专利名称：一种口服降钙素脂质体及其冻干制剂的制作方法
技术领域：
本发明设计药物制剂领域，具体涉及穿膜肽(D-ArgS)修饰N-三甲基壳聚糖包覆降钙素脂质体及其冻干制剂。
背景技术：
蛋白多肽类药物非注射给药途径的研究与开发长期以来一直是国内外药剂学研究者热衷的领域。其中口服给药因为经济、方便、给药剂量准确，一直是研究者主要努力的方向，但多肽、蛋白质药物的口服递送存在诸多障碍①胃酸的降解作用。胃酸的PH在I
2.5左右，许多肽类和蛋白质类药物在这种环境下丧失绝大部分甚至全部生物活性；②酶的降解作用。胃肠道内酶的降解作用是导致肽类和蛋白质类药物口服生物利用度较低的重要因素之一。肽类或蛋白质类药物口服后，首先被胃液中的胃蛋白酶降解成短链肽。药物进入肠道后进一步被胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶及羧肽酶等降解。绝大多数肽类和蛋白质类药物在胃肠道中被降解成氨基酸或由2 6个氨基酸组成的小分子肽。③胃肠道黏膜的低透过性。多数肽类和蛋白质类药物的分子量较大，脂溶性较差，不利于通过生物膜。此外，覆盖在黏膜上皮细胞表面的黏液凝胶层也形成了大分子吸收的物理屏障。④肝脏代谢。即使有少数部分药物被吸收，仍可遭遇肝脏代谢酶的影响而失活。降钙素(CT)是由甲状腺滤泡旁细胞(C-细胞)产生的32个氨基酸组成的多肽类激素药物，由Hirsh首次发现并证明它具有钙-磷代谢调节功能[34]。现在临床使用的CT主要是合成的人降I丐素(human calcitonin, hCT)和鲑鱼降I丐素(salmon calcitonin, sCT)。鲑鱼降钙素对它的受体结合部位具有很高的亲和力(它的受体结合部位在中枢神经系统的某些区域也已经被证明)，具有十分良好的临床效果并且比合成的哺乳类(包括人)的降钙素，作用持续的时间更长。降钙素的临床应用如下1、禁用或不能使用常规雌激素与钙制剂联合治疗的早期和晚期绝经后骨质疏松症以及老年性骨质疏松症。2、继发于乳腺癌、肺癌或肾癌、骨髓瘤和其他恶性肿瘤骨转移所致的高血钙症。3、变形性骨炎。4、甲状旁腺机能亢进症、缺乏活动或维生素D中毒(包括急性或慢性中毒)。5、痛性神经营养不良症或Sudeck 氏病。目前上市的降钙素剂型有注射剂和鼻喷剂，进口品种有诺华公司的sCT(商品名 密钙息，有注射剂和鼻喷剂)，旭化成公司的鳗鱼降钙素(商品名益盖宁注射剂)。国内的生产厂家有上海丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司、山东绿叶制药有限公司的鳗鱼降钙素(依降钙素注射剂)，上海太平洋制药厂、上海第一生化药业公司、深圳市九明药业有限公司、河北联合制药有限公司、青岛国大药业有限公司的sCT(鲑鱼降钙素注射剂)等。但是对于大多数治疗药物来说，口服给药使患者最乐于接受和方便的给药途径，因此，设计一种能克服多肽药物在胃肠道中的各种屏障，口服生物利用度高的制剂有着重要的现实意义和填补市场空白
发明内容
本发明提供了一种口服降钙素脂质体，通过对脂质体表面进行修饰，提高了了降钙素在胃肠道的稳定性，增加了肠道滞留时间并且增加了药物在肠道的吸收。本发明的降钙素脂质体以大豆卵磷脂为膜材，胆固醇为膜流动性调节剂，DSPG为负电荷调节物质制备了脂质体，并被动载入降钙素形成降钙素脂质体，并用穿膜肽ArgS修饰脂质体表面，再用TMC包覆，形成了 ArgS修饰的TMC包覆的降钙素脂质体，并以蔗糖等作为冻干保护剂制成冻干制剂。本发明研制的新型降钙素口服脂质体制剂一方面具有粘膜粘附作用，可以提高制剂在肠道的滞留时间；另一方面其修饰材料Arg8具有携带制剂被细胞快速摄取的作用，同时TMC具有打开细胞间紧密连接，使降钙素通过细胞旁路通道转运，因此可以增加降钙素的口服吸收。本发明的目的是通过如下方案实现本发明中的口服降钙素脂质体的组成成分如下述 本发明中的口服降钙素脂质体采用如下材料作为原料大豆卵磷脂，胆固醇，DSPG，降钙素，Arg8，TMC。本发明中口服降钙素脂质体的制备具体操作如下I.取处方量的大豆卵磷脂，胆固醇和DSPG溶于有机溶剂中，水浴旋转蒸发，真空除去有机溶剂，形成脂质干膜。2.将降钙素溶液加入脂质干膜中，水浴旋转洗脱后探头超声，降低粒径，随后过微孔滤膜，得未修饰的降钙素脂质体。3.将所得的降钙素脂质体滴加到ArgS溶液中，磁力搅拌，得ArgS修饰的降钙素脂质体。4.将所得的ArgS修饰的降钙素脂质体滴加到TMC溶液中，磁力搅拌，即得ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体。5.将处方量的冻干保护剂加入到该脂质体中，冷冻干燥制得Arg8修饰TMC包覆的降钙素脂质体的冻干制剂。所述有机溶剂为氯仿，甲醇及其混合物。所述恒温除去有机溶剂的水浴温度优选为20_70°C。所述恒温水合温度优选为20_70°C。所述探头超声功率优选为100-400W，次数优选为50-400次。 所述Arg8浓度优选为5-80 U g/ml0所述TMC浓度优选为0. 2 % -I. 2 %。所述冻干保护剂优选葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖或其中任意组合形式。冻干保护剂与制剂质量百分比优选为3% -15%。取实验前禁食24h的雄性Wistar大鼠30只，随机分成5组，每组6只，禁食期大鼠可自由饮水。分别灌胃给予降钙素溶液(calcitonin solution)，未包覆的降钙素脂质体(Non-Lip)以及CS包覆的降钙素脂质体(CS-Lip)和TMC包覆的降钙素脂质体(TMC-Lip)剂量为500IU/Kg。分别于给药后0，0. 5，1，2，4，6，8，12，2处眼底静脉丛取血0. 5mL，置离心管中，分离血清IOOii L，置-20°C冰箱保存，供测定血钙水平变化。结果见图2和图3。本发明制备的ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体及其冻干制剂，平均粒径< 180nm,所有例子粒径< 500nm,zeta电位> 20mV。降I丐素被载入脂质体的内水相或紧密吸附在脂质体表面并用ArgS修饰，TMC包覆后增加了其在胃肠道的稳定性，延长了其体内滞留时间，提高了口服生物利用度，实现了更好的药效作用；本发明制备的冻干制剂，可重新水化形成脂质体，粒径，包封率没有明显的变化，增加了制剂的稳定性和保存运输的便利性；本发明制备ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体采用了薄膜水化法，工艺简单，重现性强，可用于工业生产。
图I是Arg8修饰TMC包覆的降钙素脂质体的原子力显微镜照片图2是ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体灌胃给药后大鼠血清钙离子水平变化曲线图3是Arg8修饰TMC包覆的降钙素脂质体灌胃给药后大鼠体内血清钙离子水平变化曲线上面积
具体实施例方式实施例I将大豆卵磷脂I. 6g，DSPG 0. 4g，胆固醇0. 3g，溶于氯仿甲醇混合溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥器中过夜，加入降钙素溶液，水化30min，探头超声400W，200次，过450nm微孔滤膜后待用，将所得的降钙素脂质体滴加到ArgS溶液中，磁力搅拌，得ArgS修饰的降钙素脂质体。将所得的ArgS修饰的降钙素脂质体滴加到TMC溶液中，磁力搅拌，即得ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体。实施例2将大豆卵磷脂2. 0g, DSPG 0. 4g，胆固醇0. 4g，溶于氯仿甲醇混合溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥器中过夜，加入降钙素溶液，水化30min，探头超声400W，400次，过450nm微孔滤膜后待用，将所得的降钙素脂质体滴加到ArgS溶液中，磁力搅拌，得ArgS修饰的降钙素脂质体。将所得的ArgS修饰的降钙素脂质体滴加到TMC溶液中，磁力搅拌，即得ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体。实施例3将大豆卵磷脂2. 0g, DSPG 0. 5g，胆固醇0. 3g，溶于氯仿甲醇混合溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥器中过夜，加入降钙素溶液，水化30min，探头超声200W，400次，过450nm微孔滤膜后待用，将所得的降钙素脂质体滴加到ArgS溶液中，磁力搅拌，得ArgS修饰的降钙素脂质体。将所得的ArgS修饰的降钙素脂质体滴加到TMC溶液中，磁力搅拌，即得Arg8修饰TMC包覆的降钙素脂质体。将冻干保护剂加入制剂中，_70°C预冻4h，冷冻干燥48h，即得ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体。实施例4将大豆卵磷脂4. 0g，DSPG 1.2g，胆固醇I. 0g，溶于氯仿甲醇混合溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥器中过夜，加入降钙素溶液，水化30min，探头超声200W，400次，过450nm微孔滤膜后待用，将所得的降钙素脂质体滴加到ArgS溶液中，磁力搅拌，得ArgS修饰的降钙素脂质体。将所得的ArgS修饰的降钙素脂质体滴加到TMC溶液中，磁力搅拌，即得Arg8修饰TMC包覆的降钙素脂质体。将冻干保护剂加入制剂中，_70°C预冻4h，冷冻干燥48h，即得ArgS修饰TMC包覆的降钙素脂质体，用纯水重新水合分散后，取适量稀释后 制备样品，用原子力显微镜观察粒子表面形态，结果见图I。
权利要求
1 一种含降钙素的口服脂质体，其特征是由大豆卵磷脂，DSPG和胆固醇组成膜材，用Arg8和TMC修饰脂质体表面。
1.权利要求I的脂质体，其中大豆卵磷脂，DSPG和胆固醇的质量比为 大豆卵磷脂 4-8份 DSPG1-4 份 胆固醇I份
2.权利要求I的脂质体，其中TMC是用低分子量的壳聚糖合成制得，季铵化度特征为20% -80%。
3.权利要求3中的壳聚糖分子量范围在50kDa-100kDa。·
4.权利要求I的脂质体，其中Arg8特征为右手螺旋构象。
5.权利要求I的脂质体的制备方法包括以下步骤采用薄膜水化法，先制得脂质干膜，用含药水溶液水合后，超声制得粒径较小且均匀的载药脂质体，将载药脂质体先滴加到ArgS溶液中搅拌，再将制剂滴加到TMC溶液中搅拌，将制得的脂质体加入冻干保护剂溶解后分装进容器，冻干即得。
6.权利要求5的方法中，探头超声的功率选择在100-400W，次数在50-400次。
7.权利要求5的方法中水合时间为10-60min，水合温度为30_60°C。
8.权利要求5的方法中Arg8修饰温度为4-25°C，时间为0.5_2h。
9.权利要求5的方法中TMC包覆的温度为4-25°C，时间为0.5_2h。
10.权利要求I的脂质体还含有冻干保护剂。
11.权利要求7中的冻干保护剂选自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘露醇中的一种或几种组合。
12.权利要求7中的冻干保护剂与制剂的质量百分比为3%-15%。
全文摘要
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种口服降钙素脂质体及其冻干制剂，其特征是将水溶性多肽类药物降钙素包载入脂质体的内水相或紧密吸附在脂质体膜表面，依次用穿膜肽Arg8和高分子聚合物TMC修饰脂质体表面，制备成具有粘膜粘附性质的口服降钙素脂质体，再冷冻干燥制成冻干制剂，该制剂平均粒径＜180nm，大鼠体内药效结果较降钙素口服溶液增加了103倍。
文档编号A61K47/42GK102784106SQ201110126049
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者孙敏捷, 平其能, 李赛, 肖衍宇, 黄爱文 申请人:中国药科大学