专利名称：2－苯基－1,2－苯并异硒唑－3(2h)－酮在制备抗运动疲劳药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮的用途，尤其涉及到在抗运动疲劳药物领域中的用途。
背景技术：
目前，已普遍认为运动时将产生大量的氧自由基，尤其是长时间的亚极量运动。近年来的许多研究证实了运动疲劳的自由基学说。运动时氧自由基生成增多与运动能力下降关系密切的主要发现是氧自由基使机体内各种器官的生物膜产生脂质过氧化，其分解终产物之一丙二醛可以由生成部位扩散到其它部位产生毒性作用，也可以引起其它物质产生过氧化作用的连锁反应，使机体的正常生理、生化过程发生紊乱。
运动时自由基生成增多引起脂质过氧化反应以及其它毒性反应的机制目前主要认为有几个方面运动时机体氧消耗量增多，增加了血红蛋白的载氧负荷，氧合血红蛋白的自氧化以及肌肉、心肌等部位线粒体呼吸作用增强，泛半醌转运率加快等都可以生成自由基；运动应激时儿茶酚胺大量分泌，可提高心肌和骨骼肌的氧化代谢，并激活β-肾上腺素受体，经线粒体通路使活性氧生成增加；大强度运动可模拟缺血再灌注造成对机体的损伤，并激活黄嘌呤氧化酶通道；底物如葡萄糖、糖原的耗竭排空和/或者产物如乳酸的堆积；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸/尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸比值变化，引起依赖此二者作为辅酶的许多抗氧化酶的功能下降，从而造成细胞氧化还原状态的紊乱；运动时体温的升高；进行比自身训练水平强度不相符的较为激烈的运动。
自由基对机体的损伤程度与谷胱甘肽抗氧化系统水平有密切的关系。1988年Thomas等进行细胞体外实验发现，还原型谷胱苷肽耗竭的细胞对外源性的氧化损伤、过氧化氢和其它一些氧化物的敏感性增加。运动训练与谷胱甘肽抗氧化系统有密切的关系，在运动训练中如何提高机体谷胱甘肽抗氧化系统的能力、防止自由基的损伤，对提高运动能力，消除运动疲劳必将有重要的现实意义。
运动时通过某些因素诱发细胞凋亡，诱发细胞凋亡的信号有糖皮质激素、下调的生长因子、活性氧自由基、细胞内高钙离子和肿瘤坏死因子等。大强度运动时糖皮质激素、细胞内钙浓度和活性氧自由基产物均升高，通过细胞内外蛋白作用可引起细胞凋亡。
目前已证实，适宜的运动负荷可增加机体抗自由基的能力，提高超氧化物歧化酶活性。虽然比安静休息时产生的自由基多，存在细胞凋亡，但仍未超出机体防御能力，不至于产生不可逆转的损伤。过多的或离心的运动，自由基增多超过机体负荷并产生缺血、缺氧，可在炎症反应后引起明显机械损伤，导致过多的细胞凋亡和坏死。而凋亡是部分可逆的过程，可以通过适当的治疗手段来减少细胞凋亡的发生。
目前在临床上用于治疗运动性疲劳的药物有助阳补虚类中成药、氨基酸类药物、肌酸等，用于增加合成代谢和肌肉力量。有1， 6一二磷酸果糖(FDP)、肌酸、L-肉毒碱、丙酮酸盐等，用于促进能量代谢。还有维生素E、维生素C和辅酸Q10，用于抗氧化、调节内环境稳态。上述西药的主要缺点是时效性较强、副作用大、药物依赖强，影响运动员的长期服用。中药调节能力比较强、副作用小，但见效慢，很难适应竞技体育中高强度的运动训练。
2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮是一种有机硒杂环化合物，是由日本第一制药和德国Nattermann公司开发的新型抗炎药，又叫PZ51。1983年由Welter等首先合成，其化学结构式如下 80年代中期，研究者发现2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮具有与谷胱甘肽过氧化物酶相似的酶活性。又因其结构中的硒元素位于一个五元杂环内，在体内不能游离出来，其毒性相比无机硒酸钠低很多，因此2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮被公认为谷胱甘肽过氧化物酶的良好模拟物，目前倍受关注。已有众多学者用多种疾病的动物模型对其治疗各种疾病的潜力进行了广泛的研究。2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮结构中异硒唑杂环上的次硒酰胺键对2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮及其类似物GSH-Px样催化活性具有重要意义。研究表明，2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮可在多种炎症模型中均表现出较好的抗炎活性，且没有非甾体抗炎药的胃肠道刺激作用，在德国和日本已经被临床上用于抗炎症抗肿瘤等疾病。目前尚未发现2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮在抗运动疲劳的应用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述药物的缺点，为2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮提供一种新的用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮在制备治疗抗运动性疲劳药物中的应用。
2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮由成都兢鹏生化科技有限公司生产。有效成分2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮制备治疗抗运动性疲劳的药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的常规药用制剂含作为活性成分的2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内给药的有机或无机的固体赋形剂混合。该药用制剂可以是固体形式如片剂、胶囊剂。
上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂、增溶剂和其它常用的添加剂，如乳糖、滑石粉、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果胶、吐温-80、聚乙烯醇等。
上述制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮治疗抗运动性疲劳的药物中2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮含有重量比为0.1～99.5％的活性成分，优选含有重量比为0.5～95％的活性成分。
活性成分2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮制成各种剂型的口服药物，成人口服，常用剂量-次0.48g，1日1次，最大剂量的2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮含量应为每天0.96g，运动前2小时服用。
活性成分2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮经过药效试验证明，它具有较强的抗脂质过氧化、清除过度训练所产生的自由基，抑制运动中细胞凋亡的发生，维持运动器官的正常形态结构和功能，延缓运动中疲劳的发生，提高大鼠跑台运动能力。
图1为安静对照组大鼠心肌的透射电子显微镜照片。
图2为运动对照组大鼠心肌的透射电子显微镜照片。
图3为运动加药组大鼠心肌的透射电子显微镜照片。
图4为安静对照组大鼠骨骼肌的透射电子显微镜照片。
图5为运动对照组大鼠骨骼肌的透射电子显微镜照片。
图6为运动加药组大鼠骨骼肌的透射电子显微镜照片。
图7为安静对照组大鼠肝组织的透射电子显微镜照片。
图8为运动对照组大鼠肝组织的透射电子显微镜照片。
图9为运动加药组大鼠肝组织的透射电子显微镜照片。
图10为安静对照组大鼠肝组织的原位缺口末端标记染色照片。
图11为运动对照组大鼠肝组织的原位缺口末端标记染色照片。
图12为运动加药组大鼠肝组织的原位缺口末端标记染色照片。
图13为安静对照组大鼠骨骼肌原位缺口末端标记染色照片。
图14为运动对照组大鼠骨骼肌原位缺口末端标记染色照片。
图1 5为运动加药组大鼠骨骼肌原位缺口末端标记染色照片。
图1 6为安静对照组大鼠心肌原位缺口末端标记染色照片。
图17为运动对照组大鼠心肌原位缺口末端标记染色照片。
图18为运动加药组大鼠心肌原位缺口末端标记染色照片。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1以制备含有活性成分2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮片剂1000片为例所用的原料和辅料及其配比如下2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮240g淀粉至400g采用药剂学常规片剂的制备工艺制成，每片重0.4g，含2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮0.24g。用法成人一日1次，每次2片，一日最大剂量为0.96g，运动前2小时服用。
实施例2以制备含有活性成分2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮胶囊剂1000粒为例所用的原料和辅料及其配比如下2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮240g淀粉 加至300g采用药剂学常规胶囊剂的制备工艺制成，每粒重0.3g，含2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮0.24g。用法成人一日1次，每次2粒，一日最大剂量为0.96g，运动前2小时服用。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明而并非限制，尽管参照以上较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
为了验证2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮的抗疲劳效果，发明人采用2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮进行了药效试验，各种试验情况如下试验目的采用整体动物试验，观察2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮的抗运动疲劳作用。
受试药物2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮，分子式为C13H9NOSe，分子量(M.W.)为274，易溶于二甲基亚砜(DMSO)，CAS登记号CAS[60940-34-3]，外观呈浅黄色晶体，纯度大于98％，熔点为mp.180-182。2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮由成都兢鹏生化科技有限公司生产。
对照药品和试剂蛋白定量(双缩脲)试剂盒，南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所；丙二醛(MDA)测试盒，南京建成生物工程研究所；总抗氧化能力(T-AOC)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽-S转移酶(GST)测试盒，南京建成生物工程研究所；过氧化氢酶(CAT)测试盒，南京建成生物工程研究所；一氧化氮测试盒，南京建成生物工程研究所；一氧化氮合成酶(NOS)测试盒，南京建成生物工程研究所；酸脱氢酶(LDH)测试盒，南京建成生物工程研究所；细胞凋亡(TUNEL)测试盒，南京建成生物工程研究所；BCL-2(0.1ml)，武汉博士得生物工程有限公司；BAX(0.1ml)，汉博士得生物工程有限公司；即用型SABC试剂盒，汉博士得生物工程有限公司；粘片剂APES胶，汉博士得生物工程有限公司；无水乙醇(AR)，西安市化学试剂厂；乙醚(AR)，中国医药集团上海化学试剂公司；0.1M磷酸缓冲夜(PBS)，自制；0.01M枸橼酸盐缓冲液，自制；冰醋酸(AR)，天津市化学试剂三厂；戊二醛(AR)50％，成都市科龙化工试剂厂；多聚甲醛，南京建成生物工程研究所；福尔马林，自制；二甲基亚砜(DMSO)(AR)，上海光铧科技有限公司。
实验仪器电动跑台，中国杭州段氏制作；透射式电子显微镜(H-600)，日本日立公司；超薄切片机，瑞典LKB公司；微波炉，市售商品；光学显微镜(OLYPAS)，日本产；TGL-16G台式高带冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；721B型分光光度计，上海第三分析仪器厂；751B型紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；DK-98-1A恒温浴锅，天津泰斯特有限公司；BCD-203A容声冰箱，中国科龙电器股份有限公司；TN-100托盘扭力天平，武汉自动化仪表厂；Bonso-TCS-2000A电子称，武汉自动化仪表厂；R-200D型电子称，德国；MP-200-1型双圈版电子称，上海第二天平仪器厂；高压锅，市场销售商品；石腊切片机，市场销售商品；BX51数码摄取像系统，日本OLYMOUS产品；Motic Images advanced图象分析系统，北京航空航天大学产品。
实验动物雄性健康大鼠50只，体重180-220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。按国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，动物室温度23℃±5℃，相对湿度40％-70％，分笼饲养备用。
1、建立实验动物模型实验动物适应性饲养7天后，以15m/min，5min/d运动量对动物进行为期3天的筛选，淘汰个别不适应跑台训练者。将剩余大鼠随机分为3组安静对照组8只、运动对照组16只、运动加药组16只，在最后一次训练时，再将运动对照组和运动加药组随机分出两个亚组，即运动力竭组8只和加药力竭组8只。
力竭判定标准动物跟不上预定速度、大鼠臀部压在笼具后壁、后肢随转动皮带后拖达30秒、毛刷刺激驱赶无效；行为特征为呼吸深急、幅度大，神情疲倦，俯卧位，垂头，刺激后无反应。
每天训练前以15m/min的速度做适应运动5min后正式训练，训练模型基于Bedford模型结合实际略加调整，为期8周。实验动物运动方案见表1。
表1实验动物运动方案
室内温度和相对湿度的测定用普通水银温度计和干湿度计测定。
大鼠体重的测定用电子称每次训练前测定。
2、给药方法将2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮溶于5％的二甲基亚砜生理盐水溶液中，用量为50mg/kg/d，灌胃给运动加药组，其它两组灌服给同等量的生理盐水作为对照。二甲基亚砜分子式为(CH3)2SO，常温为无色透明液体，具有高极性、高吸湿性、高沸点及可燃性，毒性极低，能溶于水等大多数有机物，是一种强极性溶剂。
3、制备实验样品第八周最后1天，除对照力竭组和加药力竭组在力竭运动后记录力竭时间、称重外，其余三组即安静对照组、运动对照组和运动加药组大鼠称重后，用乙醚麻醉，断头取血，迅速取脑、肾、肝、心、以及股四头肌置于预冷的生理盐水中洗净血污，迅速切取2mm×2mm×2mm的心、肝、肌的组织块立即置于预先备好的2.5％戊二醛固定液中4℃固定；迅速切取1cm×1cm×0.2cm的组织块后立即置于4％的中性多聚甲醛液中固定以备细胞凋亡和免疫组化检测使用；其余组织用滤纸吸干后置于-20℃冰箱保存备用。
制备血清取血后置37℃水浴中30min，以2500～3000转/分离心10分钟，提取上清即血清并于4℃冰箱保存备用。
制备组织匀浆称取适量组织(0.2～1g)按W(g)组织块重量/V(ml)匀浆介质为1/9的比例加取预冷的匀浆介质[pH7.4，0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)，0.0001mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)，0.01mol/L蔗糖，0.8％的氯化钠溶液]于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块(以上全部操作在冰水浴中进行)。手工制备匀浆后，3000转/分低温离心10～15分钟，分离提取上清液4℃冰箱冷藏或-20℃冰箱冰冻备用，弃去下面沉淀。
统计学处理由SPSS统计软件进行数据处理，常规方法计算均值±标准差 ±s)，进行t检验，确定差异的显著性。
4、实验结果(1)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠血清部分指标的影响实验方法按试剂盒要求，取血清1ml，分别测试大鼠血清丙二醛(MBA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱苷肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)含量，测试方法按以上各试剂盒要求进行测试。测试结果见表2。
表2 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠血清部分指标的影响
注▲表示与安静对照组(A)相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组(A)相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组(B)相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组(B)相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表2结果显示，运动对照组和运动加药组大鼠血清的丙二醛含量较安静对照组均呈极显著性升高(P＜0.01)，与运动加药组相比运动对照组的丙二醛则有所下降，有显著性差异(P＜0.01)。与安静对照组相比，运动对照组的抗氧化酶如总超氧化物歧化酶、铜锌超氧化物歧化酶、谷胱苷肽过氧化物酶、谷胱苷肽硫转移酶、过氧化氢酶的酶活性都显著下降，运动加药组.此类酶活性则较运动对照组有显著性升高(P＜0.01)，与安静对照组相比，除谷胱苷肽过氧化物酶升高、具有显著性差异，总超氧化物歧化酶虽然有升高趋势，但并无显著性差异、仍然没有达到安静时的水平之外，其它运动加药组大鼠酶活性均较安静对照组有升高趋势、但并无显著性差异(P＞0.05)。运动对照组的血清总抗氧化能力较安静对照组相比呈显著性下降趋势，而运动加药组较安静对照组和运动对照组都有显著性升高。就血清的一氧化氮合酶总量以及诱导性一氧化氮合酶的酶活性而言，运动加药组和运动对照组大鼠血清的一氧化氮合酶酶活性较安静对照组相比均有显著升高，但两组间比较则无显著差异。运动对照组大鼠与运动加药组大鼠血清一氧化氮的含量与安静对照组相比，相应地也呈现升高趋势，其中运动对照组相比安静对照组有差异显著性，运动对照组和运动加药组两组间进行比较则发现运动加药组一氧化氮的含量虽然有所下降，经统计处理后并无显著性差异。
(2)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织丙二醛含量的影响实验方法分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.2ml，测试丙二醛(MDA)含量，测试方法按照丙二醛(MDA)试剂盒要求进行测试。
测试结果见表3。
表3 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织MDA含量的影响(单位nmol/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表3结果显示，运动对照组大鼠肝、肾、心、脑以及股四头肌丙二醛的含量较安静对照组相比，均有升高，且除肾组织外，其余脏器这种升高都具有差异显著性(P＜0.01)，肾组织有升高趋势但并无差异显著性。加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮以后，运动加药组各大鼠的上述组织中丙二醛含量都呈下降趋势且均较运动对照组相比有显著性差异，除肾组织外其余组织丙二醛含量虽然有下降却仍然高于安静对照组，其中心肌、股四头肌和脑组织的含量仍然显著高于安静对照组，肾组织中的含量低于安静对照组，有下降趋势，并不具统计学意义。
(3)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织总超氧化物歧化酶活性的影响实验方法分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.05ml，测试总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量，测试方法按照总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒要求进行测试。
测试结果见表4。
表4 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织T-SOD活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表4结果显示，运动对照组大鼠各组织中总超氧化物歧化酶活性与安静对照组大鼠相比，均呈显著性下降(P＜0.05)，其中肝组织更具极显著性下降(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对运动大鼠进行干预后，上述各组织中总超氧化物歧化酶活性均有显著性升高(P＜0.05)，其中肝、心肌、股四头肌的差异更具极显著性(P＜0.01)，与安静对照组相比，仅肝和股四头肌中的总超氧化物歧化酶活性仍有显著性升高，值得注意的是，脑中该酶的活性虽然有所回升但仍没有达到安静时的水平，而在肾组织中，酶活力虽然高于安静对照组却仅有趋势而无差异显著性。
(4)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织铜锌超氧化物歧化酶活性的影响实验方法分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.2ml，测试铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)含量，方法按照铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)试剂盒要求进行测试。测试结果见表5。
表5 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织CuZn-SOD活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表5表明，大强度耐力训练大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾各组织中铜锌超氧化物歧化酶活性较安静对照组均有所下降，除肝组织只是具有下降趋势外，其余各组织均有显著性差异(P＜0.05)；加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后，运动加药组大鼠各组织中铜锌超氧化物歧化酶活性比运动对照组均极显著升高(P＜0.01)，与安静对照组相比，仅股四头肌和肾组织中该酶活性仍然显著性升高(P＜0.05)，肝和心肌则只具有这种趋势，并不具差异显著性(P＞0.05)，加药后脑组织中酶活性虽然显著高于运动对照组，但没有达到安静时的水平。
(5)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织谷胱苷肽过氧化物酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.1ml，测试谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)含量，测试方法按照谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒要求进行测试。测试结果见表6。
表6 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织GSH-Px活性的影响(单位酶活力单位)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表6结果显示，大强度耐力训练造成大鼠各组织谷胱苷肽过氧化物酶的活性较安静对照组都有所下降。在肝组织中，虽然有下降趋势，但并无差异显著性；心肌和肾组织则呈极显著性下降(P＜0.01)，脑和股四头肌呈显著性下降(P＜0.05)。加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮干预后，该酶活性较运动对照组相比有所回升，除股四头肌只有回升的趋势外，其余均有显著性差异(P＜0.05)；只有肝组织和心肌中酶活力同时高于安静对照组有差异显著性，而脑、肾和股四头肌中加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮干预以后，虽然酶活力有所回升，但仍低于安静对照组，其中在股四头肌中该酶活力仍然显著低于安静对照组，在肾和脑组织中则相差不大。
(6)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织谷胱苷肽硫转移酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌和肾组织匀浆0.1ml，测试谷胱苷肽硫转移酶(GST)含量，测试方法按照谷胱苷肽硫转移酶(GST)试剂盒要求进行测试。测试结果见表7。
表7 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织GST活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表7结果表明，大强度耐力训练后，与安静对照组相比，运动对照组心肌和肾组织中谷胱苷肽硫转移酶的活性有所下降，具极显著性差异(P＜0.01)，运动对照组大鼠的肝组织中谷胱苷肽硫转移酶活性却呈显著性升高(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮干预后，肝、肾和心肌各组织中该酶活力较运动对照组相比都呈显著性上升趋势(P＜0.05)，心肌和肾组织中这种升高更具极显著性意义(P＜0.01)；与安静对照组相比，心肌和肝组织中该酶含量仍具极显著性升高，肾组织中该酶活力虽然有所升高却仍然低于安静对照组，而二者之间相比并无差异显著性(P＞0.05)。
(7)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织乳酸脱氢酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌和股四头肌匀浆0.1ml，测试乳酸脱氢酶(LDH)含量，测试方法按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒要求进行测试。测试结果见表8。
表8 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织LDH活性的影响(单位U/g prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表8结果表明，大强度耐力训练后，肝、心肌和股四头肌各组织中乳酸脱氢酶活性较安静对照组均呈显著性升高(P＜0.05)，其中心肌和肝组织中这种差异更具极显著性差异(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后，抑制了这种升高的趋势，该酶活力较运动对照组相比都有不同程度的下降，具统计学意义(P＜0.05)，其中肝组织中的这种差异更具显著性意义(P＜0.01)；相比安静对照组，运动加药组上述各组织中该酶的活力仍然有所升高，在心肌和肝组织中这种升高仍具有显著性差异(P＜0.05)，股四头肌中，该酶的活力已经接近于安静组，两相比较仍无差异显著性(P＞0.05)。
(8)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织过氧化氢酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌和肾组织匀浆0.2ml，测试过氧化氢酶(CAT)含量，测试方法按照过氧化氢酶(CAT)试剂盒要求进行测试。测试结果见表9。
表9 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织CAT活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表9结果表明，长期大强度耐力训练后，大鼠心肌和肾组织中过氧化氢酶活性呈下降趋势，而肝组织中则基本没有明显变化，与安静对照组相比，无差异显著性。加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后，该酶活力有所回升，肝和肾组织中比运动对照组有差异显著性(P＜0.05)，心肌的过氧化氢酶的活性呈上升趋势，但无差异显著性。
(9)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织总抗氧化能力的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.1ml，测试总抗氧化能力(T-AOC)含量，测试方法按照总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒要求进行测试。测试结果见表10。
表10 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织T-AOC的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表10结果表明，长期大强度耐力训练后大鼠体内各组织总抗氧化能力均有下降趋势，心肌的这种下降呈现差异显著性(P＜0.05)，肾组织则更具极显著性差异(P＜0.01)；运动加药组各组织的总抗氧化能力比运动对照组均有显著性升高(P＜0.05)，其中心肌和肾组织显著性升高(P＜0.01)，与安静对照组相比，肝组织和脑组织的总抗氧化能力虽然有所升高但仍然只是一种趋势，并无统计学意义(p＞0.05)，其余各组织较安静对照组同时呈显著性升高趋势。
(10)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织总一氧化氮合酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.05ml，测试总一氧化氮合酶(总NOS)含量，测试方法按照总一氧化氮合酶(总NOS)试剂盒要求进行测试。测试结果见表11。
表11 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织总NOS活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表11结果表明，所有运动大鼠上述各组织中一氧化氮合酶活力均较安静对照组有所升高。运动加药组和运动对照组大鼠肝、心肌和肾组织中一氧化氮合酶酶活性与安静对照相比呈显著升高(P＜0.05或者P＜0.01)；两者之间相互比较，运动加药组中只有股四头肌中NOS酶活性较运动对照组相比仍然有所升高，并无统计学差异；心肌则显著性降低，肝脏、肾脏、脑组织中也相应地表现出了这一趋势，经统计后发现无差异显著性(P＞0.05)。
(11)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织诱导型一氧化氮合酶活性的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.05ml，测试诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量，测试方法按照诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒要求进行测试。测试结果见表12。
表12 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织iNOS活性的影响(单位U/mg prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表12结果表明，所有运动大鼠各组织的iNOS活性均较安静对照组有所增高，均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；运动加药组各组织中除脑组织外iNOS的活性虽然比运动对照组有下降趋势，经过统计学比较，无显著性差异；心肌则是一个例外，其iNOS活性仍然高于运动对照组，经过统计学分析并没有差异显著性(P＞0.05)。
(12)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠部分组织一氧化氮含量的影响实验方法按试剂盒要求分别取大鼠肝、心肌、股四头肌、脑和肾组织匀浆0.1ml，测试一氧化氮(NO)含量，测试方法按照一氧化氮(NO)试剂盒要求进行测试。测试结果见表13。
表13 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠部分组织NO含量的影响(单位μmol/g prot)
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表13的结果显示，运动后大鼠体内各组织的一氧化氮含量都有不同程度的升高，尤其是在股四头肌，呈极显著性升高(P＜0.01)，肾脏和心肌中这种升高只具有显著性差异(P＜0.05)，而肝脏和大脑中则仅仅表现为一种趋势，经统计学处理后并没有统计学意义。与运动对照组相比，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮干预后，大鼠各组织一氧化氮含量不同程度地出现下降，特别是在肝脏和股四头肌中出现显著性下降，其余组织则同样仅表现出下降的趋势，肾脏中一氧化氮的含量变化不明显，基本与运动对照组水平持平，但仍高于安静对照组；与安静对照组相比，运动加药组其它组织NO的含量仍然较高，在肝脏和股四头肌中仍有显著性差异(P＜0.05)，心脏和组织中则只是一种趋势，无统计学意义。
(13)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达的灰度值的影响实验方法肝脏切片，常规脱蜡，用Bcl-2、Bax试剂盒，按照其操作步骤严格操作，显微镜观察。照相，扫描灰度值，数据处理。结果见表14。
表14 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达的灰度值的影响
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表14的结果显示，运动对照组大鼠肝细胞Bcl-2蛋白的灰度值较安静对照组升高，加药后表现为显著下降，极显著低于安静对照组。运动后Bax灰度值比安静对照组显著降低，加入药物干涉后，比运动对照组有所升高，但仍然低于安静对照组大鼠值。Bax/Bcl-2运动后显著下降，加入药物后该值比运动对照组呈显著升高，高于安静对照组但并无差异显著性。
(14)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax表达的灰度值的影响实验方法心肌切片，常规脱蜡，用Bcl-2、Bax试剂盒，按照其操作步骤严格操作，显微镜观察。照相，扫描灰度值，数据处理。结果见表15。
表15 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax表达的灰度值影响
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表15的结果表明，心肌细胞Bcl-2的灰度值运动对照组较安静对照组有显著性升高，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后有降低且低于安静对照组，具有显著性差异。运动对照组Bax灰度值比安静对照组呈极显著下降，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后比运动对照组有所升高，具有显著性差异，仍低于安静对照组无统计学意义。Bax/Bcl-2的比值运动对照组较安静对照组显著下降，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后基本回升至安静时水平。
(15)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠骨骼肌Bcl-2、Bax表达的灰度值的影响实验方法骨骼肌切片，常规脱蜡，用Bcl-2、Bax试剂盒，按照其操作步骤严格操作，显微镜观察。照相，扫描灰度值，数据处理。
测试结果见表16。
表16 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠骨骼肌细胞Bcl-2、Bax表达的灰度值影响
注▲表示与安静对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，▲▲表示与安静对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)；#表示与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，##表示与运动对照组相比有极显著性差异，(P＜0.01)。
表16数据显示，骨骼肌细胞Bcl-2的灰度值运动对照组比安静对照组有显著性升高，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后有所降低且低于安静对照组，具有显著性差异。运动对照组Bax灰度值比安静对照组呈极显著性下降，加入药物后较运动对照组有所升高且具有差异显著性，低于安静对照组，经统计并无差异显著性。Bax/Bcl-2的比值运动对照组比安静对照组显著下降，加入2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮后有所回升但仍然低于安静时的水平。
(16)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对跑台训练大鼠力竭时间的影响实验方法第八周最后1天，将运动对照组和运动加药组大鼠分别置于动物跑台上，进行一次性力竭试验并进行力竭时间指标的测试。力竭判定标准为动物跟不上预定速度、大鼠臀部压在笼具后壁、后肢随转动皮带后拖达30秒、毛刷刺激驱赶无效。行为特征为呼吸深急、幅度大、神情疲倦、俯卧位、垂头、刺激后无反应。测试结果见表17。
表17 2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大鼠力竭时间的影响(单位min)
注▲表示运动加药组力竭时间与运动对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
表17结果表明，2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮可以显著性延长大鼠跑台运动至力竭的时间，与运动对照组相比，运动加药组力竭时间延长了26.98％。
(17)心肌、肝组织和股四头肌的透射电镜观察①心肌的透射式电子显微镜观察实验方法取心肌样品，切成1mm×1mm×1mm的小块，循透射式电镜观察要求，做前期样品处理，然后在日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照。观测结果见图1～3。
安静对照组由图1可见，该组大鼠心肌细胞较大，呈梭形，细胞核椭圆形或不规则，位于细胞的中央。心肌细胞内含有大量的肌原纤维，其肌节整齐，排列规则，Z线结构清晰。多数心肌细胞因肿胀导致肌纤维结构疏松，部分肌纤维溶解。心肌纤维之间可见到肿胀的线粒体，线粒体圆形或椭圆形，线粒体嵴间隙因水肿而增宽，肌纤维间可见到少量的肌浆网及散在的糖原颗粒。两相邻心肌细胞间心润盘连接。
运动对照组由图2可见，该组大鼠心肌细胞明显肿胀，肌纤维结构疏松，部分肌纤维溶解、断裂，肌纤维溶解的区域被增生的线粒体充填，线粒体明显肿大、增生，体积增大，线粒体嵴间隙增宽，细胞核形状不规则，核内染色质呈团块状凝集，边集。
运动加药组由图3可见，该组大鼠心肌细胞结构基本正常，肌原纤维排列整齐，肌节结构清晰，心肌纤维线粒体仍有增生，且有轻度肿胀，细胞核近椭圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显。
②骨骼肌的透射式电子显微镜观察实验方法取骨骼肌样品，切成1mm×1mm×1mm的小块，按透射式电镜观察要求，做前期样品处理，然后在日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照。观测结果见图4～6。
安静对照组由图4可见，该组大鼠骨骼肌细胞细长，细胞内含有大量的肌原纤维，肌原纤维肌节整齐，I带和A带相间排列，Z线清晰，Z线附近常可见到线粒体及肌浆网，线粒体细长或椭圆形，数量不多，肌原纤维间还可见到糖原颗粒。位于肌膜下的细胞核细长，核内染色质分布均匀。
运动对照组由图5可见，该组大鼠骨骼肌细胞肌原纤维排列紊乱，肌丝局灶性溶解，结构不清晰，I带和A带结构消失，Z线模糊、消失，其间的线粒体减少甚至消失。糖原颗粒散在，细胞核内染色质边集，电子密度增加。
运动加药组由图6可见，该组大鼠细长的骨骼肌细胞内肌原纤维排列非常整齐Z线结构清晰，I带A带清晰可见，肌原纤维间可见到线粒体、肌浆网及糖原颗粒，细胞核细长，核内染色质分布均匀。
③肝组织的透射式电子显微镜观察实验方法取肝组织样品，切成1mm×1mm×1mm的小块，按透射式电镜观察要求，做前期样品处理，然后在日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照。观测结果见图7～9。
安静对照组由图7可见，该组大鼠肝细胞为多角形，细胞核多为圆形，位于细胞的中央，核内染色质分布均匀，细胞质内细胞器丰富，可见到圆形且嵴短小的线粒体、少量的溶酶体、高尔基复合体。细胞内有较多的粗面内质网及囊泡样的滑面内质网，糖原颗粒丰富，可见少量脂滴。两相邻肝细胞间有细胞连接，肝细胞的游离面及毛细胆管的腔面为微绒毛结构，肝窦状隙窦壁的内皮细胞扁平，细胞核椭圆，并突向管腔。
运动对照组由图8可见，该组大鼠肝细胞略有肿胀，细胞核为圆形，核内染色质凝集，细胞质内线粒体增生、肿胀，电子密度降低，糖原颗粒丰富，较安静组略多，粗面内质网及滑面内质网基本正常，窦周隙储脂细胞增多，未见凋亡的肝细胞，可见间质细胞凋亡。
运动加药组由图9可见，该组大鼠肝细胞结构较安静组好，细胞核圆形，核内染色质分布均匀，细胞质内可见到大量的线粒体，线粒体结构清晰，粗面内质网及滑面内质网略有增生用轻度扩张，糖原颗粒增生明显。
(18)对心肌细胞、肝细胞和骨骼肌细胞的脱氧核糖核酸缺口末端标记并染色实验方法心肌、肝组织、骨骼肌标本按常规石蜡包埋。切片脱蜡后，用100％乙醇洗2分钟、95％乙醇洗2分钟、75％乙醇洗2分钟、30％乙醇洗2分钟，蒸馏水5洗分钟，磷酸缓冲液洗3×2分钟，微波增透，蛋白酶K消化，磷酸缓冲液洗3×5分钟，标记，信号转化，加二氨基联苯胺底物显色，并在显微镜下控制显色程度。标记染色结果见图10～18。
由图10～18可见，凋亡细胞的细胞核内特异的3’末端被特殊标记，呈棕褐色染色，核呈圆形或椭圆形，而正常细胞和坏死细胞的细胞核由苏木素染成蓝紫色。本实验运动对照组(A组)及运动加药组(C组)仅见极少量细胞核呈棕褐色，而运动对照组(B组)可见较多大小不等、呈散在分布的棕褐色核的心肌、肝和骨骼肌细胞，加服2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮量后凋亡细胞明显少于运动对照组。
实验结论(1)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮能够明显延长大强度耐力训练大鼠跑台运动至力竭的时间，具有抗疲劳作用。
(2)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮能够显著降低大强度耐力训练大鼠心、肝、肌、脑、肾以及血液中丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽过氧化物酶、谷胱苷肽硫转移酶、过氧化氢酶等的活性，降低乳酸脱氢酶活性，提高运动训练大鼠机体总抗氧化能力，对运动引起的因自由基的过量产生而导致运动疲劳的发生有明显延缓作用。
(3)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮能够降低上述组织总一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶的活性，降低大鼠在大强度耐力训练中一氧化氮的产生，抑制了运动中含氮自由基的过量产生，防止了运动中凋亡的发生，进而延缓运动性疲劳的发生。
(4)2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮能够升高大强度耐力训练大鼠肝、心、骨骼肌中抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白Bax的表达，Bax/Bcl-2比值下降，不利于运动中凋亡的发生，进而延缓疲劳的产生。
(5)在肝、心、骨骼肌中，用原位缺口末端标记法检测发现，凋亡细胞的细胞核内特异的3’末端被特殊标记，呈棕褐色染色，核呈圆形或椭圆形；而正常细胞和坏死细胞的细胞核由苏木素染成蓝紫色。本实验运动对照组及运动加药组仅见极少量细胞核呈棕褐色，而运动对照组可见较多大小不等、呈散在分布的棕褐色核的心肌、肝和骨骼肌细胞。
(6)透射电镜观察结果显示心肌中，运动对照组大鼠细胞明显肿胀，部分肌纤维溶解、断裂，线粒体明显肿大、增生，运动加药组心肌细胞结构基本正常，接近于安静对照组；骨骼肌中，运动对照组大鼠肌原纤维排列紊乱，肌丝局灶性溶解，结构不清晰，I带和A带结构消失，Z线模糊、消失，而运动加药组肌原纤维排列非常整齐，Z线结构清晰，I带、A带清晰可见，结构甚至较安静组好；肝组织中，运动对照组细胞略有肿胀，核内染色质凝集，细胞质内线粒体增生、肿胀，电子密度降低，运动加药组则结构较为正常。2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮对大强度耐力训练大鼠心肌、骨骼肌、肝脏的结构有明显的保护作用。
权利要求
1.2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮在制备治疗抗运动性疲劳药物中的应用。
全文摘要
2－苯基－1，2－苯并异硒唑－3(2H)－酮在制备治疗抗运动性疲劳药物中的应用。活性成分2－苯基－1，2－苯并异硒唑－3(2H)－酮经过药效试验证明，它具有较强的抗脂质过氧化、清除过度训练所产生的自由基，抑制运动中细胞凋亡的发生，维持运动器官的正常形态结构和功能，延缓运动中疲劳的发生，提高大鼠跑台运动能力。
文档编号A61P39/06GK101019863SQ20071001752
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月20日 优先权日2007年3月20日
发明者熊正英, 刘军, 唐量, 张婧 申请人:陕西师范大学