免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用的制作方法

专利名称：免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物，具体涉及免疫调节剂组合物及其药物组合物。该免疫调节剂组合物是由多种细菌多糖提取物组成，其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
背景技术：
人体免疫机能的下降是导致细菌、病毒等病原生物感染的重要原因之一。非特异性免疫反应(也称固有免疫应答)是人和脊椎动物对抗病原生物的第一道防线，机体通过固有的非特异免疫系统的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)对病原生物的模式识别分子(pathogen associated molecule patterns,PAMPs)进行识别而启动非特异性免疫反应，继而引发特异性免疫反应(也称获得性免疫反应)从而达到清除病原生物，保护机体的作用。
非特异性免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，即出生后就已具备的非特异性防御功能。非特异性免疫反应在机体的整个免疫反应中占据关键地位:它是机体对抗外来病原微生物入侵的第一道防线和监视哨，在机体早期发现和杀死入侵病原微生物过程中发挥着关键作用；它是机体一切免疫应答的基础，是特异性免疫反应的前提和基础；因此，调节非特异性免疫反应是机体增强防病和抗病能力的一个最重要方面(Kawai,T.et al.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors.Nature Immunol.11,373-384(2010)8212)。
当病 原细菌入侵宿主体内时，宿主通过表达于中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)上的PRRs特异性识别来源于病原细菌的多糖类PAMPs，启动宿主的非特异免疫和炎症反应，继而引发宿主的特异性免疫反应。研究表明:哺乳动物具有复杂的模式识别受体系统，它们主要包括 Toll 样受体(Toll-like receptor, TLR)、NLRs (N0D-1 ike receptors) >RLR(RIG-1 ike receptor)和 MDA5(Melanoma differentiation associated gene5)及C型凝集素家族(C-type lectin family),这些模式识别受体系统相互协调,启动宿主的天然免疫反应，进而激发获得性免疫反应，完成对入侵病原生物的控制和消灭(HajishengallisG,et al.Microbial manipulation of receptor crosstalk in innate immunity.NatureReviews Immunology.2011(11) 187-200)。
细菌多糖是一类非常重要的病原体模式识别分子(PAMPs)，它可引起机体产生非特异免疫反应。在大多数细菌，尤其是致病菌，在其生长过程中表达大量的多糖，这些多糖以荚膜、糖蛋白或糖脂的形式存在于微生物细胞的表面。在细菌细胞中，几乎所有的多糖都是由甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺等十几种单糖组成的，但是单糖之间有多种不同的连接方式，可形成不同构型的直链和支链结构，通过单糖分子间氢键及基团的相互作用进一步又形成不同形状的高级结构。在病原细菌与宿主(人或动物)共生的进化过程中，很多多糖结构高度特异的表达分布于病原菌中，它们成为病原细菌被宿主天然免疫识别系统识别的主要分子标志，既病原体模式识别分子(PAMPs)，包括革兰阴性菌的LPS、革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)、细菌和真菌的胞壁的肽聚糖以及细菌胞壁的糖蛋白和糖脂中的末端甘露糖、岩藻糖、葡聚糖等多糖、核酸和脂类。细菌多糖类PAMP高度保守，为病原微生物所特有，在病原微生物激发非特异性免疫应答过程中起着关键作用。同时，细菌多糖能够被MHC II分子呈递并被α β-TCR直接或者间接识别，从而激活获得性细胞免疫应答；多糖类物质亦能够有效地激活B淋巴细胞，诱导特异性抗体的产生。
当机体(人或动物)的非特异性免疫反应被细菌多糖激活，机体一方面启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路，刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF- a、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进ThO细胞向Thl细胞亚群转化和IFN-Y分泌，从而产生Thl占优势的非特异性免疫反应，增强机体抗感染、过敏能力 ’另一方面参与非特异性和特异性免疫的NK细胞、效应T细胞等免疫细胞被活化，增强了机体免疫系统抗抗感染和抗肿瘤的能力(Simpson J L, et al.1nnatey immunity in asthma.Paediatr Respir Rev.2008(9)263-270 ；E.Vivier,et al.“Functions of natural killercells, ”Nature Immunology.2008(9)503-510 ;)。
综上所述，非特异性免疫应答是一切免疫反应的基础，是人和动物抵抗外来病原生物入侵的第一道防线，是机体增强抗微生物感染、抗肿瘤、抗过敏能力的最重要方面，因此，研制可用于调节人或哺乳动物免疫反应，特别是非特异性免疫应答能力的细菌多糖免疫调节剂将具有重要的社会意义和经济价值。
早在19世纪，人们已认识到引起人和动物结核病的是各型结核杆菌。后来又发现。另有一些非结核杆菌，也能引起人类结核病，但毒性较结核菌为弱，后来将这类菌称为非典型菌，并与腐物寄生杆菌和麻疯杆菌共为分枝杆菌属。卡介菌为牛型减毒结核菌，无致病性，有免疫原性，用卡介菌接种代替结核菌初次感染而获得对结核病的免疫力，是目前世界上应用最广泛的菌苗之一。1908年,法国巴斯德研究所的Calnette和Guerin成功培育出一株弱毒牛型结核杆菌，并命名为卡介菌(BCG)。1921年，Weill-Halle成功地将该菌应用于人体，防治结核病。另一方面，当时，人们还认识到，自身免疫力的提高，可抵抗其它疾病，20世纪20 40年代，曾有人用草分枝杆菌液治疗结核病以外的其他一些病原性疾病，如呼吸系统疾病，甚至性病。现在才认识到，这是非特异性免疫调节作用。
在中国，上世纪60年代，湖南医学院谭礼智和王慧人，首先用灭活卡介苗于上臂划痕，对结核病有一定疗效。但意外见到，这些划痕的肺结核患者，原有的慢性气管炎，感冒、哮喘、风湿性疾病或 神经性慢性皮炎也有疗效。从而，使国内外很多研究者注意到，人体接种分枝杆菌属细菌，可产生良好的非特异性免疫，并可提高机体抗病能力，表现出对某些慢性常见病具有一定的治疗效果(死卡介苗防治慢性气管炎、感冒和流感的临床研究。中华内科杂志1976，I =286-290)。现代免疫学研究表明:在分支杆菌中，多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂类常结合在一起，构成细胞壁的主要成分。分支杆菌细胞壁和其他细胞器上存在多糖或糖结构的PAMPs可结合人和动物的免疫识别系统PRRs上，其中至少包括4种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)、NLRs和C型凝集素等。当它们相互特异识别并结合后，启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路，刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF- a、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进ThO细胞向Thl细胞亚群转化和IFN- Y分泌，从而产生Thl占优势的非特异性免疫反应并增强NK等免疫活性细胞的功能，从而提高宿主的免疫机能(J Exp Med2003 ；197:403-411)。
近十几年来，国内外陆续批准多个分枝杆菌制剂上市，如治疗用卡介苗、卡介苗多糖核酸注射液、冻干卡介苗细胞壁，草分支杆菌注射液及母牛分枝杆菌冻干制剂，这些制剂均有免疫调节功能。治疗用卡介苗及卡介菌细胞壁主要用于治疗浅表性膀胱癌；卡介苗多糖核酸注射剂主要用于预防和治疗慢性气管炎、感冒和哮喘；草分枝杆菌及母牛分枝杆菌制剂以及卡介苗多糖核酸液主要用作结核病的辅助治疗。上世纪80年代批准已上市的卡介菌多糖核酸注射剂(BCG-PSN)是经热酚法提取卡介菌多糖核酸，配以灭菌生理盐水制成的免疫调节剂，在该制剂中为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为70 % 80 %左右，核酸为10% 20%。BCG-PSN具有免疫调节及抗炎作用，在提高机体的免疫功能、抗过敏、抗感染方面具有一定的疗效和较高的安全性，临床上已用于抗感染、抗病毒、抗肿瘤和抗过敏性疾病的治疗上。但也发现其免疫调节的作用不持久，治疗作用不显著。(黄建等，中国分支杆菌类免疫调节剂的评述与展望，微生物免疫学进展，2002 ；30:56-60 ;宁云山等，中国生物制品学杂志，2008 ；1:74-80,)。
肺炎球菌(也称肺炎链球菌)可引发多种侵袭性疾病(如菌血症、脑膜炎等)与非侵袭性疾病(如细菌性鼻窦炎、中耳炎、社区肺炎等)的致病病因。全球各年龄段人群的感染及相关性疾病中，肺炎球菌性疾病位居首位，尤其是幼儿、年迈者、免疫障碍患者以及患有各种慢性基 础疾病患者中的发生率更高。WHO估计每年约有160万人死于肺炎球菌感染性疾病，其中包括70万 100万5岁以下儿童；此外，人类免疫缺陷病毒感染以及与免疫缺陷相关的其他疾病大大增加了感染肺炎球菌疾病的可能性(Pneumococcalconjugate vaccine for childhood immunization-WHO position paper.Wkly EpidemiolRec.2007 (82):93-104)，且随着日益广泛地使用抗生素，致使肺炎球菌耐药菌株达96 %以上，且呈多重耐药性状况。
在肺炎球菌中，多糖是主要病原体相关模式分子和主要保护性抗原，通过识别TLR等表达人类或哺乳动物免疫细胞上的病原体模式分子识别受体系统，启动非特异性免疫系统，继而进一步激活特异性免疫系统。目前，全球已有多种肺炎细菌多糖疫苗被批注用于人体，包括14价、23价多糖疫苗和PCV-7多糖蛋白结合疫苗，在预防肺炎球菌感染中取得较好的保护性效果(唐静等，肺炎球菌疫苗的研究进展，国际呼吸杂志，2010 (30) =1392-1395)。
金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性致病菌，不但寄居于皮肤和粘膜表而，也能在多种组织及血液中生长繁殖，引起多种疾病，如人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等，同时金葡菌也是医院感染和社区感染的主要病原菌。随着广谱抗菌药物的广泛应用，医院内耐药性细菌已严重威胁人类的健康，特别是耐甲氧西林和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌往往导致现有抗生素治疗的失败；社区获得性金葡菌感染率和耐药率逐年增加，引起各国政府和感染控制学家的高度重视。发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫调节剂组合物，该免疫调节剂组合物是由多种细菌多糖提取物组成，其至少包含分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
所述的免疫调节剂组合物，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比不低于20 %，肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于10 %。
优选地，所述分支杆菌属细菌多糖提取物为卡介菌多糖提取物、草分枝杆菌多糖提取物或耻垢分枝杆菌多糖提取物。
所述的免疫调节剂组合物，还可以包可引发人或动物产生免疫反应，更优选包含可引起人或动物呼吸道、消化道或皮肤感染的细菌，更优选包含葡萄球菌属、链球菌属、埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属，特别优选包含金黄色葡萄球菌、卡他布兰汉氏菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、草绿色链球菌、化脓性链球菌的多糖提取物。具体可以为含金黄色葡萄球菌多糖提取物、卡他布兰汉氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯杆菌多糖提取物、流感嗜血杆菌多糖提取物、草绿色链球菌多糖提取物或化脓性链球菌多糖提取物。
优选地，根据本发明所述的组合物包含所有血清型肺炎球菌，更优选包含1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F 血清型，更优选包含 1、5、6B、14、18C、19F、23F 血清型。
优选地，所述的免疫调节剂组合物中，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为20 80%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10 70%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为O 20%。
一优选实施例中，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为50%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为35%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为15%。
另一优选实施例中，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为70%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为20%。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述的免疫调节剂组合物及药学上可接受的辅料。例如为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所用的药物组合物调节免疫反应，特别是非特异性免疫应答能力。
根据上述的免疫调节剂组合物或药物组合物，其还可以包含抗原或抗原决定簇。所述抗原或抗原决定簇选自以下一种或多种疫苗的抗原或抗原决定簇:细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、肿瘤疫苗。所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与抗原或抗原决定簇联合给药。
优选地，所述抗原或抗原决定簇为具体可以为:流感病毒A全病毒灭活疫苗，或A群脑膜炎球菌多糖疫苗，BCG (卡介苗)疫苗，白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类 毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗和疟原虫抗原。
相适应地，本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包括两种或多种所述抗原或抗原决定簇。
本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以通过许多不同途径进行给药，如注射(其包括非肠道，皮下，皮内和肌肉注射)鼻内，粘膜，口腔，阴道内，尿道或眼部给药。
优选地，在本发明中通过注射给药。更优选地，注射为皮内注射。
优选地，本发明中通过口服可接受的组合物来进行给药。
本发明还涉及上述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备预防或治疗感染、过敏、肿瘤、免疫系统失衡、肺部相关慢性疾病的药物中的应用。这些细菌多糖可被表达于人或动物免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和DC细胞上的模式识别受体(PRR)特异性识别，启动宿主的非特异免疫和炎症反应，继而引发宿主的特异性免疫反应。由于非特异性免疫反应系统被激活，一方面启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路，刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF-a、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进ThO细胞向Thl细胞亚群转化和IFN-Y分泌，产生Thl占优势的免疫反应，调节Thl/Th2平衡，从而增强机体抗感染、过敏能力；同时部分多糖抗原在非特异性免疫反应的基础上，激活特异性免疫反应，产生特异性抗体从而杀灭入侵的微生物，消除感染；另一方面参与非特异性和特异性免疫的NK细胞、效应T细胞等免疫细胞被活化，增强了机体免疫系统抗肿瘤的活性，从而在整体上增强人或动物抗感染、抗过敏、抗肿瘤的能力。因此，可用于预防和治疗如下病症中的一种或多种:感染(如细菌感染、病毒感染，例如乳头瘤病毒造成的感染，或寄生虫感染例如弓形虫感染)、过敏(如包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等)、肿瘤(如膀胱癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等)、免疫系统失衡(例如儿童和老人的免疫系统失衡)、肺部相关慢性疾病(COPD，即慢性阻塞性肺病等)。
具体地，所述感染为单纯疱疹病毒感染，所述过敏为被动皮肤过敏和哮喘，所述肿瘤为肺癌，所述免疫系统失衡为环磷酰胺所致白细胞减少症，所述肺部相关慢性疾病为呼慢性阻塞性肺病。
优选地，所述药物为疫苗。对于疫苗接种来说组合物能以0.1至0.2ml水溶液的形式来提供，优选生理盐水缓冲液，并进行非肠道注射给药，例如通过皮内接种。本发明所述的疫苗优选进行皮内注射。在注射部位可能会发现轻微的肿胀和发红，有时也会有搔痒。给药的模式、给药的剂量和次数可通过本领域普通技术人员已知的方式进行优化。
本发明的上述免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以以多种剂型通过多种途径进行给药，如注射(其包括非肠道、皮下、皮内和肌肉注射)鼻腔、粘膜、口腔、阴道内、尿道或眼部给药。
优选地，根据本发明所述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备药物上的应用，其剂型可为经肠胃道给药剂型和非经肠胃道给药剂型，优选为注射剂、口服制剂、灌注剂以及滴剂，更优选为舌下片剂、舌下滴剂、滴鼻剂、喷雾剂。
本发明提供了的免疫调节剂组合物由多种细菌多糖提取物组成，其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。该免疫调节剂组合物可刺激机体产生持续和作用显著的免疫免疫调节功能，特别是非特异性免疫应答能力以及在此基础上继发产生的特异性免疫反应，同已上市的免疫调节剂相比，可在整体上提高人或动物抗感染、抗肿瘤和抗过敏能力。
另一个方面，本发明提供了的免疫调节剂组合物。其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物，它们单独或同其他细菌多糖提取物按一定比例组成本发明所涉及的免疫调节剂，之所以选用分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物作为本发明所提供的免疫调节剂的最核心组成物，这是因为:①分支杆菌属的多种免疫制剂已批准上市。卡介菌是目前全球应用最广泛的菌苗之一，其安全性和有效性已获得广泛肯定，同时，由我国自行研制 的卡介菌多糖核酸注射液(该制剂中多糖占70 80% )已批准上市近三十年，其在调节人体的非特异性免疫能力，提高人体抗感染、抗过敏、抗病毒方面显示了一定的疗效和较高的安全性肺炎球菌是目前呼吸道最常见的致病菌之一，也是最常感染儿童、老人、免疫障碍患者以及患有各种慢性基础疾病患者。肺炎球菌多糖疫苗已在预防肺炎球菌感染中取得较好的保护性效果，具有一定的非特异性免疫调节能力和较强的特异性免疫反应应答能力将分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物组合，并做为本发明所述免疫调节剂的核心成分，它们单独或同其他细菌多糖提取物按一定比例组成本发明所涉及的免疫调节剂不仅能刺激人或动物产生较强而持续的非特异性反应能力，而且也可产生较强而持续的特异性免疫反应，从而在整体提升人或动物抗感染、抗肿瘤、抗过敏能力；④相对于一种细菌多糖引发的免疫应答，通过多种细菌多糖引发的免疫调节作用(非特异性和特异性免疫)具有长期持续的特点；⑤相对于一种细菌多糖引发的免疫应答，通过多种细菌多糖引发的免疫调节，具有可同时对抗多种细菌感染的能力，具有广谱性。
本 发明提供的免疫调节剂或药物组合物同目前已上市的干扰素、胸腺肽、灵芝多糖等免疫调节剂产品相比，它具有独特而不可替代的优势:①它是一类非常独特的免疫调节剂，它可主动持久刺激机体产生免疫调节作用，特别是提高了人和动物的非特异免疫反应能力，因此加强了机体抵抗外来病原入侵和监视肿瘤细胞免疫逃逸的第一道防线的能力，从而达到机体通过自身免疫调节作用来预防和治疗疾病的目的；②它在疾病的预防作用在阻止一些传染病疾病的发生和发展上更具有价值，特别是在类似SARS、HlNl等严重突发传染病的预防上将发挥独特而重要的作用。一种新发传染病从病原确认到疫苗批准上市，一般需要5年的时间，最短也需要I 2年。在疫苗未上市之前，特别是在病原体未确定之前，使用该制剂将可降低该传染病爆发和大流行的风险，降低该传染病对人民健康和社会经济的影响；③它在一些特殊人群的疾病预防作用上也同样更具有价值。儿童、老人、免疫障碍患者以及患有各种慢性基础疾病患者是一类特别容易罹患各类感染性疾病和肿瘤的人群，使用本制剂将提高这类人群的免疫功能，可以减少疾病的发生，改善患者的生活质量，减轻患者和社会的经济负担；④它是一种广谱的免疫调节剂和协同剂，它不仅对细菌、病毒等微生物引起的感染发挥作用，还可增强抗病毒制剂、抗生素、疫苗的治疗和预防作用，同时对机体自身免疫失衡所引发的疾病如过敏性疾病等发挥治疗和预防作用。
为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1:卡介菌的培养和多糖提取物的制备
1、菌体培养:将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所菌苗室提供)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37°C连续培养14 20天；或在37°C连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37°C连续培养14 20天。
其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是:
取洗净新鲜土豆(I个)用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面，用流动饮用水冲洗土豆斜面I小时后用纯化水冲洗土豆斜面块；然后用苏通培养基冲洗斜面块。取苏通培养基20ml,加入IOOml灭菌大管中；将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭茵大管中，0.1lMPa的大气压121°C，灭菌20分钟。放冷至室温待接种。
苏通培养基配制比例:
每IOOOml:
硫酸镁0.5g 磷酸氢二钾1.04g
味精8.0g枸橼酸2.0g
甘油60ml10%柠檬酸铁铵0.5ml
加纯化水至IOOOml氨水调至ρΗ8.0左右
改良的液体苏通培养基配方配制比例:
每IOOOml:
天冬素:4g柠蒙酸:2g K2HP04.3H20(AR):
0.5g MgS04.7H20 (AR):0.5g 柠檬酸铁铵:0.05g
甘油(药用):60ml
然后加I % (ff/V)硫酸锌1ml，10磅20分钟灭菌。
2、菌体收集:待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗 涤，压干后称重；
3、多糖提取物的制备:
(I)菌体破碎和热酚处理:
将收集的菌体按10: I的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3minX 3次，将菌体捣碎，然后再加入与破碎菌悬液等量的热苯酚(60 65°C )，在低速搅拌中保温30分钟 I小时。
(2)卡介菌多糖提取物的制备:
可通过透析或凝胶过滤的方法除去苯酚。将热酚好的混合液自然沉淀I 10天，吸取上清液，管式离心机离心后，上清液装入透析袋(截流分子量> 5000道尔顿)中在100倍体积的注射用水中透析I 10天，除去苯酚。或是上清液通过纯化系统按30%的体积上样于预先平衡的凝胶层析柱(层析用填料为GH-25或G-25，平衡液为0.9%生理盐水)，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集多糖目标峰，除去苯酚。
将透析好的上清液或通过凝胶层析收集的多糖峰中加入适量乙醇使含醇量60 85%,自然沉淀I 10天后，沉淀物用无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次。然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，自然干燥后即为卡介菌多糖提取物。
(3)卡介菌多糖提取物的鉴定:
采用《中国生物制品规程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定，结果表明，在制备的多糖提取物中，多糖含量大于70% (W/W)，核酸含量为10 20% (W/W)，蛋白含量小于0.5% (W/W)。
其中多糖含量的测定参考《中国生物制品规程》(2000)版的恩酮法，核酸含量的测定参考《分子克隆第三版》，蛋白含量的测定参考《中国生物制品规程》(2000)版的1wry法。
实施例2:肺炎球菌的培养和多糖的提取
1、肺炎球菌的培养:可采用培养瓶和发酵罐进行培养，培养条件为本领域公知的肺炎球菌培养条件。
将1、5、6B、14、18C、19F及23F血清型肺炎球菌冻干菌种接种于10%脱纤维羊血普通琼脂培养基，在36°C，5%的CO2环境中，静止培养后传种2代液体培养基，按接种量约108CFU/mL接种于一定体积得发酵罐中内，于36°C进行搅拌培养，自培养2h后起每隔Ih取样一次，在600nm波长下测OD值，用50%葡萄糖溶液调节糖浓度，以7.5mol/L NaOH调节pH至7.5，间歇通入压缩空气，，待OD值到达1.5 1.7时(约7 9小时)终止培养。采用(V/V)重量体积比为I %的脱氧胆酸钠或0.5%苯酚灭活细菌，离心(9000g，30分钟)，收集上清。
2、肺炎球菌多糖提取物的制备:上清液超滤浓缩到原体积的1/5 1/2时，加入乙醇使其终浓度走到40%，离心去除核酸；上清中继续加入乙醇使其终浓度达到70%，离心收集沉淀。重新溶解沉淀，加入2倍体积的冷酚抽提数次，去除蛋白；沉淀物用0.3mol/L乙酸钠溶解，以等体积苯酚一乙酸钠饱和液离心抽提，充分去除蛋白。吸取上清水相，用蒸馏水透析，透析后加入乙醇浓度使其终浓度达到80%以沉淀多糖，用无水乙醇洗2次，自然干燥后进行多糖测定。
3、肺炎球菌多糖提取物的鉴定
多糖按照(《欧洲药典》1997年版)相应要求进行测定。蛋白含量用Lowry氏法；核酸含量以分光光度法；甲基戊糖、氨基己糖及糖醛酸含量测定按照(《欧洲药典》1997年版)所述方法进行。
采用上述标准标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定，结果表明，在制备的多糖提取物中，多糖含量大于60% (W/W)，核酸含量小于20% (W/W)，蛋白含量小于20% (W/W) ο
实施例3:金黄色葡萄球菌的培养和多糖的提取
1、金黄色葡萄球菌的培养:可采用培养瓶和发酵罐进行培养，培养条件为本领域公知的肺炎球菌培养条件。
将C5、CS血清型金黄色葡萄球菌冻干菌种接种于固体培养基上进行活化，37°C培养18小时，将该培养物再次在新琼脂培养上37°C培养4小时，以便获得指数生长期的微生物。然后在基本液体培养基(lg/L 葡萄糖、120mg/L Fecl3 *6H20>400mg/LMgcl2 *6H20>10mg/L CaCl2.2H20、5mg/LZnCl2、58.5g/L NaCl、6g NH4Cl,6.8g NH4Cl' PH6.2 7.5，最适 6.5)进行培养。自培养 2h后起每隔Ih取样一次，在600nm波长下测OD值，待OD值0D_彡1.5时，终止培养。
培养物通过苯酚-乙醇(终浓度2% V/V)处理来灭活，然后在25000g下离心30分钟，收集沉淀物。
2、金黄色葡萄球茵多糖的提取:文献中描述了各种细菌多糖的提取技术，并且可以在本发明中使用。例如可参考 Lee.J.C.1nfect Immunu 1993 ；67:1853 1858 ；DassyB等 J.Gen Microbiol.1991 ;137:1155 1162 ;Fattom A 等人，Infect Tmmun 1990 ；58:2367 2374。下面方法主要采用苯酚-乙醇法提取金黄色葡萄球菌多糖:离心获得的细菌沉淀按10mg/ml溶度溶于生理盐水后，加入等体积苯酚一乙酸钠饱和液离心抽提，充分去除蛋白。吸取上清水相，用蒸馏水透析，透析后加入乙醇浓度使其终浓度达到40%，离心去除核酸，上清继续加入乙醇至终浓度为80%以沉淀多糖，用无水乙醇洗2次，自然干燥后进行多糖测定。
3、金黄色葡萄球菌多糖的鉴定
采用《中国生物制品规程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定，结果表明，在制备的多糖提取物中，多糖含量为大于60% (W/W)，核酸含量小于20% (W/W)，蛋白含量小于为20% (W/W)。
除上述卡介菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌，相关文献中描述了其它细菌多糖的提取技术，并且可以在本发明中使用。
实施例4:免疫组合物的制备
从上述实施例中获得的三种细菌多糖提取物，按表I配比成A、B、C、D、E五种免疫组合物(见表I)，然后将配比后的组合物溶解在生理盐水中，其浓度为lmg/ml，除菌分装后置于室温备用。
表1:不同细菌多糖组合的免疫调节剂组合物
权利要求
1.一种免疫调节剂组合物，其特征在于，至少包含分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比不低于20%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于 10%。
3.根据权利要求1或2所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，所述分支杆菌属细菌多糖提取物为卡介菌多糖提取物、草分枝杆菌多糖提取物或耻垢分枝杆菌多糖提取物。
4.根据权利要求3所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，还包含葡萄球菌属、链球菌属、埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属的多糖提取物。
5.根据权利要求4所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，包含金黄色葡萄球菌多糖提取物、卡他布兰汉氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯杆菌多糖提取物、流感嗜血杆菌多糖提取物、草绿色链球菌多糖提取物、化脓性链球菌多糖提取物。
6.根据权利要求5所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为20 80%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10 70%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为O 20%。
7.根据权利要求6所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为50%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为35%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为15%。
8.根据权利要求6所述的免疫调节剂组合物，其特征在于，所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为70%，肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10%，金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为20%。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的免疫调节剂组合物及药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求1所述的免疫调节剂组合物或权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，还包含抗原或抗原决定簇。
11.根据权利要求10所述的免疫调节剂组合物或药物组合物，其特征在于，所述抗原或抗原决定簇选自以下一种或多种疫苗的抗原或抗原决定簇:细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、肿瘤疫苗。
12.根据权利要求1 1所述的免疫调节剂组合物或药物组合物，其特征在于，所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与抗原或抗原决定簇联合给药。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述抗原或抗原决定簇为卡介苗疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗、疟原虫抗原、流感病毒A全病毒灭活疫苗或A群脑膜炎球菌多糖疫苗。
14.权利要求1所述的免疫调节剂组合物或权利要求9所述的药物组合物在制备预防或治疗感染、过敏、肿瘤、免疫系统失衡、肺部相关慢性疾病的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述感染为单纯疱疹病毒感染，所述过敏为被动皮肤过敏和哮喘，所述肿瘤为肺癌，所述免疫系统失衡为环磷酰胺所致白细胞减少症，所述肺部相关慢性疾病为慢性阻塞性肺病。
16.根据权利要求15 所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
全文摘要
本发明涉及免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用。所述免疫调节剂组合物由多种细菌多糖提取物组成，其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。该免疫调节剂组合物可刺激机体产生持续和作用显著的免疫调节功能，特别是非特异性免疫应答能力以及在此基础上继发产生的特异性免疫反应，同已上市的免疫调节剂相比，可在整体上提高人或动物抗感染、抗肿瘤和抗过敏能力。
文档编号A61P11/00GK103157108SQ201110416789
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者宁云山 申请人:宁云山