移至干净的试管中。残余物用2mL水∶甲醇(3∶7)混合物提取三次。将各样本的上清液合并，蒸发至约1mL，并离心。通过分析10μL上清液等份的放射性来测定提取效率。上清液(50-200μL)等份用带有放射性流检测器的HPLC分析特征。样本也用LC/MS分析以定性放射性峰。
通过直接注入HPLC柱中分析尿液的放射性浓度及分析代谢产物特征。也用尿样进行代谢产物鉴别的LC/MS分析。
脑中的代谢产物特征 脑匀浆用于分析代谢产物特征。1g脑匀浆等份与等体积甲醇混合，置于冰上约10分钟并离心。将上清液转移至干净的试管中。残余物用1mL甲醇提取三次。将各样本的上清液合并，蒸发至约0.5mL，并离心。通过分析10μL上清液等份的放射性测定提取效率。上清液(100-200μL)等份用带有放射性流检测器的HPLC分析特征。样本也用LC/MS分析以定性放射性峰。
高效液相色谱法 带有自动采样器的Waters 2690型HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分离在Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2.0mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自动采样器的样品室维持在4℃，而柱为室温约20℃。可调波长UV检测器设置为250nm检测，且上述Flo-One β型A525放射性检测器用于获取数据。HPLC流动相包括10mM乙酸铵，pH 4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min流出。色谱条件A用于药物分析，而条件B用于分析尿液和血浆，脑和粪便提取物。
表7 条件A 条件B LC/MS分析 Agilent 1100型HPLC系统(Agilent Technologies，Wilmington，DE)包括自动采样器和二极管阵列UV检测器，用于血样和尿样的LC/MS分析。UV检测器设置为200-400nm检测。对于选择性LC/MS分析，使用装配有固态闪烁流动池的β-Ram 3型放射性流量探测仪(IN/US Systems Inc.，Tampa，FL)来获取放射性色谱图。粪便样本也使用Waters Alliance 2690型HPLC系统分析。其装配有内置自动采样器和设置为210-350nm的996型二极管阵列UV检测器。在Radiomatic 150TR型流量闪烁分析仪(Perkin Elmer)和质谱仪之间分裂HPLC流。其它HPLC条件与上述条件B相同。
用于血浆和尿液代谢产物定性的质谱仪为Micromass Q-TOF-2四极时间-飞行串联质谱仪(Waters)。所述质谱仪配有电喷射离子化(ESI)接口，并且以阳离子模式操作。碰撞能量设置为5和30eV，分别用于所有MS和MS/MS扫描。质谱仪的设置列于下表中。
表8 Micromass Quattro Micro质谱仪(Waters)也用于分析粪便样品。其装配有电喷射离子化(ESI)接口，并且以阳离子模式操作。质谱仪的设置列于下表中。
表9 在选择性反应-监测(SRM)模式(LC/SRM)中的LC/MS/MS用三联四极质谱仪进行以监测粪便样本中的DCDQ及其代谢产物。转化监测列于下表中。
表10 数据分析和统计学评估 使用Flo-One分析软件(Packard，version 3.6)积分放射性峰。计算机程序Microsoft Excel97用于计算平均值和标准偏差，并用于进行t检验。Micromass MassLynx软件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS数据。
结果 药物分析 药物溶液中[14C]DCDQ的放射性化学纯度和估算的化学纯度(经紫外检测)分别为99.0±0.3％和99.6±0.1％。给药前后的等份具有相同的纯度。药物溶液中[14C]DCDQ的比活性为48.2μCi/mg(以盐酸盐计)。平均药物浓度为2.48mg/mL(以盐酸盐计)或2.14mg/mL(以游离碱计)。DCDQ给予的实际剂量为5.2-5.4mg/kg(以游离碱计)或6.1-6.3mg/kg(以盐酸盐计)。
血浆放射性浓度和代谢产物特性 单剂量口服给予[14C]DCDQ后血液和血浆中的放射性浓度概括于表11中。
表11 单剂量口服给予大鼠[14C]DCDQ 5Mg/Kg后放射性的血液和血浆浓度(ng当量/mL) ＊8小时时明显低于雄性，p＜0.05 在雄性大鼠中，给药后2、4、8和24小时，平均血浆放射性浓度分别为632、659、465和46.9ng当量/mL。雌性大鼠中，给药后2小时，平均血浆放射性浓度为658ng当量/mL，与雄性大鼠相似，而给药后8小时的平均血浆放射性浓度为338ng当量/mL，明显低于雄性大鼠。所有时间点，血液样品的放射性浓度稍高于血浆样品。平均血液/血浆放射性比率是约1.1(雄性和雌性大鼠给药后2、4和8小时)～约1.5(雄性大鼠给药后24小时)，表明DCDQ或其代谢产物分布进入血细胞是有限的(表12)。
表12 单剂量口服给予大鼠[14C]DCDQ 5Mg/Kg后血液/血浆的放射性比率 由2、4和8小时样品，血浆提取物含有平均82-96％总血浆放射性。由于放射性浓度较低，未获得24小时血浆样本的代谢产物特征。DCDQ在大鼠中被广泛代谢。母体药物表示在血浆提取物中平均13-20％总放射性，在雄性和雌性之间或随时间无明显差异(表13和14)。一些羟基DCDQ代谢物(M1、M2、M3、M4和M10)和酮类DCDQ(M7)可在血浆中检出(图1)。血浆中可观察到的II相代谢产物包括DCDQ氨基磺酸酯(M12，仅在雌性血浆中是主要的)、二脱氢DCDQ氨基磺酸酯(M14，仅在雌性血浆中是主要的)、羟基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化羟基DCDQ(M11)(图1)。血浆放射性的分配百分比不随时间明显变化，除代谢物M8外，其在给药后8小时明显较低。在雄性大鼠中，代谢物M1、M2、M3、M7和M9是主要的代谢产物，而在雌性大鼠中M3、M8、M9和M12是主要代谢产物，表明在代谢产物特征中的性别差异(表13和14)。许多在血浆提取物中检出的相对少量的代谢产物未被定性，尽管当合并时代表了19-38％的血浆放射性。根据分配百分比各代谢产物的血浆浓度列于表4中。DCDQ的浓度通常等于或超过雄性和雌性大鼠血浆中各代谢产物的浓度。在雄性大鼠中，代谢产物M1、M3+M9和M7呈现最高浓度，而在雌性大鼠中，代谢产物M3+M9和M8是较主要的代谢产物。
表13 口服给予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，大鼠血浆中放射性的色谱分布(％) a包括10个以上其它未确定的量少的代谢产物 d明显不同于雄性，p＜0.01 b标准偏差(n＝3) e明显不同于雄性，p＜0.05 cBOL，定量限(2ng当量/mL血浆)下 表14 口服给予[14C]DCDQ(5mg/kg)a后大鼠中DCDQ及代谢产物的估算的血浆浓度(Ng当量/M1) a根据总血浆放射性浓度(表14)和血浆放射性的 d明显不同于雄性，p＜0.01 分配百分比(表13)估算浓度e明显不同于雄性，p＜0.05 b标准偏差(n＝3) cBOL，定量限(2ng当量/mL血浆)下 尿液排泄和代谢产物特性 尿液是排泄的主要途径，给药后的第一个24小时内在尿样中，有66.7±5.0％的放射性药物回复，0-8小时期间有32.5％，以及在8-24小时期间有34.2％。多数主要血浆代谢产物也在尿液中检出(表15)。雄性大鼠尿液中的主要代谢产物包括羟基DCDQ代谢物(M1、M2、M3和M4)、酮类DCDQ(M7)和羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)(表15)。0-24小时内尿液的各代谢产物代表约2-16％的给药量(表16)，而DCDQ代表低于给药量的1％。0-8小时和8-24小时收集的样本中，代谢产物的分布相似。
表15 口服给予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，雄性大鼠尿液中放射性的色谱分布(％) a至少10个另外的量少的代谢产物 b标准偏差(n＝3) 表16 口服给予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，大鼠中尿液代谢产物的剂量百分比 a标准偏差(n＝3) 粪便排泄和代谢产物特征 在雄性大鼠给药后第一个24小时内粪便消除为21.1±2.1％给药量放射性回复。8-24小时粪便样本的提取效率为64.3％，而在对照粪便匀浆中平均89.5％的放射性是从[14C]DCDQ的培养中提取的。羟基DCDQ代谢物(M3和M4)、羟基DCDQ硫酸酯(M8)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化羟基DCDQ(M11)在8-24小时粪便提取中是主要代谢产物，而仅检出痕量母体药物。因为其放射性低(低于给药量放射性的0.1％)，未获得0-8小时粪便样本中的代谢产物特征。粪便匀浆中的[14C]DCDQ于37℃培养24小时显示无可检出的降解。脑中的放射性含量和代谢产物特征 脑组织中平均84.5％的放射性被提取。给药后8小时，脑放射性浓度较血浆高，并且DCDQ在大鼠脑中是主要的药物相关性成分。雄性大鼠给药后2、4和8小时在脑提取物中，DCDQ表示平均超过90％的放射性，并且雌性大鼠给药后2和8小时超过94％(表17)。雄性和雌性大鼠脑中的平均放射性浓度是相似的，且从2小时(雄性和雌性大鼠分别为5.1和6.4μg当量/g)到8小时(雄性和雌性大鼠分别为3.2和2.8μg当量/g)仅轻度降低。24小时时，雄性大鼠脑浓度为平均0.04μg当量/g，较血浆中低。给药后2-8小时平均脑/血浆放射性比率雄性大鼠为6.9-8.2，雌性大鼠为8.7-9.6，且24小时雄性大鼠的降低至0.8。雄性和雌性大鼠的脑放射含量或脑/血浆放射性比率没有明显差异。脑/血浆DCDQ比率较放射性比率高得多(表17)。平均脑/血浆DCDQ比率为49.9-56.1，不取决于时间或性别。在雄性和雌性大鼠脑中仅检出少量代谢产物M7、M10和M11，并且各代谢产物表示平均低于4.5％的脑放射性。另外两个量少的代谢产物(M1和M3)在雄性大鼠脑中可见。给药后8小时，多数代谢产物检测不出，且仅可见DCDQ。
表17 口服给予大鼠[14C]DCDQ(5mg/kg)后，相对于血浆浓度，脑中放射性和DCDQ的浓度a a数据用平均值±SD表示，N＝3 bDCDQ浓度根据脑中的总放射性浓度和脑放射性分布百分比估算。
c数据未得到，浓度低于特征水平 经LC/MS分析定性代谢产物 经LC/MS和LC/MS/MS分析DCDQ及其代谢产物获得质谱。这些化合物的结构定性概括于表18中。DCDQ及其代谢产物的质谱定性与本文中所述的其它研究的定性在下文讨论。
表18 经LC/MS分析大鼠中Dcdq的代谢产物 aLC/MS保留时间被标准化为LC/MS数据文件GU_071803_0003和GU_081303_0002。
bP＝血浆；U＝尿液；B＝脑；F＝粪便。粪便代谢产物通过选择性反应监测检测。
讨论 单剂量口服给予5mg/kg后，DCDQ在大鼠中被广泛代谢，并且氧化代谢是主要的代谢途径。DCDQ表示给药后2-8小时有平均13-20％血浆放射性，并且在给药后0-8和8-24小时总计有低于2％的尿液放射性。血浆中可见的代谢产物包括羟基DCDQ代谢物(M1、M2、M3、M4和M10)，酮类DCDQ(M7)和II相代谢产物如DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二脱氢DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羟基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化羟基DCDQ(M11)(图1)。血浆中放射性的分布百分数不随时间而明显改变，除代谢产物M8外，其在给药后8小时较2和4小时明显降低。血浆代谢产物分布在雄性和雌性大鼠中出现差异。在雌性大鼠中羟基DCDQ代谢物(M3)、羟基DCDQ硫酸酯(M8)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基磺酸酯(M12)是主要的代谢产物，而在雄性大鼠血浆中羟基DCDQ代谢物(M1、M2和M3)、酮类DCDQ(M7)和羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)是主要的代谢产物。主要的性别差异是在硫酸酯或氨基磺酸酯的形成中。这些性别差异是可预测的，因为已有报道称硫转移酶对乙醇和脂环族胺的活性在雌性大鼠中较雄性大鼠中明显升高。(Naritomi Y，Niwa T，Shiraga T，Iwasaki K，Noda K.Isolationand characterization of an alicyclic amine N-sulfotransferase fromfemale rat liver.Biological & Pharmaceutical Bulletin.1994；71008-1011.) 多数主要血浆代谢物还可在尿液中检出。0-8小时和8-24小时尿样获得相似的分布。雄性大鼠尿液中的主要代谢产物包括羟基DCDQ代谢产物(M1、M2、M3和M4)、酮类DCDQ(M7)和羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)。0-24小时尿液中各分别的代谢产物代表约用药量的2-16％，而DCDQ代表少于1％的剂量。8-24小时的粪便样本中，羟基DCDQ代谢产物(M3和M4)、羟基DCDQ硫酸酯(M8)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化羟基DCDQ(M11)是可观察到的主要代谢产物，仅有痕量母体药物可检出。
给药后2、4和8小时，脑组织中的放射性明显高于血浆中的。DCDQ说明雄性和雌性大鼠有平均高于90％的脑活性。给药后2-8小时平均脑/血浆放射性比率为6.9-9.6，表示被脑组织吸收。给药后24小时，平均脑/血浆放射性比率降低至0.8。雄性和雌性大鼠之间，脑放射性含量或脑/血浆放射性比率没有明显差异。平均脑/血浆DCDQ比率为49.9-56.1，没有性别差异或给药后2-8小时不随时间变化。在雄性和雌性大鼠脑中检出少量代谢产物M7、M10和M11。这些数据表明DCDQ很容易通过血脑屏障，而吸收进入脑组织的代谢产物是有限的。脑/血浆放射性比率也表明给药后8小时很容易发生从脑中的清除，因为给药后24小时比率从6.9降至0.8。尽管放射性分配进入脑中是明显的，但是分配进入血细胞是有限的，给药后2-8小时的血液/血浆比率仅为约1.1。
相对于前面的大鼠肝微粒体体外研究，本研究中DCDQ的代谢似乎更广泛。大鼠肝微粒体研究中仅可观察到三种氧化代谢产物(M2、M3和M4)，并且未见性别差异。但是，在大鼠中可见的硫酸酯和氨基磺酸酯形成的性别差异在任何体外系统中均未观察到。除用大鼠肝微粒体可检出的代谢产物M2、M3和M4外，在大鼠中还观察到其它氧化代谢产物(M1、M7和M10)及一些II相代谢产物(M8、M11、M12、M13和M14)(图1)。
总之，DCDQ在大鼠中广泛代谢为主要的氧化代谢产物。雄性和雌性大鼠中血浆分布的差异在于DCDQ和一些氧化代谢物的硫酸酯和氨基磺酸酯缀合物。DCDQ是脑中与组分相关的主要药物，尽管仅可观察到少量代谢产物，并且性别差异并不明显。DCDQ很容易穿过血脑屏障，而代谢产物的吸收受限于少量的氧化代谢物。
单剂量(15mg/kg)口服给予胶囊后， [14C]DCDQ在雄性犬中的体内代谢 概要 本研究研究了单剂量给予[14C]DCDQ盐酸盐肠溶胶囊14.1-16.7mg/kg后，[14C]DCDQ在四只雄性比格犬中的代谢。给药后2、4、8、24和48小时收集血浆样品。粪便和尿液在给药后0-8、8-24和24-48小时间隔收集。样品用于分析放射性含量和代谢产物分布。
给药后2、4、8、24和48小时的放射性血浆浓度分别为422±573、564±748、528±566、1340±508和507±135ng当量/mL。血浆放射性浓度中可观察到较大的个体差异，给药后2、4和8小时为4-1640ng当量/mL。最高的血浆放射性浓度发生在24小时，除2号犬的发生在给药后4小时外。数据与在给药后第一个24小时内观察到的放射性排泄物的变化一致。这种差异与DCDQ在一些犬中的吸收缓慢和延长及肠溶胶囊有关。犬的平均血液/血浆放射性比率为约0.72。
DCDQ在犬中被广泛代谢。氧化代谢是主要的代谢途径，尽管也可观察到DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸。DCDQ代表在2和4小时的1.9％-21％血浆放射性，在8和24小时时低于3％，在给药后48小时未检出。DCDQ说明在所有时间段尿液放射性平均低于11％。在粪便提取物中，54％-97％的放射性归于母体药物。在2和4小时内观察到的主要代谢产物包括羟基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮类DCDQ(M7)、羟基DCDQ亚胺(M15)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)(图1)。代谢物M3和M9代表给药后8、24和48小时的大多数血浆放射性。代谢物M2、M3、M5和M6在NADPH存在下的犬肝微粒体DCDQ的体外培养中也可观察到。犬血浆中可观察到的代谢物在犬尿液中也可检出，除代谢物M7外。在血浆中未检出的羟基DCDQ硫酸酯缀合物(M16)和二氮杂基DCDQ羧酸(M17)，在尿样中可观察到。羟基DCDQ代谢物(M2、M3和M19)、酮类DCDQ(M18)和羟基DCDQ亚胺(M15)在粪便提取物中检出。DCDQ的广泛代谢和延长的口服吸收也许说明在犬中的口服生物利用度相对低，约25.4％。
犬中DCDQ的代谢与大鼠中的有所不同。在大鼠和犬中可观察到一些不同的氧化代谢产物。氧化代谢产物M15、M16、M17、M18和M19在大鼠中未观察到，而在大鼠中可观察到的羟基代谢物M4在犬中未检出。大鼠中可观察到的II相代谢物较犬中的多。硫酸酯M8和M13以及氨基磺酸酯M12和M14可在大鼠中观察到，而在犬中未观察到。硫酸酯M16可在犬中观察到，而在大鼠中未观察到。在犬血浆和尿液中可检出的DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸，在大鼠血浆或尿液中未观察到。
总之，DCDQ在犬中被广泛代谢，氧化代谢是主要代谢途径，尽管也可观察到DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸的形成。
引言 质量平衡研究显示平均64.3％的口服剂量在大鼠中通过尿液排泄，而在犬尿液中给予肠溶胶囊后剂量的32.7％被回复。当在NADPH和UDPGA存在下，用犬肝微粒体培养时，[14C]DCDQ被转化为一些氧化代谢物和氨基甲酰基葡糖苷酸。前文大鼠代谢研究显示DCDQ被广泛代谢并且氧化代谢是大鼠中的主要代谢途径。本研究研究了单剂量口服给予犬胶囊后[14C]DCDQ的代谢。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ盐酸盐由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小组合成，如在上文的体内研究中所述。Ultima Gold、Ultima Flo、Permafluor E+-闪烁鸡尾酒和Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器购自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。EDTA得自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色谱分析用溶剂是HPLC或ACS试剂级的，来自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 胶囊制备和分析 约11mg[14C]DCDQ盐酸盐和940mg未标记的DCDQ盐酸盐溶于甲醇中，然后在氮气气流下蒸发至干燥。根据动物体重，用精确量(126.7-138.1mg)药物混合物填充胶囊(#2)。然后手工将已填充的胶囊包肠溶衣。
在额外胶囊中的药品用于分析放射性化学纯和比活性。一等份药品溶于DMSO中，用水稀释，并经配有放射性流量检测和UV检测的HPLC于250nm处分析。为测定比活性，通过稀释原溶液的甲醇溶液配制五种不同浓度的未标记的DCDQ，并经HPLC分析以得到标准曲线。将[14C]DCDQ的UV峰积分以计算DCDQ相对于标准曲线的量。UV检测后每间隔1分钟收集[14C]DCDQ峰周围的馏份。各馏份中的放射性经液体闪烁计数(LSC)测定。也收集空白注射的馏份以获得放射性的背景水平。
药物给予和标本收集 四只雄性犬，给药时体重为7.6-9.8kg，均来自于内部集团。各犬给予一粒含有[14C]DCDQ(以盐酸盐计)的肠溶胶囊。给药2小时前喂食动物，并给予Purina犬粮，任意饮水，并分开关在代谢笼中。
给药后2、4、8、24和48小时从颈静脉收集血样至含有EDTA钾(作为抗凝剂)的试管中并置于冰上。取出50μL等份用于氧化并测定放射性含量。将剩余血液于4℃离心立即得到血浆。给药后0-8、8-24和24-48小时间隔收集尿样至干冰上的试管中。给药后0-8、8-24和24-48间隔于室温收集粪便样品，并将其制成匀浆。生物样品于约-70℃贮存至分析时。
放射性测定 血浆50μL等份和尿液100-200μL等份用于分析放射性浓度。剂量、血浆和尿液的放射性测定用Tri-Carb 3100型TR/LL LSC进行，使用5-10mL Ultima Gold作为闪烁液体。
将粪便称重，并和水以体积/重量比率为约5∶1制成匀浆。血液等份(200μL)和粪便匀浆(0.25-0.53g)置于带有Combusto-垫的Combusto-cone中并氧化。307型Tri-Carb样品氧化器，配有Oximate-80自动取样器(Perkin Elmer)，用于氧化血样和粪便样品。释放的14CO2吸收入Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器中，与PermaFluorE+液体闪烁鸡尾酒混合，并用Tri-Carb 3100型TR/LL液体闪烁计数器(PerkinElmer)计数。此氧化剂的氧化效率为98.9％。
对于血浆分布，使用TopCount NXT放射测量全自动定量绘图酶标仪(Perkin Elmer)来分析收集的HPLC馏份中的放射性。TopCount的检测限为约1ng当量/mL。Flo-One β型A525放射性检测器(PerkinElmer)，配有250μL LQTR流动池，用于获得尿样和粪便样品的数据。Ultima Flow M闪烁液体的流速为1mL/min，条件是闪烁鸡尾酒/流动相的混合比例为5∶1。Flo-One检测器的检测限为约200ng当量/mL尿液和12ng当量/g粪便。
血浆代谢产物分布 血浆样品用于经HPLC分析代谢产物分布。血浆等份与两倍体积的冷的含有0.1％三氟乙酸(TFA)的甲醇混合，置于冰上约2分钟，然后离心。将上清液转移至干净的试管中，并在氮气下于22℃在Zymark TurboVap LV(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸发至体积为约0.3mL。将残余物离心，测定上清液的体积，并通过分析放射性等份20μL一式两份测定提取效率。200μL等份上清液注入HPLC柱中，并以20秒的间隔将流出液收集至96-孔Lumaplates(PerkinElmer)中。将板在烘箱中于40℃干燥过夜，并用TopCount分析。血浆提取物也经LC/MS分析。
粪便和尿液分析 粪便匀浆用于分析代谢产物分布。1g等份粪便匀浆与2mL甲醇混合，置于冰上约10分钟并离心。将上清液转移至干净的试管中。残余物用2mL水∶甲醇(3∶7)的混合物提取三次。合并来自各样品的上清液，蒸发至约1mL并离心。通过分析10μL等份上清液的放射性来测定提取效率。一等份(50-200μL)上清液经配有放射性流量检测的HPLC来分析代谢产物分布。样本也通过LC/MS分析以定性放射性峰。
尿液用于分析放射性浓度，并通过直接注入HPLC柱，经配有放射性流量检测的HPLC来分析代谢产物分布。代谢产物定性的LC/MS分析也采用尿样进行。
高效液相色谱法 带有自动采样器的Waters 2690型HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分离在Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2.0mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自动采样器的样品室维持在4℃，而柱为室温约20℃。可调波长UV检测器设置为250nm检测，且上述Flo-One β型A525放射性检测器用于获取数据。流动相包括10mM乙酸铵，pH4.5(A)和乙腈(B)，并以0.2mL/min流出。色谱条件A用于药物分析，而条件B用于分析尿液和血浆，脑和粪便提取物。
表19 条件A 条件B LC/MS分析 Agilent 1100型HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)包括自动采样器和二极管阵列UV检测器，用于LC/MS分析。UV检测器设置为200-400nm检测。对于选择性LC/MS分析，使用装配有固态闪烁流动池的β-Ram 3型放射性流量探测仪(IN/US Systems Inc.，Tampa，FL)来获取放射性色谱图。LC条件与与上述条件B相同。
用于代谢产物定性的质谱仪为Micromass Q-TOF-2四极时间-飞行串联质谱仪(Waters)。所述质谱仪配有电喷射离子化(ESI)接口，并且以阳离子模式操作。碰撞能量设置为5和30eV，分别用于所有MS和MS/MS扫描。质谱仪的设置列于下表中。
表20 数据分析和统计学评估 使用Flo-One分析软件(Packard，version 3.6)积分放射性峰。DataFlo应用软件(Perkin Elmer，β0.55版)用于将来自TopCount NXT微量培养板计数的ASCII文件转换为CR格式，在Flo-One分析软件中进行处理。计算机程序Microsoft Excel97用于计算平均值和标准偏差，并进行t检验。Micromass MassLynx软件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS数据。
结果 胶囊含量分析 装在胶囊中的[14C]DCDQ具有的平均放射性化学纯度为约98.9％，化学纯度(经紫外检测)超过99％。胶囊中的[14C]DCDQ的比活性为2.18μCi/mg(以盐酸盐计)。实际给予的DCDQ的剂量为12.2-14.4mg/kg(以游离碱计)。
血浆放射性浓度和代谢产物分布 单剂量给予[14C]DCDQ胶囊后血液和血浆中的放射性浓度概括于表21中。
表21 单剂量口服给予15mg/kg[14C]DCDQ肠溶胶囊后，犬中放射性的血液和血浆浓度(Ng当量/Ml) a犬的数量 平均血浆放射性浓度为423ng当量/mL(给药后2小时)～1340ng当量/mL(给药后24小时)。最高的放射性浓度通常发生在给药后24小时，除2号犬外，其浓度在给药后4小时为最高。可见血浆放射性浓度存在较大的个体差异，给药后2、4和8小时的范围是4-1640ng当量/mL。数据与在给药后第一个24小时观察到的排泄物放射性的巨大的差异一致。这些差异可能与DCDQ在一些犬中的吸收缓慢和延长有关。血液放射性浓度较血浆放射性水平低，并且平均血液/血浆放射性比率为0.68-0.79(表22)。根据这些比率，DCDQ及其代谢产物分配进入血细胞是有限的。
表22 单剂量口服给予15mg/kg[14C]DCDQ肠溶胶囊后，犬中的血液/血浆放射性比率 a犬的数量 b由于放射性浓度较低而未得到数据。
提取回收率高于血浆放射性的71％。DCDQ在犬内被广泛代谢(表23和24)。给药后2和4小时，DCDQ代表血浆放射性的1.9％-21％。在8和24小时，DCDQ代表低于血浆放射性的3％，并且在给药后48小时未检出(表23和24)。在2和4小时血浆中可观察到的主要代谢产物包括羟基DCDQ代谢物(M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮类DCDQ(M7)、羟基DCDQ亚胺(M15)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。由8、24和48小时的血浆样品得到相似的分布，尽管在这些后面的时间点的主要放射性是由于羟基代谢物M3和葡糖苷酸M9，其不能被色谱分离。许多相对少量的代谢产物说明在2和4小时样品中血浆放射性的6.2％-42％。这些代谢产物由于浓度低未被定性。
表23 单剂量口服给予15mg/kg[14C]DCDQ肠溶胶囊后，犬血浆中放射性的色谱分布(百分比)a a未得到3号和4号犬2和4小时，以及4号犬8、24和48小时的样品的分布。
b包括未定性的代谢产物 c未检出 表24 单剂量口服给予15mg/kg[14C]DCDQ肠溶胶囊后，估算的犬内DCDQ及代谢产物的血浆浓度(ng当量/mL)a a未得到3号和4号犬2和4小时，以及4号犬8、24和48小时样品的数据，由于循环的放射性浓度较低；根据总的血浆放射性浓度(表21)和放射性的色谱分布(表23)估算浓度。
b定量检测限(1ng当量/mL血浆)以下。
尿液代谢物分布 尿液是DCDQ在犬中消除的主要途径，尽管粪便排泄高于尿液排泄。多数代谢产物均可在尿液中检出。DCDQ代表平均低于所有时间点的尿液放射性的11％(表25)。主要代谢产物包括羟基DCDQ代谢物(M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、羟基DCDQ亚胺(M15)、羟基DCDQ硫酸酯(M16)、二氮杂基DCDQ羧酸(M17)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)(图1)。
表25 给予含[14C]DCDQ的肠溶胶囊后，犬尿液中放射性的色谱分布(百分比)a a2、3和4号犬的0-8小时样品以及4号犬的0-24小时样品 c包括许多未定性的代谢产物 没有足够的放射性。
d数据未得到 bND，未检出 粪便代谢产物分布 提取平均粪便放射性的70.2％，而在空白粪便匀浆中从[14C]DCDQ培养基提取的放射性平均为88.2％。粪便提取物中，DCDQ是主要的放射性组分，表示总放射性的54.4％-96.7％。粪便中可检出的代谢产物包括羟基DCDQ(M2、M3和M19)、酮类DCDQ(M18)和未定性峰(M20)。在粪便提取物中，最大量的代谢产物M18表示至多总放射性的16.4％。羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在粪便中未检出。粪便匀浆中的[14C]DCDQ于37℃培养24小时显示没有明显的降解(数据未列出)。
经LC/MS分析定性代谢产物 通过LC/MS和LC/MS/MS分析DCDQ及其代谢产物获得质谱。这些化合物的结构定性概括于表26中。来自本文所述的各研究的DCDQ及其代谢产物的质谱特征在下面进一步讨论。
表26 经LC/MS分析确定的犬中DCDQ代谢产物 aLC/MS保留时间被标准化为LC/MS数据文件GU_071803_0003和GU_081303_0002。
b经LC/MS检测和定性的代谢产物基质，P＝血浆；U＝尿液；B＝脑；F＝粪便 讨论 血浆放射性浓度存在较大的个体差异，给药后2、4和8小时为4-1640ng当量/mL。此数据与给药后第一个24小时内观察到的排泄物放射性差异一致。给药后第一个24小时内，尿液排泄在0-25％之间变化，而粪便排泄为用药量放射性的0-23％。血浆放射性最大浓度发生在24小时除2号犬外，其浓度在给药后4小时最大。这种差异与DCDQ在一些犬中的吸收缓慢和延长有关，并且可能与肠溶胶囊有关。与给药后2-8小时大鼠的约1.1相比，犬的平均血液/血浆放射性比率为约0.72，表明DCDQ及其代谢物吸收进入血细胞在犬中较大鼠中低。
如在大鼠中所见，给予含[14C]DCDQ的肠溶胶囊后，DCDQ在犬中被广泛代谢(图1)。氧化代谢是主要的代谢途径，而在大鼠中未观察到的DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸的形成也观察到了。DCDQ在2和4小时代表血浆放射性的1.9-21％，8和24小时低于3％，并且在给药后48小时未检出。DCDQ说明在所有时间点平均低于尿液放射性的11％。在粪便提取物中，放射性的54.4％-96.7％归于母体药物。给药后2和4小时的血浆代谢产物包括羟基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮类DCDQ(M7)、羟基DCDQ亚胺(M15)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)及DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。给药后8、24和48小时的大多数放射性是由于羟基代谢物M3和葡糖苷酸M9，其未被色谱法分离。在NADPH存在下，DCDQ和犬肝微粒体的体外培养中，也可观察到代谢产物M2、M3、M5和M6。犬血浆中观察到的代谢产物在犬尿液中也可检出，除代谢产物M7外。在血浆中未检出的羟基DCDQ硫酸酯缀合物(M16)和二氮杂基DCDQ羧酸(M17)在尿样中可观察到。羟基DCDQ代谢物(M2、M3和M19)、酮类DCDQ(M18)和羟基DCDQ亚胺在粪便提取物中可检出。代谢产物M6的形成由于在胃肠道中可能水解而未被评估。DCDQ的广泛性代谢和延长的口服吸收可能说明在犬中相对较低的口服生物利用度，约为25.4％。
DCDQ在犬中的代谢与大鼠中的有些不同(图1)。在大鼠和犬中可观察到一些不同的代谢产物。氧化代谢物M15、M16、M17、M18和M19在大鼠中未观察到，而在大鼠中可见的羟基代谢物M4在犬中未检出。硫酸酯M8和M13，以及氨基磺酸酯M12和M14在大鼠中可见，但在犬中未检出。硫酸酯M16在犬中可见，但在大鼠中未检出。在犬血浆和尿液中可检出的DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸在大鼠血浆和尿液中未观察到。
总之，DCDQ在犬中被广泛代谢，氧化代谢是主要的代谢途径，尽管也可观察到DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸的形成。
经LC/MS分析定性代谢产物 经LC/MS和LC/MS/MS分析以上研究中确定的DCDQ及其代谢产物得到质谱。来自各研究的DCDQ及其代谢产物的质谱定性在下文讨论。
DCDQ 为与代谢产物相比较，检查DCDQ标准的质谱特性。在DCDQ的LC/MS光谱中，质子化的分子离子，[M+H]+，在m/z 229可见。由碰撞诱导解离(CID)得到的DCDQ质谱的m/z 229产物离子以及推荐的裂解方案表明从分子离子失去亚甲基胺、亚乙基胺和亚乙基甲基胺分别生成m/z 200、186和171处的产物离子。分子离子失去丙烯基团生成m/z 187处的片段，并进一步失去亚甲基胺和亚乙基胺生成m/z 158和144处的碎片离子。失去环戊基-亚甲基胺基团生成m/z 132处的碎片离子。
代谢产物M1来自大鼠和犬体内体外研究 M1的[M+H]+在m/z 245处可见。M1质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明单羟化作用。失去分子离子的丙烯生成m/z 203处的碎片，其较DCDQm/z 187处的对应离子高16Da。m/z 171和186处的碎片离子与DCDQ谱中的产物离子相同，表明羟化作用发生在所示分子的二氮杂部分。因此，认为M1是羟基DCDQ。
代谢产物M2来自大鼠和犬体内体外研究 M2的[M+H]+在m/z 245处可见。M2质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明单羟化作用。失去分子离子的丙烯生成m/z 203处的碎片，其较DCDQm/z 187处的对应离子高16Da。这表明环戊烷环不是生物转化的位置。m/z 132处的碎片与DCDQ相同，表明二氮杂部分不是生物转化的位置。m/z 169和184处的碎片分别较DCDQm/z 171和186处对应的离子低2Da，表明从吡啶环中失去H2O而导致羟化作用。因此，认为M2是羟基DCDQ。
代谢产物M3来自大鼠和犬体内体外研究 M3的[M+H]+在m/z 245处可见。M3质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明单羟化作用。失去亚乙基生成m/z 202处的碎片，其较SAX-187m/z 186处的对应离子高16Da。m/z158和144处的碎片离子与DCDQ谱中产物离子相同。这表明羟基化作用发生在所示分子的环戊烷部分。因此，认为M3是羟基DCDQ。
代谢产物M4来自大鼠的体内体外研究 M4的[M+H]+在m/z 245处可见。M4质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明单羟化作用。从分子离子中失去H2O生成m/z 227处的碎片。对于DCDQ也可观察到m/z 144处的产物离子，表明羟化作用发生在所示分子的环戊烷部分。这也和m/z 184存在的产物离子一致，通过失去DCDQm/z 186处对应离子的亚乙基胺和H2O生成。测定的这一离子的精确质量为184.1120Da，此值在C13H14N的理论质量的3.6ppm之内。因此，认为M4是羟基DCDQ。
代谢产物M5来自体外研究 M5的[M+H]+在m/z 243处可见。测定的M5的精确质量为243.1478Da，此值在C15H19N2O理论质量的7.9ppm之内。与DCDQ的分子式相比较，这符合加上一个氧而去掉两个氢原子。m/z 130处的碎片比DCDQ对应的离子少2Da，表明形成了亚胺。在流动相中用D2O取代H2O的LC/MS证明M5中不存在可交换的质子，表明M5是N-氧化物。因此，认为M5是DCDQ亚胺的N-氧化物。
代谢产物M6来自犬的体内体外研究 M6的[M+H]+在m/z 449处可见。M6质谱的m/z 449产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去176Da生成m/z 273处的碎片，表明M5是葡糖苷酸缀合物。从m/z 273处进一步失去44Da生成m/z229，其也是DCDQ的分子离子。因此，认为M6是DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸。
代谢产物M7来自大鼠和犬的体内体外研究 M7的[M+H]+在m/z 243处可见。M7质谱的m/z 243产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去亚甲基胺、亚乙基胺生成m/z 214和200处的产物离子，其分别较DCDQ的m/z 200和186处对应的离子多14Da。这表明DCDQ加了一个氧原子并去掉了两个氢原子。m/z 132、144和158处的产物离子与DCDQ的相同，表明生物转化发生在吡啶环和环戊烷环上。在流动相中用D2O取代H2O的LC/MS证明M7中仅存在一个可交换的质子，其来自二氮杂环中的NH基团。因此，认为M7是酮类DCDQ。
代谢产物M8来自大鼠体内研究 M8的[M+H]+在m/z 325处可见。M8质谱的m/z 325产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子去掉丙烯生成m/z 283处的产物离子，表明生物转化不在环戊烷环上发生。从m/z 283处的产物离子失去亚甲基胺、亚乙基胺，然后失去硫酸酯基团分别生成m/z 158和144处的产物离子。从分子离子中失去亚乙基胺生成m/z 282处的产物离子，然后失去磺酸酯基团和H2O分别生成m/z 202和184处的产物离子。m/z 132处的碎片离子与DCDQ中的相同，表明二氮杂部分不是生物转化的位置。因此，认为M8是羟基DCDQ的硫酸酯缀合物。
代谢产物M9来自大鼠和犬的体内研究 M9的[M+H]+在m/z 421处可见。M9质谱的m/z 421产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去176Da生成m/z 245处的碎片离子，表明羟基DCDQ的葡糖苷酸化。失去亚乙基胺和葡糖醛酸生成m/z202处的碎片，其较DCDQ中m/z 186处对应的离子高16Da。m/z 187处的碎片离子表明生物转化发生在环戊烷环上。因此，认为M9是羟基DCDQ的葡糖苷酸。
代谢产物M10 M10的[M+H]+在m/z 245处可见。M10质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明发生了单羟化作用。m/z 171和186处的碎片离子与DCDQ光谱中的产物离子相同，表明羟化作用发生在所示分子的二氮杂部分。因此，认为M10是羟基DCDQ。
代谢产物M11来自大鼠体内研究 M11的[M+H]+在m/z 287处可见。M11质谱的m/z 287产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子中失去H2O生成m/z 269处的碎片。进一步失去42Da得到m/z 227，其表示乙酰化作用。m/z 171和186处的碎片离子与DCDQ光谱中的产物离子相同，表明生物转化发生在所示分子的二氮杂部分。因此，认为M11是乙酰化的羟基DCDQ。
代谢产物M12来自大鼠体内研究 M12的[M+H]+在m/z 309处可见。M12质谱的m/z 309产物离子和推荐裂解方案表明失去80Da得到m/z 229处的产物离子，其为DCDQ的分子离子。这表明发生了硫酸盐化作用。进一步失去亚甲基胺、亚乙基胺生成m/z 200和186处的产物离子，这与DCDQ相同。因此，认为M12是DCDQ的N-硫酸酯。
代谢产物M13来自大鼠体内研究 M13的[M+H]+在m/z 325处可见。M13质谱的m/z 325产物离子和推荐裂解方案表明从[M+H]+失去80Da得到m/z 245，其较DCDQ的[M+H]+高16Da。这表明M13是羟基DCDQ的硫酸酯缀合物。因此，认为M13是羟基DCDQ的硫酸酯缀合物。
代谢产物M14来自大鼠体内研究 M14的[M+H]+在m/z 305处可见。M14质谱的m/z 305产物离子、质谱m/z 225处的产物离子和计划的M14的裂解方案表明从分子离子失去80Da得到m/z 225处的离子，这表明M14是硫酸酯。进一步失去亚乙基胺和亚乙基-甲基-胺分别生成182和167处的产物离子，其分别较DCDQm/z 186和171处对应的离子少4Da，表明环戊烷基的代谢。因此，认为M14是二脱氢DCDQ的硫酸酯缀合物。
代谢产物M15来自犬的体内研究 M15的[M+H]+在m/z 245处可见。M15质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明m/z 187处的碎片离子较DCDQ的m/z 171处对应的离子高16Da，表明环戊烷或吡啶环发生了羟基化作用。m/z 130处的碎片离子较DCDQ的对应离子少2Da，表明形成了亚胺。在流动相中用D2O取代H2O的LC/MS证明M15中仅存在一个可交换的质子。因此，认为M15是羟基DCDQ亚胺。
代谢产物M16来自犬的体内研究 M16的[M+H]+在m/z 325处可见。M13质谱的m/z 325产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去80Da生成m/z 245处的产物离子，表明发生了硫酸盐化作用。从分子离子失去丙烯得到m/z 283处的产物离子，表明生物转化不是在环戊烷环上发生。失去亚乙基胺生成m/z 282处的产物离子，然后失去硫酸酯基和H2O分别生成m/z 202和184处的产物离子。m/z 148处的产物离子，较DCDQ 132处的对应离子高16Da，并且m/z 282处的产物离子表明羟基化作用发生在所示分子的苄基基团上。因此，认为M16是羟基DCDQ的硫酸酯缀合物。
代谢产物M17来自犬的体内研究 M17的[M+H]+在m/z 257处可见。测定的[M+H]+的精确质量为257.1292Da，此值在C15H17N2O2的理论质量的0.8ppm之内。与DCDQ的分子式相比，这符合加上两个氧原子并去掉4个氢原子。从分子离子失去44Da得到m/z 213处的碎片。测定的此碎片的精确质量为213.1376Da，此值在C14H17N2的理论质量的7.6ppm之内。这证明失去的44是来源于CO2的中性失去，表明M17是羧酸。进一步从m/z 213失去环戊烯、戊烷、丙烯和HCN分别生成m/z 145、171和186处的碎片。m/z 130处的产物离子较DCDQ m/z 132处的对应离子少2Da，表明形成了亚胺。在流动相中用D2O取代H2O的LC/MS证明M17中仅存在一个可交换的质子，其来自羧酸基团。因此，认为M17是苯并-二氮杂基-环戊烷羧酸(二氮杂基DCDQ羧酸)。
代谢产物M18来自犬的体内研究 M18的[M+H]+在m/z 243处可见。M18质谱的m/z 243产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去丙烯和亚乙基胺基团生成m/z 158处的产物离子。从分子离子失去亚甲基胺、亚乙基胺得到m/z 214和200处的产物离子，其分别较DCDQm/z 200和186处的对应离子多14Da。这表明从DCDQ增加了一个氧原子并去掉了两个氢原子。m/z 146处的产物离子，较DCDQm/z 132的对应离子多14Da，并且m/z 200产物离子表明修饰发生在苄基基团上。在流动相中用D2O取代H2O的LC/MS证明M14中仅存在一个可交换的质子，其来自二氮杂环中的NH基团。因此，认为M18是酮类DCDQ。
代谢产物M19来自犬的体内研究 M19的[M+H]+在m/z 245处可见。M19质谱的m/z 245产物离子和推荐裂解方案表明增加了16Da，说明发生了单羟化作用。m/z 216、202和187处的产物离子分别较DCDQm/z 200、186和171的对应离子高16Da，表明二氮杂基团不是修饰的位置。从分子离子失去丙烯得到m/z 203处的碎片，并进一步失去亚甲基胺和亚乙基胺得到m/z 174和160处的碎片离子。较DCDQ的对应离子高16Da，表明在苯基团或吡啶基团发生了羟基化作用。因此，认为M19是羟基DCDQ。
产物P3来自体内研究 P3的[M+H]+在m/z 227处可见。P3质谱的m/z 227产物离子和推荐裂解方案表明P3的分子量较DCDQ少2Da，表明形成了双键。m/z130处的碎片离子较DCDQ的对应离子少2Da，表明形成了亚胺。因此，认为P3是DCDQ亚胺。
单剂量口服给予DCDQ 50mg/kg后， 大鼠尿液中代谢产物M7、M9和M13的鉴别 概要 设计本研究是为了得到代谢产物分离的大鼠尿液，以及为了得到DCDQ选择性代谢产物的更具体的结构确证。单剂量给予三只雄性和三只雌性大鼠DCDQ 50mg/kg。在0-12和12-24小时间隔收集尿液。通过二阶半制备型HPLC法从尿液中分离DCDQ代谢物M7(酮类DCDQ)、M9(羟基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羟基DCDQ硫酸酯)，其以低微克足量用于NMR光谱分析。根据MS和NMR光谱分析，M7和M13的代谢位点在17位。M9的代谢位点在13位。
引言 当在NADPH和UDPGA存在下用大鼠肝微粒体培养时，[14C]DCDQ转化为一些氧化代谢物。以前的大鼠中的代谢研究表明DCDQ被广泛代谢，并且氧化代谢是大鼠中主要的代谢途径。II相代谢产物包括羟基DCDQ的硫酸酯和葡糖苷酸，在大鼠中也可检出。设计本研究以获得大鼠尿液中的分离的代谢产物，并获得选择性DCDQ代谢产物的更具体的结构确证。
材料和方法 材料 如上所述，DCDQ盐酸盐由Wyeth Research合成。聚山梨醇酯80购自Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)，并且甲基纤维素得自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色谱分析用溶剂是HPLC或ACS试剂级的，购自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。氘化的二甲亚砜(DMSO-d6)购自Cambridge Isotope Laboratories(Andover，MA)。NMR试管(3mm)购自Wilmad Glass Co.(Buena，NJ)。
方法 药物给予和样本收集 剂量配制、动物给药和标本收集在Wyeth Research，Collegeville，PA进行。药物赋形剂包含2％(v/v)吐温80和0.5％(v/v)甲基纤维素的水溶液。给药当天，未标记的DCDQ(205.7mg)溶于赋形剂中以使终浓度为约10mg/mL。
给药时，三只雄性大鼠体重为413-474g，三只雌性大鼠体重为272-290g，均购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。单剂量给予未禁食大鼠DCDQ的目标剂量为50mg/kg，通过灌胃法给予的体积为5.0mL/kg。给动物提供标准大鼠饲料并任意饮水，并分别关在代谢笼中。
在0-12和12-24小时间隔，将尿液收集至干冰上的容器中，并于约-70℃贮存直至馏份收集时。
通过液相色谱法/质谱法分析大鼠尿液 经LC/MS分析大鼠尿样，以确定在用于代谢物分离的大鼠尿样中存在的DCDQ代谢物。用于LC/MS分析的HPLC系统是Agilent 1100型HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，其配有二元泵、自动采样器和二极管阵列UV检测器。自动采样器的温度设为10℃。UV检测器设为190-400nm检测。分离使用Supelco Discovery C18柱(250×2.1mm×5μm)来完成。柱温为20℃。使用的流动相梯度程序如下所述。
流动相A10mM乙酸铵水溶液，pH4.5 流动相B甲醇 表27HPLC梯度 用于代谢物定性的质谱是Finnigan LCQ离子收集器质谱仪(ThermoElectron Corp.，San Jose，CA)，其配有电喷射离子化(ESl)接口，并在阳性离子化模式中操作。质谱仪的设置列于下表中。
经液相色谱法分离代谢产物 用于代谢产物分离的HPLC系统包括Waters Prep LC 4000泵、进样用Waters 2767样品管理程序、Waters 996二极管阵列UV检测器和Gilson FC204馏份收集器(Gilson，Inc.，Middleton，WI)。UV检测器设为210-450nm检测。馏份收集器设为间隔1min收集馏份。HPLC流动相梯度如上所述LC/MS分析用梯度，除流速为4.7mL/min外。各HPLC条件的流动相如下所述。在馏份收集期间未进行质谱分析。
使用两个HPLC条件来分离代谢产物。HPLC条件1用于从大鼠尿液分离代谢产物。HPLC条件2用于进一步纯化使用HPLC条件1收集的DCDQ代谢产物馏份。HPLC条件1和2使用的柱和流动相列出如下。
HPLC条件1 柱Supelco Discovery C18半制备型柱(250×10mm，5μm)(Supelco，Bellefonte，PA)。
流动相A10mM乙酸铵水溶液，pH4.5 流动相B甲醇 HPLC条件2 柱Zorbax SB-CN半制备型柱(250×9.4mm，5μm)(AgilentTechnologies) 流动相A0.02％三氟乙酸水溶液 流动相B0.02％三氟乙酸甲醇溶液 将来自HPLC条件2的含有代谢产物M7、M9和M13的馏份合并，并在氮气下使用Zymark TurboVap(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)蒸发至干燥。使用干燥的代谢产物进行NMR光谱分析。
分离出来的M7、M9和M13的核磁共振(NMR)谱分析 对于NMR谱，分离出来的DCDQ代谢产物M7、M9和M13的样品各自溶于150μL 100％DMSO-d6中，并在氮气气氛下分别转移至3mm NMR试管中。在配有Nalorac 5mm z-梯度间接检测探针(Varian)的Varian Inova 500MHz NMR波谱仪(Palo Alto，CA)上，收集一维(1D)质子NMR和二维(2D)NMR(COSY，ROESY)数据。
数据分析 ThermoFinnigan Xcalibur软件(1.3版)用于控制LC/MS系统，并分析LC/MS数据。使用Micromass MassLynx软件(4.0版)控制用于馏份收集的HPLC仪器。使用VNMR程序(6.1C版，Varian)，收集、处理并显示NMR光谱数据。
结果 经LC/MS和NMR谱定性DCDQ代谢产物 本研究中，分离足量DCDQ的代谢产物M7、M9和M13，以进行NMR谱分析，确定更具体的结构。本报告中的M7(酮类DCDQ)、M9(羟基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羟基DCDQ硫酸酯)的结构确证可以取代那些在前述报告中的结构确证。DCDQ、M7、M9和M13以及其NMR编号图解概括于图5中。经质谱和NMR谱确证M7、M9和M13在下文讨论。
DCDQ 检查DCDQ标准品的质谱和NMR光谱，以和代谢产物比较。在DCDQ的LC/MS谱中，质子化分子离子，[M+H]+，在m/z 229处可见。DCDQ质谱得自碰撞诱导解离(CID)，其中m/z 229处的产物离子及推荐裂解方案表明从分子离子失去亚甲基胺和亚乙基胺分别生成m/z200和186处的产物离子。从分子离子失去丙烯得到m/z 187，并进一步失去亚乙基生成m/z 144。失去环戊基-亚甲基胺基团得到m/z 132产物离子。
表29概括了DCDQ的1HNMR化学位移数据。这些数据用于和分离的代谢产物比较。
表29在DMSO-d6中DCDQ的1H化学位移 代谢产物M7 M7的[M+H]+在m/z 243处可见。M7质谱的m/z 243产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去亚甲基胺、亚乙基胺分别得到m/z214和200处的产物离子，其值分别较DCDQ的m/z 200和186处的对应离子高14Da。这表明从DCDQ添加了一个氧原子并失去了两个氢原子。m/z 132、144和158处的产物离子与DCDQ的相同，表明生物转化位置在环戊烷环上。
表30列出了M7的化学位移和分配。使用来自1D NMR谱和2DCOSY谱的信息确定代谢产物。1D 1H NMR谱显示芳环与三个连续配对的芳香共振一起是完整的。由得到的数据来看，不可能区别H12和H14。二氮杂环上的质子来自于9.10-8.62ppm的盐共振(H4)。2DCOSY数据显示这些质子在3.20ppm(H3)～4.18和4.15ppm(H5)偶合入质子。H3质子也在3.34和3.06(H2)偶合入质子。这些结果证明二氮杂环是完整的。
表30在DMSO-d6中代谢产物M7的1H化学位移 1D1H NMR谱也显示与DCDQ比较，变化发生在环戊基区域，因为有三个2.5ppm共振高磁场，而DCDQ有7个共振。剩余原子的分配从H11质子开始。根据与DCDQ的偶合常数比较，认为3.16ppm和3.01ppm的共振是H11。3.01ppm处的共振是三重峰，3.16ppm处的共振是双联体。这些都可以在DCDQ中观察到。H11质子都偶合至2.59ppm(H10)处的共振。H10共振偶合至3.47ppm(H9)处的另一个共振。H9共振偶合至2.53ppm和1.76ppm(H15)处的亚甲基对。H15共振偶合至2.32ppm和2.14ppm(H16)处的另一个亚甲基对。没有可分配至H17的共振，表明C17位是代谢的位置。H16质子的低场位移与C17处的羰基氧一致。因此，M7被确定为17-酮类DCDQ。
代谢产物M9 M9的[M+H]+在m/z 421处可见。M9质谱的m/z 421产物离子和推荐裂解方案表明从分子离子失去176Da生成m/z 245，较DCDQ分子离子高16Da，表明羟基DCDQ发生了葡糖苷酸化作用。从[M+H]+失去亚甲基胺得到m/z 378。这表明亚乙基部分未发生变化。从m/z 378失去葡糖醛酸(176Da)得到m/z 202，其值较DCDQm/z 186处的对应离子高16Da。这表明消除了环丙烷环的三个亚甲基基团，此环为代谢位置。m/z 203处的产物离子较DCDQ 187处的对应离子高16Da。这些数据与作为代谢位置的苄基或四氢吡啶基一致。
使用图5中的编号图解，表31列出了M9的NMR化学位移和分配。许多代谢产物可以使用1D NMR谱的信息和2D COSY分析的结果确定，显示M9中的穿过-键关联，并且ROESY分析显示M9中的穿过-空间NOE紧密接触。来自C2上亚甲基质子的共振由于重叠而未被确定。其共振位于3.35ppm-3.15ppm。M9DCDQ的NMR谱的高磁场域是相同的。使用COSY试验进一步分析这一区域证明苯环系统是完整的。在M9的1D1H NMR谱中也可见来自葡糖苷酸的共振。由于谱的重叠，这些共振中的一些不能被清楚地确定。在3.35-3.15ppm区域有足量未确定的质子共振的代谢物。
表31DMSO-d6中代谢产物M9的1H化学位移 检查500MHz 1D 1H NMR谱显示芳环的共振从DCDQ的NMR谱变化。这些芳香共振中有两个仍是来自DCDQ中的三个。在2.5Hz处这些芳香共振之间的偶合是间位原子之间的特征。这将葡糖苷酸置于C13位。通过ROSEY试验结果进一步支持了葡糖苷酸的位置，该试验表明H12具有H5质子的NOEs，并且H14具有H9的NOE。这些结果在芳环相反的末端定位了H12和H14。两个芳环质子还都具有葡糖苷酸环的芳香质子的NOEs。所有这些结果都和葡糖苷酸在C13位的结合一致。
代谢产物M13 M13的[M+H]+在m/z 325处可见。M13质谱的m/z 325产物离子和推荐裂解方案表明从[M+H]+失去80Da得到m/z 245，此值较DCDQ的[M+H]+高16Da。这表明M13是羟基DCDQ的硫酸酯缀合物。从分子离子失去亚乙基胺得到m/z 282。在m/z 144和132存在产物离子，在DCDQ中也可见，表明环戊烷环的三个亚甲基位中的一个是代谢位置。
表32列出了M13的化学位移和分配。使用1D 1H NMR谱、2DCOSY谱和2D ROESY谱的信息确定代谢产物。M13的1D 1H NMR谱显示芳环和7.15ppm(H12)、6.91ppm(H13)和7.23ppm(H14)处的三个偶合质子一起是完整的。分配由观察到的H12的ROE4.17ppm和4.14ppm处的共振确定，其被确定为H5。确定二氮杂环的质子来自9.04ppm和8.57ppm处的盐共振(H4)。2D COSY数据显示这些质子偶合至3.22ppm和3.20ppm(H3)和4.17和4.14ppm(H5)处的质子。H3质子也偶合至3.34和3.14(H2)处的质子。这些结果证明二氮杂环是完整的。
表32DMSO-d6中代谢产物M9的1H化学位移 1D1H NMR光谱数据(表32)显示变化发生在环戊基区域，因为M13有5个2.5ppm的高磁场共振，而在DCDQ NMR光谱中，有7个共振。11位的质子根据其与DCDQ中的相似确定。2.68ppm处的三重共振是DCDQ唯一的。此共振偶合至3.23ppm(H11)处的共振，另一个至2.40ppm(H10)。H10偶合至3.15ppm(H9)处的共振，而弱偶合至4.29ppm(H17)。H9偶合至2.26ppm和1.33ppm(都是H15)处的亚甲基对。此亚甲基对偶合至1.97ppm和1.67ppm(都是H16)处的另一个亚甲基对。H16亚甲基偶合至H17。环戊烷环缺一个质子，剩余质子的大低磁场位移指示邻近的杂原子。所有这些数据都和C17位存在的硫酸酯基团一致。因此，确定M13是17-羟基DCDQ硫酸酯。
讨论 设计本研究以获得大鼠尿液分离的代谢产物，并获得选择的DCDQ代谢产物的更具体的结构确证。单剂量给予三只雄性和三只雌性大鼠DCDQ 50mg/kg。在0-12和12-24小时间隔收集尿液。通过二阶半制备型HPLC法，从尿液中分离DCDQ代谢物M7(酮类DCDQ)、M9(羟基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羟基DCDQ硫酸酯)，其以低微克足量用于NMR光谱分析。根据MS和NMR谱分析，M7和M13的代谢位置在17位。M9的代谢位置在13位。通过本研究确定的M7、M9和M13的结构确证进一步精确了那些上文所讨论的大鼠体内研究的数据。
口服给予后，[14C]DCDQ在健康志愿者中的体内代谢 健康志愿者单次或重复服用各种剂量的DCDQ后，确定DCDQ在其血浆和尿液中的代谢分布。此外，在选取的样品中测定了主要DCDQ代谢物(M6，氨基甲酰基葡糖苷酸)的相对浓度。
鉴别了血浆和尿液中的DCDQ和几个DCDQ代谢物。DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在血浆和尿液中都是主要的药物相关性组分。DCDQ亚胺N-氧化物(M5)、未变化的DCDQ、DCDQ亚胺(P3)和其它相对量少的药物相关性组分在血浆也观察到。未改变的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羟基DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M37)和许多其它相对量少的药物相关性组分在尿液中排泄。
血浆中的M6的浓度随剂量的增加而增加，并可见较大的个体差异。给药后6-24小时血浆M6浓度随时间降低。M6/DCDQ血浆浓度的比率在给药后6小时高于给药后12和24小时。给药后6小时，平均比率为35.4-76.6。禁食和进食的受试者服用300mg DCDQ，M6浓度和M6/DCDQ比率在二者之间没有明显的统计学差异。尿液中平均M6/DCDQ比率为84-1018。
结果显示DCDQ在口服了DCDQ的健康受试者中进行I期和II期代谢，并且氨基甲酰基葡糖苷酸化是主要的代谢途径。与动物研究相反，形成氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在人类中是主要的代谢途径，并且M6在人血浆和尿液中是主要的药物相关性代谢物。
材料和方法 方法 DCDQ盐酸盐的化学纯度是98.6％，由Wyeth Research(PearlRiver，NY)合成。DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸由Wyeth Research的化学部(Montreal，Canada)合成，其纯度为95.5％。内标物(d8-DCDQ，批号L27347-140-A)由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小组合成。报告的氘分布为d0-d50％、d60.1％、d72.7％和d897.1％。提取用和色谱分析用溶剂是HPLC和ACS试剂级的，来源于EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 药物给予和样本收集 在随机、双盲、安慰剂对照、增加的单剂量研究中，口服给予健康受试者和精神分裂症和情感分裂性精神障碍受试者DCDQ，研究其安全性、耐受性、药动学和药效学，进行药物给予和样本收集。样本贮存于约-70℃至分析代谢物分布及氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)/DCDQ的比率时。
样品制备 在25mg重复增加剂量的研究中，两位受试者中等和高暴露于DCDQ中，经LC/MS分析代谢产物分布。在第1天和第14天从受试者9和41收集8hr的血浆样品，进行如下所述的处理和分析。内标不加入分析代谢产物分布用的样品中。
血浆样品来自50mg单剂量组禁食受试者25、28和30号，200ng单剂量组禁食受试者50、51和54号，300mg单剂量组中禁食受试者74、76和79号，300mg单剂量组进食受试者83、84和86号以及500mg单剂量组禁食受试者92、94、96号，用于分析DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)浓度。将内标d8-DCDQ(25μL 200ng/mL甲醇溶液)加入100μL血浆样品中，然后加入300μL乙腈。将样品混合并于14000rpm在Eppendorf 5415C离心机(Brinkman Instruments Inc.，Westbury，NY)中离心10分钟。将各样品的上清液转移至干净的试管中，并在氮气气流中在TurboVap LV蒸发仪(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸发至干燥。残余物再用50μL甲醇溶解，然后加入150μL水。将样品如上述方法混合并离心。上清液经LC/MS/MS分析。标准曲线的样品用加入了合成M6的对照血浆制备。标准曲线用M6的浓度为0-2500ng/mL血浆。
在单剂量组中来自相同受试者的0-4、4-12和12-24hr尿样用于分析M6/DCDQ的比率。在尿样分析中不使用内标。样品用对照尿样稀释20倍，并直接用LC/MS分析。为估算人尿液中M6/DCDQ比率，对照尿样加入200ng/mL DCDQ和1000、5000或10000ng/mL DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸，并经LC/MS分析。
液相色谱/质谱 在本研究中使用三个LC/MS系统。LC/MS系统1用于分析血浆和尿液样品，以定性代谢产物。LC/MS系统2用于提供另外的MS/MS数据，以定性尿液中的DCDQ代谢产物。LC/MS系统3用于半制备分析血浆和尿液样品中的代谢物M6(DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸)。
LC/MS系统1 LC/MS系统1用于分析血浆和尿液样品，以定性代谢产物。使用此LC/MS系统的HPLC仪器包括Agilent 1100型HPLC系统(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)，其包括自动采样器、二元泵和二极管阵列UV检测器。UV检测器设为210-350nm检测。HPLC流动相包括10mM乙酸铵、pH4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min的速度流出。线性流动相梯度(HPLC梯度1)如下所示。LC/MS样本分析期间，至多6min的起始流速在评估代谢产物之前将质谱仪换向。
HPLC梯度1 使用LC/MS系统1的代谢产物定性用质谱仪是Finnigan LCQ-Deca离子收集质谱仪(Thermo Electron，San Jose，CA)。此质谱仪配有电喷射离子化(ESI)接口，并以阳离子模式操作。LCQ质谱仪的设置如下。
LC/MS系统2 LC/MS系统2用于提供另外的MS/MS数据，以定性尿液中的DCDQ代谢产物。使用LC/MS系统2的HPLC仪器包括Waters 2695型HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA)。其配有内置的自动采样器和996型二极管阵列UV检测器。UV检测器设为210-400nm检测。HPLC柱、流动相、流速、从质谱仪流出的转移和梯度如上文LC/MS系统1所述。柱温为25℃。
使用LC/MS系统2的定性代谢产物用质谱仪是MicromassQuattro Micro三联四极质谱仪(Waters Corp.)，此质谱仪配有电喷射接口并以阳离子模式操作。此质谱仪的设置列出如下。
LC/MS系统3 LC/MS系统3用于半制备分析血浆和尿液样品中的代谢物M6(DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸)。使用此LC/MS系统的HPLC仪器包括Thermo Surveyor HPLC(Thermo Electron Corp.，San Jose，CA)，其包括Surveyor MS泵和自动采样器。分离在5微米Phenomenex LunaC18(2)柱，150×2mm(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自动采样器和柱温分别设为5℃和40℃。HPLC流动相包括10mM乙酸铵(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min的速度流出。线性流动相梯度(HPLC梯度2)如下所示。LC/MS样本分析期间，至多3min的起始流速在评估代谢产物之前将质谱仪换向。
HPLC梯度2 使用LC/MS系统3的半定量分析用质谱仪是Finnigan TSQQuantum三联四极质谱仪(Thermo Electron Corp.)。此质谱仪配有电喷射接口并以阳离子模式操作。此质谱仪的设置列出如下。
在选择的反应检测(SRM)模式(LC/SRM)中，使用以下设置进行DCDQ和M6的LC/MS/MS分析。
数据分析和统计学评估 计算机程序Microsoft Excel97用于计算平均和标准偏差，并用于进行t-检验。Xcalibur(1.3版)和MassLynx软件(4.0版)用于收集和分析LC/MS数据。M6/内标的峰面积比用于定量血浆中的M6。
结果 血浆中的代谢产物分布和M6浓度 确定了人血浆中的DCDQ和8个DCDQ代谢物(表33)。在单剂量和多剂量研究中的所有剂量中，DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)是血浆中的主要药物相关性组分。在血浆中也可观察到DCDQ亚胺N-氧化物(M5)、未改变的DCDQ、DCDQ亚胺(P3)和痕量羟基DCDQ、羟基DCDQ亚胺、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)和酮类DCDQ葡糖苷酸(M22)。在所有分析样品中，代谢产物分布在质上是相似的。
血浆M6浓度随剂量增加而增加，并且可见较大的个体差异(表34)。在分析的三个时间点，M6浓度在给药后6小时最高，并在给药后12和24小时随时间降低。M6/DCDQ的血浆浓度比率也在给药后6小时最大，并通常随时间降低。给药后6小时，平均比率为35.4-76.6。服用了300mg DCDQ的禁食和进食志愿者之间M6浓度和M6/DCDQ比率没有明显的统计学差异。
尿液中代谢产物分布和M6/DCDQ比率 确定了尿液中的DCDQ和几个DCDQ代谢产物。DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)是尿液中主要的药物相关性组分，和血浆一样。未改变的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羟基DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M37)和痕量DCDQ亚胺(P3)、羟基DCDQ(M1和M32)、羟基DCDQ亚胺(M29)、酮类DCDQ葡糖苷酸(M22)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M9)、羟基DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M33、M36和M39)、DCDQ亚胺葡糖苷酸(M34)和二羟基DCDQ亚胺葡糖苷酸(M35)在尿液中也可观察到。氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)以较母体药物高得多的浓度存在于尿液中(表35)。平均M6/DCDQ比率为84-1018；可见较大的差异。500mg剂量组中的比率似乎较其它剂量组低。
经液相色谱法/质谱法质谱定性的代谢产物通过LC/MS和LC/MS/MS分析人血浆和尿液中的DCDQ及其代谢物获得。表33概括了本研究中定性的DCDQ代谢产物。因为M6(DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸)是血浆和尿液中主要的DCDQ相关性组分，所以未改变的DCDQ的相对浓度相对较低。因此，下文更详细地讨论了DCDQ相关组分的质谱定性，血浆或尿液中存在的DCDQ约与未改变的DCDQ相同或浓度较后者高。
DCDQ 与代谢物相比较，检查了DCDQ真标准的质谱定性。在DCDQ的LC/MS谱中，质子化的分子离子，[M+H]+，在m/z 229处可见。从[M+H]+失去NH3得到m/z 212。从分子离子失去亚甲基胺、亚乙基胺和亚丙基胺分别得到m/z 200、186和171处的产物离子。从分子离子失去丙烯基团得到m/z 187，并进一步失去亚甲基胺和亚乙基胺得到m/z 158和144。从[M+H]+失去环戊烯得到m/z 161。失去环戊基-亚甲基胺基团得到m/z 132处的产物离子。
代谢产物M5 代谢产物M5在m/z 243处产生[M+H]+，此值较DCDQ高14Da，并较P3高16Da。这些数据表明M5是酮类DCDQ代谢物、羟基DCDQ代谢物、羟基DCDQ亚胺或DCDQ亚胺N-氧化物。从[M+H]+失去NH3和H2O分别得到m/z 226和225，这符合添加了一个氧原子。认为从分子离子失去亚甲基胺得到m/z 213，符合添加了氧原子，并且失去的两个氢处存在双键。m/z 130处的产物离子在P3中也可见，并且较DCDQm/z 132的对应离子少2Da。这些数据表明M5也含有亚胺基团，考虑其去掉酮类DCDQ。M5的HPLC保留时间较DCDQ和P3(DCDQ亚胺)都长，这在体外代谢研究1中也可观察到，并与N-氧化作用一致。因此，确定M5是DCDQ亚胺N-氧化物。
代谢产物M6 M6的[M+H]+在m/z 449处可见，此值较DCDQ高220Da。从分子离子失去176Da得到m/z 273，表明M6是葡糖苷酸。从m/z 273进一步失去44Da得到m/z 229，此也是DCDQ的分子离子。m/z 212和186处的产物离子在DCDQ也可观察到，与作为DCDQ缀合物的M6一致。因此，确定M6是DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸。
代谢产物M38 M38的[M+H]+在m/z 421处可见，此值较DCDQ高192Da。从[M+H]+失去NH3得到m/z 404，这表明在二氮杂环上未改变的氨基基团。从分子离子失去176Da得到m/z 245，这也是羟基DCDQ代谢物的分子离子。从m/z 245失去NH3和H2O分别得到m/z 228和227。这些数据表明M38是羟基DCDQ的葡糖苷酸。m/z 362处的产物离子较DCDQm/z 186的对应离子高176Da，这表明喹啉-环戊烷部分的葡糖苷酸化。认为m/z 362和269处的产物离子包括葡糖醛酸部分，并且是如重排方案中所示的二氮杂、喹啉和环戊烷重排所致。这些数据符合喹啉氮的葡糖苷酸化和二氮杂环的羟化。因此，确定M38是羟基DCDQ葡糖苷酸。
代谢产物M40 M40的[M+H]+在m/z 421处可见，此值较DCDQ高192Da。从[M+H]+失去H2O得到m/z 403。从[M+H]+未失去NH3，表明修饰的氨基基团在二氮杂环上。从分子离子失去176Da得到m/z 245，这也是羟基DCDQ分子离子。然而，M40m/z 245相对强度较代谢产物M38中观察到的弱。从m/z 245失去一个氧原子得到m/z 229，也是DCDQ的分子离子。这些数据和m/z 229存在的数据组合在一起作为离子收集质谱中的基础峰，而不是如代谢产物M38可见的m/z 245，表明存在N-氧化物。m/z 228、227、212和210处的产物离子分别由从如重排方案所示的m/z 245和229处失去H2O和NH3得到。M40的HPLC保留时间较M38的长，这也符合M40是N-氧化物。也可见DCDQ中的m/z200和186处的产物离子，并认为其是由从M40对应的N-氧化物产物离子失去一个氧原子所致。认为m/z 360和271处的产物离子包括葡糖醛酸部分，并且是由如重排方案所示的二氮杂、喹啉和环戊烷环重排所致。这些数据与二氮杂环的氨基葡糖苷酸化作用和喹啉氮的N-氧化作用一致。因此，认为M40是DCDQ N-氧化物葡糖苷酸。
讨论 DCDQ在人体中进行代谢。DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在血浆和尿液中都是主要的药物相关性组分。DCDQ亚胺N-氧化物(M5)、未改变的DCDQ、DCDQ亚胺(P3)是血浆中可见的其它主要药物相关性组分。未改变的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羟基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羟基DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M37)经尿液排泄。
血浆M6的浓度随剂量增加而增加，并且可见较大的个体差异。M6浓度在给药后6-24小时随时间降低。M6/DCDQ血浆浓度的比率在给药后6小时较12和24小时高。在给药后6小时，平均比率为35.4-76.6。相反，在先前的体外和体内研究中检出的M6的量要低得多。在服用了300mg DCDQ的禁食和进食受试者之间M6的浓度和M/DCDQ的比率没有明显的统计学差异。尿液中平均M6/DCDQ比率为84-1018。总之，在健康受试者中，DCDQ进行I期和II期代谢，并且氨基甲酰基葡糖苷酸化是主要的代谢途径。与动物研究相反，氨基甲酰基葡糖苷酸化是主要的代谢途径。与动物研究相反，形成氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)是人体中的主要代谢途径，并且M6是人血浆和尿液中的主要药物相关性代谢产物。
表33.经LC/MS定性人血浆和尿液中的DCDQ代谢产物 a保留时间，来源于LC/MS数据 bP＝血浆，U＝尿液 表34健康受试者服用DCDQ后血浆中DCDQ和DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)的浓度(ng/mL) a通过用验证法生物分析人血浆测定DCDQ浓度。4在生物转化中使用由合成的M6得到的标准曲线，经非验证性LC/MS法定量DCDQ的浓度。
b标准偏差未计算； cNA，因为血浆DCDQ水平低于定量水平而未分析。
表35健康受试者服用DCDQ后尿液中DCDQ的浓度(ng/mL)和DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)/DCDQ比率 a通过用验证法生物分析人尿液测定DCDQ浓度。6在生物转化中使用由合成的M6得到的标准曲线，经非验证性LC/MS法定量M6的浓度。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于论文、文本、专利、专利申请、公开和书籍，都通过全文引用并入本文。本申请要求2004年11月5日提交的美国临时申请60/625,335的优先权，其所有内容均通过全部引用并入本文。
权利要求
1.式I的化合物或其可药用的盐
其中
对于各Rn和Rn′，其中n是1-8
各Rn和Rn′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；或者
Rn和对应的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，与其连接的碳一起结合形成C＝O；或者
Rn连同对应的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起结合在其连接的碳之间形成双键，并且各对应的Rn′和R(n+1)′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；
G具有下式
其中用*标记的氮可任选形成N-氧化物；
X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10；
R9是氢、羟基或-OSO3H；
R10是氢、乙酰基、-SO3H、-G或-C(O)-OG；
Z是氢、羟基、-OSO3H或-O-G；
条件是当Z是羟基时，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氢；或者(b)X-Y不是CR9HNR10；并且
另外的条件是当X-Y是CHR9NR10时，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一个不是H。
2.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中Z和R1～R8中至少一个是-OH。
3.权利要求2的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CR9HNR10。
4.权利要求2的化合物或其可药用的盐，其中R9＝R10＝H。
5.权利要求4的化合物或其可药用的盐，其中R7和R8至少一个是-OH。
6.权利要求4的化合物或其可药用的盐，其中R6是-OH。
7.权利要求4的化合物或其可药用的盐，其中R3和R4至少一个是-OH。
8.权利要求4的化合物或其可药用的盐，其中R1、R5、R6、R7和Z至少一个是-OH。
9.权利要求2的化合物或其可药用的盐，其中R9是H且R10是乙酰基。
10.权利要求9的化合物或其可药用的盐，其中R7和R8至少一个是-OH。
11.权利要求2的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CH＝N。
12.权利要求11的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6中至少一个是-OH。
13.权利要求11的化合物或其可药用的盐，其中R2～R4中至少一个是-OH。
14.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一个是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
15.权利要求14的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CR9HNR10。
16.权利要求15的化合物或其可药用的盐，其中R9和R10是H。
17.权利要求15的化合物或其可药用的盐，其中Z、R3和R4至少一个是-O-G。
18.权利要求14的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6、R9和Z中至少一个是-O-G。
19.权利要求14的化合物或其可药用的盐，其中R2和R3一起在其相连的碳之间形成双键，并且R3′和R4至少一个是O-G。
20.权利要求15的化合物或其可药用的盐，其中R4和R4′与其相连的碳一起形成C＝O。
21.权利要求20的化合物或其可药用的盐，其中R10是-G。
22.权利要求15的化合物或其可药用的盐，其中R10是-C(O)O-G。
23.权利要求15的化合物或其可药用的盐，其中R10是乙酰基。
24.权利要求23的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6、R9和Z中至少一个是-O-G。
25.权利要求23的化合物或其可药用的盐，其中R7和R8至少一个是-O-G。
26.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中R1～R9和Z至少一个是-OSO3H。
27.权利要求26的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是-CHR9NR10。
28.权利要求26或27的化合物或其可药用的盐，其中R9＝R10＝H。
29.权利要求28的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6中至少一个是-OSO3H。
30.权利要求28的化合物或其可药用的盐，其中R2和R3至少一个是-OSO3H。
31.权利要求28的化合物或其可药用的盐，其中R3是-OSO3H。
32.权利要求26或27的化合物或其可药用的盐，其中R9和Z至少一个是-OSO3H。
33.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CR9HNR10，而R9是H且R10是-SO3H。
34.权利要求33的化合物或其可药用的盐，其中至少两个Rn和对应的Rn+1，其中n＝1-5，在其相连的碳之间形成双键。
35.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中Rn和对应的Rn′与其相连的碳一起形成C＝O。
36.权利要求35的化合物或其可药用的盐，其中R4和对应的R4′与其相连的碳一起形成C＝O。
37.权利要求36的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CR9HNR10。
38.权利要求36或37的化合物或其可药用的盐，其中R10是-G。
39.权利要求36或37的化合物或其可药用的盐，其中R9和R10是H。
40.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是C(O)NH。
41.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CH＝N。
42.权利要求41的化合物或其可药用的盐，其中R1～R6中至少一个是-OH。
43.权利要求42的化合物或其可药用的盐，其中R2～R4中至少一个是-OH。
44.权利要求42的化合物或其可药用的盐，其中R6和R7之间的氮形成N-氧化物。
45.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中至少一个Rn和对应的Rn+1，其中n＝1-5，在其相连的碳原子之间形成双键，并且各Rn和R(n+1)′独立地是氢、羟基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。
46.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中n＝2。
47.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中R2′＝H，且R3′或R4是-O-G。
48.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中X-Y是CHR9NR10。
49.权利要求48的化合物或其可药用的盐，其中R9＝R10＝H。
50.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中至少两个Rn，各所述的Rn和其对应的Rn+1，其中n＝1-5，在其相连的碳之间形成双键。
51.权利要求50的化合物或其可药用的盐，其中X-Y＝CHR9NR10。
52.权利要求51的化合物或其可药用的盐，其中R10是H；且Z或R9是-OSO3H。
53.权利要求50的化合物或其可药用的盐，其中R9＝R10＝H。
54.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中R9是H且R10是-SO3H。
55.权利要求45的化合物或其可药用的盐，其中R9是H且R10是乙酰基。
56.一种制备式M6的化合物的方法
包含
在偶合试剂存在下，在充足的条件下，化合物6a
其中各L、L1和L2是离去基团；
和DCDQ
反应，生成化合物7
并除去所述离去基团L1和L2。
57.权利要求56所述的方法，其中L具有下式
58.权利要求56所述的方法，其中L1和L2独立地选自低级烷基和乙酰基。
59.权利要求56所述的方法，其中L1是甲基且各L2是乙酰基。
60.权利要求56所述的方法，进一步包含
通过除去化合物7葡糖醛酸基部分的L1和L2保护基团将化合物7脱保护，从而形成所述的M6代谢物。
61.权利要求56所述的方法，其中所述的偶合试剂选自BOP、DCC和EDC。
62.权利要求56所述的方法，其中所述的偶合试剂是BOP。
63.权利要求56所述的方法，其中化合物6和所述偶合试剂及DCDQ的所述反应在胺存在下进行。
64.权利要求63所述的方法，其中所述的胺是许尼希氏碱。
65.权利要求63所述的方法，其中化合物6和所述偶合试剂及DCDQ的所述反应在溶剂中进行。
66.权利要求65所述的方法，其中所述的溶剂是CH2Cl2。
67.权利要求60所述的方法，其中所述的化合物7在脱保护之前经柱色谱法纯化。
68.权利要求60所述的方法，其中所述的脱保护在碱存在下在醇中进行。
69.权利要求68所述的方法，其中所述的碱选自NaOH、LiOH和KOH。
70.权利要求68所述的方法，其中所述的醇是低级烷基醇。
71.权利要求68所述的方法，其中所述的脱保护用MeOH/H2O/THF中的LiOH·H2O进行。
72.权利要求71所述的方法，其中MeOH/H2O/THF的比率约为2.5∶1.0∶0.5。
73.权利要求71所述的方法，其中所述的脱保护在0℃进行1小时。
74.权利要求60所述的方法，其进一步包含纯化所述的M6代谢物。
75.权利要求57所述的方法，其中化合物6a使用催化剂和亲核试剂通过除去化合物5的烷基保护基制备
76.权利要求75所述的方法，其中所述的催化剂是Pd(PPh3)4。
77.权利要求75所述的方法，其中所述的亲核试剂是吗啉。
78.权利要求75所述的方法，其中化合物5如下制备在充足的条件下，羧酸2
和DPPA反应得到酰基叠氮化合物中间体；
在充足的条件下加热得到的酰基叠氮化合物中间体得到异氰酸酯3
并且
在充足的条件下用2，3，4，-三乙酰基-1-羟基葡糖醛酸酯4
处理所述加热步骤的产物，得到化合物5。
79.权利要求78所述的方法，其中所述的反应步骤在碱存在下进行。
80.权利要求79所述的方法，其中所述的碱是Et3N。
81.权利要求78所述的方法，其中化合物2在催化剂存在下，经联苯二甲酸酐和过量的烯丙醇反应制备。
82.权利要求81所述的方法，其中所述的烯丙醇是丙-2-烯-1-醇。
83.权利要求81所述的方法，所述的催化剂是DMAP。
84.一种选自下式的化合物
或其可药用盐。
85.一种药物组合物，其包含权利要求84的一种化合物或其可药用的盐。
86.一种选自下式的化合物
或其可药用盐。
87.一种药物组合物，其包含权利要求86的一种化合物或其可药用的盐。
88.一种选自下式的化合物
和
或其可药用盐。
89.一种药物组合物，其包含权利要求88的一种化合物或其可药用的盐。
90.一种选自下式的化合物
和
或其可药用盐。
91.一种药物组合物，其包含权利要求90的一种化合物或其可药用的盐。
92.一种选自下式的化合物
或其可药用盐。
93.一种药物组合物，其包含权利要求92的一种化合物或其可药用的盐。
94.一种选自下式的化合物
和
或其可药用盐。
95.一种药物组合物，其包含权利要求94的一种化合物或其可药用的盐。
96.一种选自下式的化合物
和
或其可药用盐。
97.一种药物组合物，其包含权利要求96的一种化合物或其可药用的盐。
98.一种组合物，其包含权利要求1～55任意一项的化合物或其可药用的盐以及一种或多种可药用载体。
99.一种治疗方法，其包含给予所述患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用的盐，或者含有这一化合物或盐的组合物，所述患者患有以下疾病精神分裂症、精神分裂症样精神障碍、精神分裂性精神障碍、妄想性精神障碍、物质诱发的精神障碍、L-DOPA-诱发的精神病、阿尔茨海默氏痴呆相关性精神病、帕金森氏病相关性精神病、Lewy体病相关性精神病、痴呆、记忆缺陷或阿尔茨海默氏病相关性智力缺陷疾病。
100.权利要求99所述的方法，其中所述患者患有精神分裂症。
101.一种治疗方法，其包含给予所述患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用的盐，或者含有这一化合物或盐的组合物，所述患者患有以下疾病双相性精神障碍、抑郁症、情绪发作、焦虑症、适应障碍或进食障碍。
102.权利要求101所述的方法，其中所述双相性精神障碍是I型双相性精神障碍、II型双相性精神障碍或循环情感性精神障碍；所述抑郁症是严重抑郁症、情绪恶劣性障碍或物质诱发的情感障碍；所述情绪发作是严重抑郁症发作、躁狂发作、混合型发作或轻度躁狂发作；所述焦虑症是惊恐发作、广场恐怖症、恐慌症、特定恐惧症、社交恐惧症、强迫症、创伤后应激障碍、急性应激障碍、泛化性焦虑症、分离性焦虑症或物质诱发性焦虑症。
103.权利要求102所述的方法，其中所述的症状是抑郁症、双相性精神障碍或情绪发作。
104.一种治疗方法，其包含给予所述患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用的盐，或者含有这一化合物或其可药用的盐的组合物，所述患者患有以下疾病癫痫、睡眠障碍、偏头痛、性功能障碍、药物成瘾、酒精成瘾、胃肠道疾病或肥胖症。
105.一种治疗方法，其包含给予所述患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用的盐，或者含有这一化合物或其可药用的盐的组合物，所述患者患有以下疾病创伤、中风或脊髓损伤相关性中枢神经系统缺陷。
106.权利要求1的化合物或其可药用的盐，其中Z、各Rn和各Rn′是H；并且X-Y是CR9HNR10。
107.权利要求106的化合物或其可药用的盐，其中R9是H。
108.权利要求106的化合物或其可药用的盐，其中R9是H且R10是-C(O)-OG。
109.一种组合物，其含有一种权利要求106-108任意一项的化合物或其可药用的盐和一种或多种可药用载体。
全文摘要
本发明涉及某些[1，4]二氮杂并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代谢产物及其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及式I化合物，其中各取代基在本文定义。本发明还提供了包括式I化合物的药物组合物、制备这些化合物的方法和使用这些化合物的方法。
文档编号A61K31/551GK101124225SQ200580044953
公开日2008年2月13日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月5日
发明者A·C·贝奇二世, P·S·拉马穆蒂, 仝泽恩, 志 王, W·德梅奥, R·A·乔丹, G·P·斯塔克, 汪有初 申请人:惠氏公司