嵌合抗原受体-修饰的t细胞治疗癌症的用途

嵌合抗原受体-修饰的t细胞治疗癌症的用途
【专利摘要】本发明提供了治疗人癌症的组合物和方法。本发明包括涉及施用基因修饰的T细胞，以表达CAR，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
【专利说明】嵌合抗原受体-修饰的T细胞治疗癌症的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2010年12月9日提交的美国临时申请号61/421，470和2011年6月29日提交的美国临时申请号61/502，649的优先权，其全部在此通过引用全文并入。
【背景技术】
[0003]大部分具有B-细胞恶性肿瘤一包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者，将死于他们的疾病。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(CAR)的表达，靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR为设计来以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰细胞治疗这些类型患者的尝试已经得到非常有限的成功。见例如，Brentjens 等，2010,Molecular Therapy, 18:4,666-668 ；Morgan等，2010,Molecular Therapy，2010 年 2 月 23 日在线公布，1-9 页；和 Till 等，2008，Blood，112:2261-2271。
[0004]在多数癌症中，肿瘤-特异性抗原还没有被很好地定义，但在B细胞恶性肿瘤中，⑶19是有吸引力的肿瘤标靶。⑶19的表达限于正常和恶性B细胞(Uckun等，Blood，1988，71:13-29)，所以⑶19是安全测试CAR的广泛接受的标靶(target)。尽管CAR可以以类似于内源T-细胞受体的方式引发T-细胞活化，但至今对该技术的临床应用的主要阻碍已经限于CAR+T细胞的体内扩展、注入后细胞的快速消失和令人失望的临床活性(Jena等，Blood，2010，116:1035-1044 ；Uckun 等，Blood,1988，71:13-29)。
[0005]因此，本领域迫切需要利用可体内扩展的CAR治疗癌症的组合物和方法。本发明解决了该需要。

【发明内容】

[0006]本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3(信号传导结构域，其中CD3(信号传导结构域包括SEQ ID N0:24的氨基酸序列。
[0007]在一个实施方式中，核酸序列编码包括SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的CAR。
[0008]在一个实施方式中，编码CAR的核酸序列包括SEQ ID NO:8的核酸序列。
[0009]在一个实施方式中，CAR中的抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。优选地，抗原-结合片段为Fab或scFv。
[0010]在一个实施方式中，CAR中的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在一个实施方式中，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。在另一个实施方式中，肿瘤抗原与实体瘤相关。还在另一个实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、RORl、间皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 和其任何组合。
[0011]在一个实施方式中，CAR中的共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-U IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。[0012]在一个实施方式中，CAR中的⑶3 ζ信号传导结构域由SEQ ID NO: 18的核酸序列编码。
[0013]本发明也提供了分离的CAR，其包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和⑶3 ζ信号传导结构域，其中⑶3 ζ信号传导结构域包括SEQ ID Ν0:24的氨基酸序列。
[0014]本发明也提供了包括编码CAR的核酸序列的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域。
[0015]在一个实施方式中，包括CAR的细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节T细胞。
[0016]在一个实施方式中，当CAR的抗原结合结构域结合它相应的抗原时，包括CAR的细胞显示了抗肿瘤免疫。
[0017]本发明也提供了包括编码CAR的核酸序列的载体，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3(信号传导结构域，其中CD3(信号传导结构域包括SEQ IDNO:24的氨基酸序列。
[0018]本发明也提供了刺激对哺乳动物中靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ IDNO: 24的氨基酸序列的CD3 ζ信号传导结构域，其中选择抗原结合结构域以特异性识别靶细胞群或组织。
[0019]本发明也提供了提供哺乳动物中抗肿瘤免疫的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，由此提供哺乳动物中的抗肿瘤免疫。
[0020]本发明也包括治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID Ν0:24的氨基酸序列的CD3 ζ信号传导结构域，由此治疗哺乳动物。
[0021]在一个实施方式中，细胞为自体T细胞。
[0022]在一个实施方式中，肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、间皮素、⑶33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR 和其任何组合。
[0023]本发明也提供了治疗具有慢性淋巴细胞白血病的人的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域。
[0024]在一个实施方式中，人对至少一种化疗剂具有抗性。
[0025]在一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病为难治疗的⑶19+白血病和淋巴瘤。
[0026]本发明也包括在诊断患有癌症的人中产生基因工程改造的T细胞的持续群的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造的以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，其中基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少一个月。[0027]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群包括至少一种选自以下的细胞:施用给人的T细胞、施用给人的T细胞的子代和其组合。
[0028]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群包括记忆T细胞。
[0029]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少三个月。在另一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
[0030]在一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病被治疗。
[0031]本发明也提供了在诊断患有癌症的人中扩展基因工程改造的T细胞群的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造的以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，其中施用的基因工程改造的T细胞在人中产生子代T细胞群。
[0032]在一个实施方式中，人中的子代T细胞包括记忆T细胞。
[0033]在一个实施方式中，T细胞为自体T细胞。
[0034]在另一个实施方式中，人对至少一种化疗剂具有抗性。
[0035]在一个实施方式中，癌症为慢性淋巴细胞白血病。在另一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病为难治疗的⑶19+白血病和淋巴瘤。
[0036]在一个实施方式中，子代T细胞群在施用后在人中持续至少三个月。在另一个实施方式中，子代T细胞的群在施用后，在人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一 个月、十二个月、两年或三年。
[0037]在一个实施方式中，癌症被治疗。
【专利附图】

【附图说明】
[0038]当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。
[0039]图1，包括图1A至1C，为基因转移载体和转基因、基因修饰的T细胞制造和临床方案设计的示意图的一系列图像。图1A描绘了显示主要功能元件的慢病毒载体和转基因。产生指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-⑶19scFv、人⑶8 α铰合和跨膜结构域、和人4-1ΒΒ和CD3 ζ信号传导结构域的表达的水泡性口炎病毒G蛋白假型临床等级慢病毒载体(命名为pELPsl9BBz)。通过包括EF-1 α (延伸因子-1a启动子)；LTR，长末端重复；RRE, rev应答元件(cPPT)和中央终止序列(CTS)，指导转基因的组成型表达。图不是按比例的。图1B描绘了 T细胞制造。自体细胞经单采血液成分术获得，和T细胞由单核细胞淘洗(elutriation)富集,冲洗,并且残余的白血病细胞通过添加抗-⑶3/⑶28包被的顺磁珠用于阳性选择和活化T细胞而被耗尽。慢病毒载体在细胞活化时被添加，并在培养开始3天后被冲洗。细胞在摇动平台装置(WAVEBioreactor System)上扩展8_12天。在培养的最后一天中，通过经过磁场移除珠，并且收获CART19T细胞并在可注入的(infusible)培养基中冷藏。图1C描绘了临床方案设计。给予患者如上所述的淋巴耗尽化疗，随后是在15-20分钟的时间期间内通过静脉内重力流滴注(gravity flow drip)的CART19注入#1。在完成化疗后I至5天开始，利用在3天期间的分次剂量方法(10%、30%、60%)提供注入。在研究第4周进行终点测定。在主动监测结束后，按照FDA指南，实验对象被转移至目的地协议，以长期跟踪。
[0040]图2，包括图2A至2F，是显示CART19细胞的持续体内扩展以及血液和骨髓中持久性的一系列图像。如图2A至2C所描绘的从全血或如图2D至2F所描绘的从骨髓中分离的DNA,如图2A和2D所描绘的从UPNOl、如图2B和2E所描绘的从UPN02和如图2C和2F所描绘的从UPN03获得的样本,利用合格测定(qualified assay)成批经历Q-PCR分析，以检测和量化CART19序列。每个数据点代表对100-200ng基因组DNA三次测量值的平均，最大％CV小于1.56%。对于测定的通过/失败参数包括扩增的斜率和效率的预定范围，和参考样本的扩增。由标准曲线范围建立的测定的定量下限为2个拷贝转基因/微克的基因组DNA ;在该数字以下的样本值被考虑为估计值并显示是否至少2/3复制产生了具有％CV为值15%的Ct值。对于UPNOl和UPN03，CART19细胞在第0、1和2天被注入，和对于UPN02，CART19细胞在第0、1、2和11天被注入。
[0041]图3，包括图3A至3D，是显示以下的一系列图像:在CAR T细胞注入前后血清和骨髓细胞因子；在CARTl细胞注入后的指定天，如图3A所描绘的UPN01、如图3B所描绘的UPN02和如图3C所描绘的UPN03中血清细胞因子、趋化因子和细胞因子受体的改变的纵向测量值，和来自如图3D所描绘的UPN03的骨髓中相同分析物的系列评估。利用Luminex珠阵列技术和预组装并验证的多重试剂盒，使样本经历多重分析。具有> 3倍变化的分析物被指示，并标绘为如图3A至3C所描绘的与基线的相对变化，或标绘为如图3D所描绘的绝对值。在每个时间点上每种分析物的绝对值源于在3-倍8-点稀释系列上的基于重组蛋白的标准曲线，通过标准曲线的80-120%实测/期望的截断值确定定量的上限和下限(ULOQ、LL0Q)。每个样本一式两份进行评价，计算平均值，并且在多数情况下％CV小于10%。为了适应在绝对值的宽范围内容中的统一数据显示，对每种分析物，数据显示为相对于基线值的倍数-变化。在基线值是不可检测的情况下，最低标准曲线值的一半用作基线值。分析物的标准曲线范围和基线(第O天)值(对UPN01、02和03连续地在圆括号中列出)的单位都为 pg/ml:1L1-Ra:35.5-29, 318(689,301,287) ;IL_6: 2.7-4，572 (7、10.1,8.7) ；IFN- y: 11.2-23, 972 (2.8, ND,4.2) ；CXCL10:2.卜5，319 (481、115、287) ；MIP-1 β:3.3-7, 233 (99.7,371 , 174) ;MCP_1: 4.8-3，600 (403、560、828)；CXCL9:48.2-3，700 (1，412、126、177) ；IL2-R a: 13.4-34,210 (4，319、9，477、610) ;IL-8:2.4-5，278 (15.3、14.5、14.6) ; IL-10: 6.7-13，874 (8.5、5.4、0.7)；MIP-1 α:7.1-13，778(57.6,57.3,48.1)。
[0042]图4，包括图4Α至4D，是描绘了延长的表面CART19表达和体内功能记忆CAR的建立的一系列图像。图4Α描绘了 CAR-表达⑶3+淋巴细胞的检测和外围和骨髓中B细胞的不存在。在CART19细胞注入后的第169天，从UPN03获得的新鲜处理的外周血或骨髓单核细胞通过流式细胞术对CAR19的表面表达(顶部)或B细胞的存在(底部)进行评价；作为对照，从健康捐赠者ND365获得的PBMC被染色。⑶3+和B细胞群的设门策略(gatingstrategy)显示在图9中。为了评价⑶3+淋巴细胞中的CAR19表达，样本与⑶14_PE_Cy7和⑶16-PE-Cy7(泄放通道(dump channel))和⑶3-FITC的抗体进行共染色，对⑶3+阳性设门，并且通过与⑶8 a -PE和与Alexa-647缀合的抗-CAR19个体基因型抗体的共染色评价⑶8+和⑶8-淋巴细胞区室中的CAR19表达。标绘图中的数据对泄放通道-阴性/⑶3-阳性细胞群设门。为了评价B细胞的存在，样本与对⑶14-APC和⑶3-FITC(泄放通道)的抗体进行共染色，并通过与对⑶20-PE和⑶19-PE-Cy-7的抗体的共染色评价泄放通道-阴性部分中B细胞的存在。在所有情况中，阴性门象限被建立在非染色对照上，如图4B和4C所描绘的。显示了 CD4+(图4B)和CD8+(图4C)T细胞亚型的T细胞免疫表型分析。在T细胞注入后第56和169天，通过单采血液成分术获得的来自UPN03的冷冻外周血样本在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并经历用于表达T细胞记忆、活化和消耗的标记的多参数免疫表型分析。如图8所描绘的设门策略包括对泄放通道(⑶14、⑶16、Live/DeadAqua)-阴性和⑶3-阳性细胞最初设门，随后对⑶4+和⑶8+细胞阳性设门。门和象限利用FMO 对照(CAR、CD45RA、PD-1、CD25、CD127、CCR7)或通过对阳性细胞群(CD3、CD4、CD8)和清楚描绘的亚型(⑶27、⑶28、⑶57)设门建立；在对事件(event)的客观可视化的双指数转化后，显示数据。图4D描绘了持续CAR细胞的功能性能力(functional competence)。在T细胞注入后第56和169天通过单采血液成分术获得的来自UPN03的冷冻外周血样本在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并利用CD107脱粒测定直接离体评价识别CD19-表达靶细胞的能力。在抗-⑶28、抗-⑶49d和⑶107-FITC的存在下两个小时的温育后，细胞混合物被收获、冲洗和经历多参数流式细胞检测分析，以评价响应CD19-表达靶CART19细胞脱粒的能力。设门策略包括对泄放通道(CD14-PE-Cy7、CD16-PE_Cy7、Live/Dead Aqua)-阴性和⑶3-PE-阳性细胞的最初门，随后是对⑶8-PE-Texas Red-阳性细胞设门；显示的数据是针对CD8+设门的群。在所有情况中，阴性门象限建立在非染色对照上。
[0043]图5，包括图5A至5C，是系列图像，其描绘了 CARTl细胞注入后评估临床应答的实验结果。图5A描绘了 UPN02用两个周期的利妥昔单抗和苯达莫司汀以最小应答进行治疗(R/B，箭头)。CART19T细胞在仅苯达莫司汀(B，箭头)后4天开始注入。耐利妥昔单抗和苯达莫司汀的白血病快速从血液中清除，如在注入的18天内，绝对淋巴细胞计数(ALC)从60，600/μ I降低至200/μ I所指示的。由于身体不适和非传染性发热综合征，皮质类固醇治疗在注入后的第18天开始。参考线(点线的)指示ALC的正常上限。图5Β描绘了针对CD20将来自患者UPNOl和03的`连续的骨髓活组织检查或凝块标本染色的实施例实验的结果。用存在于两个患者中的白血病的预处理浸润在处理后标本上不存在，伴随细胞构成和三系造血作用的正常化。UPNOl没有检测到任何CLL细胞，如由流式细胞术、细胞遗传学和荧光原位杂交评估的，也没有在骨髓或血液中由流式细胞术检测到正常B细胞。UPN03在第+23天通过流式细胞术证实具有5%残余的正常CD5-阴性B细胞，其也显示它们为多克隆的；在第+176天未检测到正常B细胞。图5C描绘了利用连续CT成像评估耐化疗的普遍性淋巴结病的快速消散(resolution)的实验结果。双侧腋窝肿块(axillary mass)在注入后的第83 (UPNOl)和31(UPN03)天消散，如箭头和圆圈指示的。
[0044]图6，包括图6A至6C，是一系列图像，其描绘了 UPN01、02、03的循环中的绝对淋巴细胞计数和总CART19+细胞。利用来自CBC值的绝对淋巴细胞计数并假设5.0L体积的血液，对所有3个实验对象，绘制循环中淋巴细胞总数(总的正常细胞和CLL细胞)对总CART19+细胞的图。循环中的CART19细胞总数如下计算:通过利用串联CBC值与绝对淋巴细胞计数和Q-PCR标记值，如图2所描绘的，将拷贝数/ng DNA转化为平均％标记，如本文其他地方所述的。发现Q_PCR%标记与注入产物的流式细胞术特性和来自其中伴随的流式细胞术数据可通过染色直接计数CART19细胞获得的样本数据紧密相关(〈2倍变化)。
[0045]图7，包括图7A至7D，是一系列图像，其描绘了涉及T细胞注入后71天，UPN-OIPBMC中CART19-阳性细胞的直接离体检测的实验。在注入后第71天，单采血液成分术后新鲜收集或在用于制造T细胞产物(基线)的单采血液成分术时冷冻并在染色前存活地解冻的UPN-01PBMC，经历流式细胞计数分析，以检测在表面上表达CAR19部分的CART19细胞的存在。为了评价CAR19在淋巴细胞中的表达，将样本与⑶3-PE和缀合至Alexa-647的抗-CAR19个体基因型抗体共染色，或与仅⑶3-PE(CAR19的FM0)共染色。图7A描绘了最初的淋巴细胞门基于前向和侧向散射(FSC对SSC)，随后对CD3+细胞设门建立。图7B描绘了 CD3+淋巴细胞门；图7C描绘了 CAR个体基因型染色；图7D描绘了 CAR个体基因型FMO。CAR19-阳性门建立在CAR19FM0样本上。
[0046]图8，包括图8A至8C，是一系列图像，其描绘了在UPN03血液标本中通过使用多色流式细胞术鉴定CART19表达的设门策略。图8C的设门策略显示为针对UPN03第56天的样本，并为在UPN03第169天样本上使用的策略的代表。图8A描绘了初级门:Dump (⑶14、CD16、LIVE/dead Aqua)阴性，CD3-阳性。图8B描绘了次级门:CD4_阳性，CD8阳性。图8C描绘了三级门:CAR19-阳性和CAR19-阴性，其建立在CAR FMO样本(最右图)上。
[0047]图9描绘了直接鉴定血液和骨髓标本中的CART19表达和B细胞的设门策略。图4A的设门策略，其显示外周和骨髓中的CAR-表达⑶3+淋巴细胞的检测和B细胞的缺失:左标绘图:细胞门；上图:⑶3+细胞的阳性门；下图:B细胞的阴性门(⑶14-阴性，⑶3-阴性)。NC365:来自健康捐赠者的外周血对照细胞。
[0048]图10为概括患者人口统计学特征和应答的图像。
[0049]图11描绘了 CART-19细胞的制造方法。
[0050]图12，包括图12A至12D，为描绘了患者临床应答的一系列图像。图12A显不用于感染该患者T细胞的慢病毒载体。产生水泡性口炎病毒G蛋白(pELPsl9-BB-z)的假型的、临床级慢病毒载体，其指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFV、人CD8a铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3 4信号传导结构域的表达。在图12A底部的CAR19转基因的细节显示了主要的功能元件。该图不是按比例的。3’LTR指示3’长末端重复；5’LTR:5’长末端重复;Amp R:氨苄西林抗性基因；牛GH Poly A:具有多腺苷酸化尾的牛生长激素；cPPT/CTS:具有中心终止序列的中心聚嘌呤区；EF-1 a:延伸因子1-a ；env:包膜；gag:群特异性抗原；pol:编码聚合酶和逆转录酶的HIV基因；R:重复；RRE:rev应答元件；scFv:单链可变片段；TM:跨膜；和WPRE:土拨鼠肝炎病毒后转录调节元件。图12B显示在首次CART19-细胞注入后从第I天至第28天的血清肌酸酐、尿酸和乳酸脱氢酶(LDH)水平。峰值水平与肿瘤溶解综合征的住院治疗同时发生。图12C显示在化疗后第3天(第-1天，在CART19-细胞注入前)和在CART19-细胞注入后第23天和第6个月获得的骨髓-活组织检查标本(苏木精和曙红)。基线标本显示了具有三系造血作用的细胞过多骨髓(60%)，其由占总细胞构成40%的小的、成熟的淋巴细胞的占主导的间质聚集体浸润。第23天获得的标本显示对慢性淋巴白血病(CLL)为阴性的残余淋巴聚集体(10%)，和T细胞和CD5-阴性B细胞的混合物。注入后6个月获得的标本显示三系造血作用，没有淋巴聚集体和CLL继续缺失。图12D显示了在该患者被招入研究前和在首次注入后第31天和第104天获得的对比增强(照影增强)的CT扫描。注入前(preinfusion) CT扫描显示I至3-cm双侧肿块。腋淋巴结病的衰退发生在注入后I个月内并为持续性的。箭头强调在治疗前多种扩大的淋巴结和在治疗后可比CT扫描上的淋巴结应答。
[0051]图13，包括图13A至13E，是一系列图像，其描绘了嵌合抗原受体T-细胞注入前后的血清和骨髓细胞因子。细胞因子干扰素-Y (图13A)、干扰素-Y-刺激的趋化因子C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)(图13B)和C-X-C基序配体9 (CXCL9)(图13C)和白细胞介素-6 (图13D)的一系列测量值在指示的时间点上进行测量。这些炎性细胞因子和趋化因子的增加与肿瘤溶解综合征的开始同时发生。低水平的白细胞介素-6在基线上检测到，而干扰素-Y、CXCL9和CXCLlO在基线上的检测限以下。患者中的分析物标准曲线范围和基
线值-提供在圆括号内-如下:干扰素-Y:11.2至23，972pg每毫升(1.4pg每毫升)；
CXCLlO:2.1 至 5319pg 每毫升(274pg 每毫升)；CXCL9:48.2 至 3700pg 每毫升(177pg 每毫升);白细胞介素-6:2.7至4572pg每毫升(8.3pg每毫升);肿瘤坏死因子a (TNF- α ):1.9至4005pg每毫升(不可检测);和可溶白细胞介素-2受体:13，4至34，210pg每毫升(644pg每毫升)。图13E显示骨髓中免疫应答的诱导。细胞因子TNF-α、白细胞介素-6、干扰素-Y、趋化因子CXCL9和可溶白细胞介素-2受体在CART19-细胞注入前后的指定天，在从骨髓吸取物中获得的上清液中进行测量。白细胞介素_6、干扰素-Y、CXCL9和可溶白细胞介素-2受体的水平增加与肿瘤溶解综合征、峰值嵌合抗原受体T-细胞浸润和白血病浸润的根除同时发生。
[0052]图14，包括图14A至14C，是描绘了体内嵌合抗原受体T细胞的扩展和持久性的一系列图像。基因组DNA (gDNA)从在嵌合抗原受体T-细胞注入前后的一系列时间点上收集的该患者的全血(图14A)和骨髓吸取物(图14B)的样本中分离，并用于定量实时聚合酶链反应(PCR)分析。如在转基因DNA和表达CAR19的淋巴细胞百分数的基础上评估的，嵌合抗原受体T细胞扩展至的水平高于外周血和骨髓`中最初移植物移入水平的1000倍。嵌合抗原受体T细胞的峰值水平与肿瘤溶解综合征时间地相关。在第O天获得的血液样本和在第I天获得的骨髓样本在基线上没有PCR信号。基线上骨髓吸取物的流式细胞计数分析(图14C)显示用克隆的⑶19+⑶5+细胞的占主导的浸润——如通过免疫球蛋白K轻链染色评估的，具有极少量的T细胞。在注入后第31天，存在⑶5+T细胞，并且没有检测到正常或恶性的B细胞。该数目指示每个象限中细胞的相对频率。X轴和y轴两者显示1glO比例范围。该设门策略包括左边方框中对⑶19+和⑶5+细胞的最初设门，和随后对⑶19+⑶5+亚型的免疫球蛋白K和λ表达的鉴定(右边方框)。
[0053]发明详述
[0054]本发明涉及治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于血液学恶性肿瘤和实体瘤。本发明涉及被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继细胞转移的策略。CAR是联合对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性和T细胞受体-活化细胞内结构域以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0055]本发明一般地涉及被基因修饰以稳定表达期望的CAR的T细胞的应用。表达CAR的T细胞在本文中被称为CAR T细胞或CAR修饰T细胞。优选地，该细胞可被基因修饰，以在它表面上稳定表达抗体结合结构域，给予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些例子中，T细胞被基因修饰，以稳定表达CAR，所述CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3- ζ链或FcyRI蛋白的细胞内结构域联合成为单一嵌合蛋白。[0056]在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域、跨膜结构域和胞浆结构域的胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，可选择跨膜结构域，或可由氨基酸置换修饰，以避免这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。优选地，跨膜结构域为CD8铰合结构域。
[0057]相对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计以由其本身包括⑶28和/或4-1BB信号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容下有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。在一个实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以进一步包括CD3-(的信号传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于CD3- ζ、4-1ΒΒ和CD28信号传导模块和其组合。因此，本发明提供了 CAR T细胞和它们用于过继疗法的方法。
[0058]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过将包括期望的CAR的慢病毒载体引入细胞而产生，所述期望的CAR是例如包括抗-⑶19、⑶8α铰合和跨膜结构域、和人4-1ΒΒ和⑶3ζ信号传导结构域的CAR。本发明的CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0059]在一个实施方式中，本发明涉及利用淋巴细胞注入施用表达CAR的基因修饰T细胞，以治疗具有癌症或处于具有癌症风险下的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMC从需要治疗的患者收集，和T细胞利用本文描述和本领域已知的方法进行活化和扩展，并且随后注入返回患者。
[0060]还在另一个实施方式中，本发明一般地涉及处于形成CLL的风险下的患者的治疗。本发明也包括治疗恶性肿瘤或自身免疫疾病，其中患者的化疗和/或免疫疗法产生患者的显著免疫抑制，由此增加患者形成CLL的风险。
[0061]本发明包括利用表达包括⑶3- ζ和4-1ΒΒ共刺激结构域两者的抗-⑶19CAR的T细胞(也被称为CART19T细胞)。本发明的CART19T细胞可承受稳固的体内T细胞扩展，并可建立CD19-特异性记忆细胞，其在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量。在一些例子中，本发明的注入患者的CART19T细胞可消除具有晚期耐化疗CLL的患者体内的白血病细胞。然而，本发明不限于CART19T细胞，更确切地，本发明包括与选自⑶137(4-1ΒΒ)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3 ζ信号传导结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合的任何抗原结合部分。
[0062]定义
[0063]除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在 测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
[0064]也应理解本文使用的术语仅是为了描述【具体实施方式】的目的，并不意欲是限制性的。
[0065]本文使用冠词“一个(a) ”和“一个(an) ”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
[0066]如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20%或土 10%的变化，更优选±5%，甚至更优选土 1%，和还要更优选±0.1%的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
[0067]“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
[0068]术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv, Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow 等，1999，In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY ；Harlow 等，1989，In:Antibodies:ALaboratory Manual, ColdSpring Harbor, New York ;Houston等，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 ；Bird等，1988，Science242:423-426)。
[0069]术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
[0070]“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
[0071]“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，K和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
[0072]如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
[0073]如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA—其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
[0074]如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
[0075]根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
[0076]如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
[0077]如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
[0078]“同种异基因的(allogeneic) ”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
[0079]“异种的(xenogeneic) ”指的是源自不同物种的动物的移植物。
[0080]如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0081]如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-LU PD_L2、4_1BBL、0X40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和与 CD83 特异性结合的配体。
[0082]“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖，共刺激分子包括但不限于MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体。
[0083]如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
[0084]“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必定引起动物健康状态的进一步降低。
[0085]如本文所用的“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
[0086]“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
[0087]如本文所用的“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
[0088]如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
[0089]如本文所用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0090]“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0091]“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数XlOO的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60%同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50%的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
[0092]如本文所用的术语“`免疫球蛋白”或“ Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
[0093]如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
[0094]“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
[0095]在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
[0096]除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
[0097]如本文所用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV是所有慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
[0098]如本文所用的术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象优选人的有益的治疗性应答。
[0099]除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
[0100]术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
[0101] 术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
[0102]免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(1.v.)、肌肉内(1.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
[0103]术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
[0104]如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR?等等克隆核酸序列，和合成手段。
[0105]如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可包括蛋白质或肽的序列的最大数目的氨基酸没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。[0106]如本文所用的术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或引导合成机器的DNA序列。
[0107]如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
[0108]“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
[0109]“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
[0110]“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
[0111]如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。
[0112]通过术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/⑶3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织
坐坐寸寸ο
[0113]“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
[0114]如本文所用的“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
[0115]术语“对象”意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(例如，哺乳动物)。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
[0116]如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然发生状态中与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。
[0117]如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
[0118]术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量:当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
[0119]“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
[0120]如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。
[0121]如本文所用的短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以 控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
[0122]“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
[0123]范围:在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从I至6的描述应被考虑为具有具体公开的子范围诸如从I至3、从I至4、从I至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、
5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
[0124]说里
[0125]本发明提供了治疗癌症等疾病的组合物和方法。该癌症可为血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为血液学恶性肿瘤，和更优选地，该癌症为慢性淋巴细胞白血病(CLL)。利用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
[0126]在一个实施方式中，本发明提供了工程改造以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞显示抗肿瘤性质。本发明的CAR可被工程改造以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3 ζ )的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原为⑶19,因为该抗原在恶性B细胞上表达。然而,本发明不限于靶向CD19。相反地，本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumor burden)缩小或消除。抗原结合部分优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3 ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合。
[0127]在一个实施方式中，本发明的CAR包括⑶137 (4-1ΒΒ)信号传导结构域。这是因为本发明部分地基于CAR-介导的T-细胞应答可利用共刺激结构域的添加而进一步提高的发现。例如，与没有被工程改造以表达⑶137 (4-1ΒΒ)的其他方式相同的CAR T细胞相比，包括CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CAR T细胞的体内持久性。
[0128]鉬合物
[0129]本发明提供了包括细胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。细胞内结构域或另外的胞浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0130]在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
[0131]抗原结合部分
[0132]在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
[0133]在一个实施方式中，本发明的CAR可经由工程改造特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分被工程改造，以便靶向兴趣肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性紊乱(hyperproliferative disorder)抗原”或“与过度增生性紊乱相关的抗原”指的是对于特定过度增生性紊乱诸如癌症常见的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
[0134]肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β_人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-UMN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2 (AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ES0-l、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、印hrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-1、IGF-11、IGF-1 受体和间皮素。
[0135]在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如⑶19、⑶20和⑶37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、⑶19、⑶20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。
[0136]本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。
[0137]TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下:分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gpl00 (Pmell7)、酪氨酸酶、TRP_1、TRP_2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE, GAGE-1、GAGE-2、pl5 ;过表达的胚胎抗原诸如CEA ;过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras, HER-2/neu ；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如 BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-1GK、MYL-RAR ;和病毒抗原，诸如 Epstein Barr 病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO,` pl85erbB2、pl80erbB_3、c_met、nm_23Hl、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K_ras、β -联蛋白、CDK4、Mum-1、pl5、pl6、43_9F、5T4、791Tgp72、a -胎蛋白、β -HCG, BCA225、BTAA, CA125、CA15_3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 结合蛋白 \ 亲环蛋白 C 相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0138]在优选的实施方式中，CAR的抗原结合部分靶向如此抗原，所述抗原包括但不限于 CD19、CD20、CD22、R0R1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met, PSMA、糖月旨 F77、EGFRvII1、GD-2、MY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 等等。
[0139]取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程改造以包括对期望抗原靶特异性的适当的抗原结合部分。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体可用作抗原结合部分，并入本发明的CAR。
[0140]在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分靶向CD19。优选地，本发明的CAR中的抗原结合部分为抗-⑶19scFV，其中抗-⑶19scFV的核酸序列包括SEQ ID: 14中提出的序列。在一个实施方式中，抗-⑶19scFV包括编码SEQID NO:20的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗-⑶19scFV部分包括SEQ ID N0:20中提出的氨基酸序列。
[0141]跨膜结构域
[0142]对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0143]跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、⑶137、⑶154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和胞浆信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
[0144]优选地，本发明的CAR中的跨膜结构域为⑶8跨膜结构域。在一个实施方式中，⑶8跨膜结构域包括SEQ ID NO: 16的核酸序列。在一个实施方式中，⑶8跨膜结构域包括编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，⑶8跨膜结构域包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
[0145]在一些例子中，本发明的CAR的跨膜结构域包括⑶8 α铰合结构域。在一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括SEQ ID Ν0:15的核酸序列。在一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括编码SEQ ID Ν0:21的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括SEQ ID Ν0:21的氨基酸`序列。
[0146]胞浆结构域
[0147]本发明的CAR的胞浆结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0148]用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0149]已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两个不同类的胞浆信号传导序列介导:通过TCR(初级胞浆信号传导序列)开始抗原-依赖性初级活化的那些和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞浆信号传导序列)的那些。[0150]初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0151]包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCR ζ、FcR Y、FcRP、CD3 Y、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞浆信号传导分子包括源于CD3 ζ的胞浆信号传导序列。
[0152]在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3_(信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3(链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与⑶83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。
[0153]本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
[0154]在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3_(的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-(的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括⑶3- ζ的信号传导结构域和⑶28和4-1ΒΒ的信号传导结构域。
[0155]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3-ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括SEQ TD NO: 17中提出的核酸序列和⑶3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO: 18中提出的核酸序列。
[0156]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3- ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括编码SEQ IDNO: 23的氨基酸序列的核酸序列，和⑶3-ζ的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的核酸序列。
[0157]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3-ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括SEQ ID NO: 23中提出的氨基酸序列，和CD3-(的信号传导结构域包括SEQ ID N0:24中提出的氨基酸序列。
[0158]
[0159]本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中该序列包括可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于⑶3-ζ、⑶28、4-1ΒΒ等等的细胞内结构域。在一些例子中，CAR可包括CD3- ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。
[0160]在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗-⑶19scFv、人⑶8铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和⑶3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:8中提出的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID N0:12的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID N0:12中提出的氨基酸序列。
[0161]编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。
[0162]本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
[0163]简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0164]本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5，399，346、5，580，859、5，589，466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0165]该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0166]进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如 Sambrook 等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，W001/96584 ；W001/29058 ;和美国专利号6，326，193)。
[0167]已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0168]额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0169]合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1 a (EF-1 α )。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40 (SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0170]为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0171]报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因:其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，U1-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0172]将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0173]将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如 Sambrook 等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0174]将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5，350，674和5，585，362。
[0175]将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。[0176]在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0177]适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma, St.Louis, MO 中获得；憐酸二嫁腊酯(“DCP”)可从K&K Laboratories (Plainview,NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring中获得；二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20°C下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，191Glycobiology5; 505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
[0178]不管用于将外源核酸弓丨入宿主细胞的方法，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，以便证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR ；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(EL1SA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
[0179]T细朐的来源
[0180]在本发明的T细胞的扩展和遗传修饰前，从对象获得T细胞的来源。T细胞可从许多来源中获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用在本领域中可用的任何数量的T细胞系。 在本发明的某些实施方式中，T细胞可利用技术人员已知的任何数量的技术诸如Ficoll?分离法从对象中收集的单位血液中获得。在一个优选实施方式中，来自个体循环血液中的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可冲洗由单采血液成分术收集的细胞，以移除血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或介质中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。在一个可选实施方式中，冲洗液缺少钙并可缺少镁，或可缺少很多——如果不是全部的话——的二价阳离子。此外，令人惊讶地，在缺少钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。本领域技术人员将容易理解冲洗步骤可通过本领域中技术人员已知的方法完成，诸如根据制造商的使用说明通过使用半自动“最大限度(直流,flow-through) ”沉降离心机(例如，Cobe2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)。在冲洗后，细胞可重悬浮在生物相容的缓冲液中，诸如，例如，无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyte A或含有或不含有缓冲液的其他盐溶液。可选地，可移除单采血液成分术样本的不期望组分，并且将细胞直接重悬浮在培养基中。
[0181]在另一个实施方式中，T细胞通过溶解红细胞和耗尽单核细胞从外周血淋巴细胞中分离出来,例如，通过经过PERC0LL?梯度的离心或通过逆流离心淘洗(counterflowcentrifugal elutriation)。T 细胞的特定亚群，诸如 CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45R0+T细胞，可进一步通过阳性或阴性选择技术进行分离。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗-CD3/ 抗-CD28 (即，3X28)-缀合珠诸如 DYNABEADS? M-450CD3/CD28T —起温育持续足以阳性选择期望T细胞的时间段，进行分离。在一个实施方式中，时间段为大约30分钟。在进一步的实施方式中，时间段范围为30分钟至36小时或更长，和其间的所有的整数值。在进一步的实施方式中，时间段为至少1、2、3、4、5或6个小时。还在另一个优选的实施方式中，时间段为10至24个小时。在一个优选实施方式中，温育时间段为24个小时。对于分离来自具有白血病的患者的T细胞，使用更长的温育时间诸如24个小时，可增加细胞产量。更长的温育时间可用于在与其他细胞类型相比具有更少T细胞的任何情况下分离T细胞,例如,在分离来自肿瘤组织或来自无免疫应答(immune-compromised)个体的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。进一步地，使用更长的温育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合至⑶3/⑶28珠，和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文中进一步描述的)，在培养初始或在该过程的其他时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。另外，通过增加或减少珠或其他表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比率，在培养初始或在其他期望的时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。技术人员将理解多轮选择也可用于本发明的内容中。在某些实施方式中，可期望实施选择程序并在活化和扩展过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经历更多轮的选择。
`[0182]通过阴性选择的T细胞群的富集可利用涉及对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合完成。一种方法为细胞分选和/或选择，其经阴性磁性免疫粘附或使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例如，为了通过阴性选择富集⑶4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括对⑶14、⑶20、⑶lib、⑶16、HLA-DR和⑶8的抗体。在某些实施方式中，可期望富集或阳性选择通常表达⑶4+、⑶25+、⑶62Lh1、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可选地，在某些实施方式中，T调节细胞通过抗-C25缀合珠或其他类似的选择方法耗尽。
[0183]对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少其中珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于I亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X106细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100父106细胞/1111的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150X IO6细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞，或捕获来自有很多肿瘤细胞存在的样本(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
[0184]在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达高数量的结合至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5X 106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可从大约lX105/ml至I X 106/ml，和之间的任何整数值。
[0185]在其他实施方式中，细胞可在旋转器上以变化的速度，在2-10°C或室温的任一个温度下温育变化的时间长度。
[0186]在冲洗步骤后，用于刺激的T细胞也可被冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除细胞群中的粒细胞和以一定程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的冲洗步骤后，细胞可被悬浮在冷冻液中。尽管很多冷冻液和参数在本领域中是已知的，并将在该背景下是有用的，但一个方法包括使用包含20%DMS0和8%人血清白蛋白的PBS，或包含10%葡聚糖40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMS0,或
31.25%Plasmalyte-A、3L 25%右旋糖 5%、(λ 45%NaCl、10%葡聚糖 40 和 5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMS0的培养基，或包含例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后被以1°每分钟的速率冷冻至_80°C，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在_20°C下或液氮中不受控的即刻冷冻。
[0187]在某些实施方式中，冷`藏的细胞如本文所述的解冻和冲洗，并允许在使用本发明的方法活化前在室温下静止I个小时。
[0188]在本发明的内容下也考虑到的是在当可能需要如本文所述的扩展细胞前的时间段上，从对象收集血液样本或单采血液成分术产物。如此，待扩展的细胞的来源可在必要的任何时间点收集，并且期望的细胞，诸如T细胞，被分离和冷冻，以便以后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的任何数量的疾病或病症，诸如本文所述的那些。在一个实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自大体健康的对象。在某些实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自处于患病风险下但还没有患病的大体健康的对象，和感兴趣的细胞被分离和冷冻以便以后使用。在某些实施方式中，T细胞可在以后的时间被扩展、冷冻和使用。在某些实施方式中，如本文所述的具体疾病的诊断后立刻但在任何治疗前，从患者收集样本。在进一步的实施方式中，在任何数量的有关治疗形式前，从来自对象的血液样本或单采血液成分术样本分离细胞，所述治疗形式包括但不限于用以下治疗:试剂，诸如那他珠单抗(natal izumab)、厄法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、福射(radiation)、免疫抑制剂，诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂(immunoablative agent)诸如CAMPATH、抗-⑶3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228和照射(irradiation)。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶一钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的P70S6激酶(Liu等，Cell66:807-815, 1991;Henderson等，Tmmun.73:316-321，1991;Bterer 等，Curr.0pin.Tmmun.5:763-773，1993)。在进一步的实施方式中，对患者分离细胞并冷冻以便以后与骨髓或干细胞移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)使用。在另一个实施方式中，细胞被分离，然后可被冷冻以便以后在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan之后的治疗使用。
[0189]在本发明的进一步实施方式中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损坏免疫系统的药物的治疗后，在治疗后不久当患者将正常地从治疗中恢复期间，获得的T细胞的质量对于它们的离体扩展能力可为最佳或改善的。同样的，在利用本文描述的方法离体操纵后，这些细胞可处于提高的移植物移入和体内扩展的优选状态。因此，在本发明的内容内考虑在该恢复期期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血系的其他细胞。进一步地，在某些实施方式中，转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案可用于在对象中产生病症，其中具体细胞类型的再群体化(r印opulation)、再循环、再生和/或扩展是有利的，特别是在疗法后限定的时间窗期间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
_0] T细胞的活化和扩展
[0191]不论在T细胞遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩展:例如美国专利6，352，694 ;6，534，055 ;6，905，680 ;6，692，964 ；5，858，358 ;6，887，466 ;6，905，681 ;7，144，575 ;7，067，318 ;7，172，869 ;7，232，566 ；7，175，843 ;5，883，223 ;6，905，874 ;6，797，514 ;6，867，041 ;和美国专利申请公布号20060121005。
[0192] 通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-⑶2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9.3、B-T3、XR-Q)28 (Diacione, Besancon, France)的抗-CD28 抗体的例子(Berg 等，Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998;Haanen 等，J.Exp.Med.190 (9): 13191328，1999; Garland 等，J.1mmunol Meth.227 (1-2): 53-63，1999)。
[0193]在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fe受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上,见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩展本发明的T细胞。
[0194]在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分开的珠即“trans”上。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于⑶4+T细胞扩展和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到T细胞扩展的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到从大约I至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的⑶3:⑶28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-CD28抗体被结合至颗粒，即⑶3:⑶28的比率小于I。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗⑶28抗体与抗⑶3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的⑶3:⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的⑶3:⑶28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的⑶3:⑶28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的⑶3:⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的⑶3:⑶28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的⑶3:⑶28比率。
[0195]从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗-⑶3-和抗-CD28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而某些优选的值包括 1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1: 1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 和 15:1，一个优选的比率为至少 1:1 颗粒每 T 细胞。在一个实施方式中，使用1:1 或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒每天或此后每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1: 5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
[0196]在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
[0197]作为例子，可通过允许附接抗-⑶3和抗-⑶28的顺磁珠(3X28珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，IO4至IO9个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的「)YN ABEADS K M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液优选PBS (没有二价阳离子诸如，钙和镁)中进行联组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占0.01%的样本，或整个样本(即，100%)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在某些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于I亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50X IO6细胞/ml。还在另一个实施方式中，使用细胞浓度75、80、85、90、95或100X IO6细胞/ml，在进一步的实施方式中，可使用125或150X IO6细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱⑶28表达的⑶8+T细胞。
[0198]在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMl培养基1640或X-vivol5, (Lonza))，其可包含增殖和存活必须的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2 (IL-2)、胰岛素、IFN- Y、IL-4、IL-7、GM-CSF, IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和 2-巯基乙醇。培养基可 包括 RPMI1640、AM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F_12、X_Vivol5 和X-Vivo20、优选的(Optimizer),具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞的生长和扩展量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如，37°C )和气氛(例如，空气加5%C02)。
[0199]已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(T。，CD8+)更多的辅助T细胞群(TH，⑶4+)。T细胞通过刺激⑶3和⑶28受体的离体扩展在大约8-9天前产生主要由Th细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更多的T。细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括Th细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了 T。细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩展该亚型。
[0200]进一步地，除了⑶4和⑶8标记，其他表型标记在细胞扩展过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
[0201]治疗性应用
[0202]本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3- ζ、CD28、4-1BB或任何其组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
[0203]本发明提供了 CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤:施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3(的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
[0204]在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR，和CAR T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0205]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，不期望本发明的CART19细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CART细胞可体内分化成中心记忆样状态。
[0206]不希望被任何具体的理论所束缚，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的 抗原结合部分特异性的免疫应答。例如，CART19细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。
[0207]尽管本文公开的数据具体公开了包括源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-⑶19scFv、人⑶8 α铰合和跨膜结构域、和人4-1ΒΒ和⑶3 ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生对抗原结合部分特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合部分可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。
[0208]可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童
肿瘤/癌症。
[0209]血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0210]实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也已知为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
[0211]在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分被设计以治疗具体的癌症。例如，被设计以靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和紊乱，包括但不限于前-BALL (儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等。
[0212]在另一个实施方式中，CAR可被设计以靶向⑶22，治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。
[0213]在一个实施方式中，癌症和紊乱包括但不限于前-B ALL (儿童指征)，成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种骨髓移植后的补救等等，其可利用靶向CD19、⑶20、⑶22和RORl的CAR的组合进行治疗。
[0214]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向间皮素，来治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等
坐寸ο
`[0215]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向CD33/IL3Ra，来治疗急性骨髓性白血病
坐坐寸寸O
[0216]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向c-Met，来治疗三阴性乳腺癌、非小细胞
月市癌等等。
[0217]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向PSMA，来治疗前列腺癌等等。
[0218]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向糖脂F77，来治疗前列腺癌等等。
[0219]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向EGFRvIII，来治疗成胶质细胞瘤等等。
[0220]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向⑶_2，来治疗神经细胞瘤、黑素瘤等等。
[0221]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向NY-ES0-1TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
[0222]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向MAGE A3TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤
坐坐寸寸ο
[0223]然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。
[0224]本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0225]对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生:i)扩展细胞，?)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。[0226]离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0227]在此通过引用并入的在美国专利号5，199，942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括:(I)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5，199，942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-U IL-3和c_kit配体，也可用于培养和扩展细胞。
[0228]除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0229]通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
[0230]本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0231]本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0232]当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出:包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以IO4至IO9个细胞/kg体重的剂量，优选IO5至IO6个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.0f Med.319:1676,1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0233]在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩展的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可从IOcc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或IOOcc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽
取/多个再输注方案可用于选出某些T细胞群。
[0234] 对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(1.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过1.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0235]在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗:所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用:化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——韩调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的P70S6激酶(Liu 等，Cell66:807-815，1991;Henderson 等，Tmmun.73:316-321，1991;Bierer 等，Curr.0pin, Tmmun.5:763-773, 1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0236]施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在I至大约IOOmg的范围中，通常每天施用，持续I和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6，120，766中描述)，但优选的日剂量为I至IOmg每天。
[0237]实验实施例
[0238]本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
[0239]没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。
[0240]实施例1:表达嵌合受体的T细胞在具有晚期白血病的患者中建立记忆和有效的抗肿瘤效应[0241]被工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的淋巴细胞在先前临床试验中已经证明了最小的体内扩展和抗肿瘤效应。本文显示的结果证明在注入治疗的具有晚期慢性淋巴细胞白血病(CLL)的三个患者中的三个后，包含⑶137的CAR T细胞具有有效的非交叉抗性临床活性。被工程改造的T细胞体内扩展超过一千倍，运送至骨髓并继续以高水平表达功能性CAR至少6个月。平均起来，每个注入的CAR+T细胞根除至少1000个CLL细胞。在血液和骨髓中证明CD19特异性免疫应答，伴随三个患者中的两个完全缓和。一部分细胞持续作为记忆CAR+T细胞，指示该非MHC限制性方法有效治疗B细胞恶性肿瘤的潜力。
[0242]现在描述在这些实验中使用的材料和方法。
[0243]材料和方法
[0244]一般的实验室说明
[0245]研究样本处理、冷冻和实验室分析在宾夕法尼亚大学的翻译和相关研究实验室(Translational and Correlative Studies Laboratory)中进行，该实验室在良好实验室实践(Good Laboratory Practice)的原则下以建立的用于样本接收、处理、冷冻和分析的SOP和/或协议运行。测定性能和数据报告符合MIATA指南(Janetzki等，2009,Immunity31:527-528)。
[0246]方案设计
[0247]临床试验(NCT01029366)如在图1中图解地进行。具有⑶19阳性血液恶性肿瘤的如此患者适合该试验，所述患者在至少两个之前的治疗方案后具有持续的疾病，并且不适合同种异基因的干细胞移植。在肿瘤再分级(restaging)后,用于CART19制造的外周血T细胞通过单采血液成分术收集，并且在注入前的一周期间提供给对象单一过程的化疗，如图10所规定的。CART19细胞以图10中指示的剂量，使用3天分次剂量方案(10%、30%和60%)通过静脉内注入施用，并且如果可行，在第10天施用第二剂量；仅患者UPN02具有足够的细胞用于第二次注入。以频繁的间隔评估对象的毒性和应答，持续至少6个月。该方案由美国食品药品管理局(US Food and Drug Administration)、重组DNA咨询委员会(Advisory Committee)和宾夕法尼亚大学的机构审查委员会(Institutional ReviewBoard)批准。注入的第一天设定为研究第O天。
[0248]对象:临床总结
[0249]临床总结在图10中概述，并且详细的历史在本文的其他位置提供。患者UPN01在55岁时首次诊断为第I I阶段B细胞CLL。该患者无临床症状并被观察大约1-1/2年，直到需要对进行性淋巴细胞增多、血小板减少、腺病和脾肿大治疗。在该时间过程内，该患者接受当前的疗法(prior lines of therapy)。最近的疗法为在CART19细胞注入前2个月的2个周期的喷司他丁、环磷酰胺和利妥昔单抗，伴随最小应答。该患者随后接受一个周期的苯达莫司汀作为在CART-19细胞注入前的淋巴耗尽化疗。
[0250]患者UPN02在68岁，当该患者显示疲劳和白细胞增多时，首次诊断患有CLL。该患者相对稳定持续4年，此时该患者形成需要治疗的进行性白细胞增多(195，000/μ I)、贫血症和血小板减少。核型分析显示CLL细胞已经缺失染色体17ρ。因为进行性疾病，该患者用阿仑单抗治疗，有部分缓解，但在一年半内，该患者具有进行性疾病。该患者用阿仑单抗再治疗18个周，有部分缓解，并且I年无进展的间隔时间。该患者随后接受2个周期的苯达莫司汀和利妥昔单抗，没有显著应答(图5Α)。该患者在CART-19细胞注入前，接受单一试剂苯达莫司汀作为淋巴耗尽化疗。
[0251]患者UPN03在50岁显示无症状第I阶段CLL，并随后观察数年。该患者具有需要治疗的进行性白细胞增多(白细胞计数92，000/μ I)和进行性腺病。该患者接受2个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨，其导致血细胞计数正常化和显著的改善，尽管没有完全解决腺病。该患者具有大约3年的无进展的间隔时间。核型测试显示细胞包含染色体17ρ的缺失，FISH证明200个细胞中的170个中ΤΡ53缺失。在接下来的数年中，该患者需要针对进行性白细胞增多和腺病的3种不同线的疗法(图10)，最后在CARTl细胞注入前接受阿仑单抗6个月，有部分缓解。在CART-19细胞注入前，该患者接受喷司他丁和环磷酰胺作为淋巴耗尽化疗。
[0252]载体产牛
[0253]CD19-BB-Z转基因(GeMCRIS0607_793)如所述进行设计和构造(Milone等，2009, Mol Ther.17:1453-1464)。慢病毒载体如所述根据目前良好的制造实践，利用Lentigen公司的三质粒生产方法进行生产(Zufferey等，1997, Naturebiotechnoll5:871-875)。
[0254]CART19细朐产物的制各
[0255]已经描述了利用包被有抗-⑶3和抗-⑶28单克隆抗体的顺磁聚苯乙烯珠的T细胞制备方法(Laport等,2003,Bloodl02:2004-2013)。慢病毒转导如所述进行(Levine等，2006, Proc Natl Acad Sci U S A103:17372-17377)。
[0256]肿瘤负荷计算的方法
[0257]估计基线上的CLL负荷，如图10所示。如下述计算骨髓、血液和次级淋巴组织中的CLL细胞数量。`
[0258]骨髓:在健康的成人中，骨髓占大约5%的总体重(Woodard等，1960, PhysMedBiol，5:57-59 ;Bigle 等，1976，Health Phys31:213-218)。髂嵴样本中的骨髓具有随年龄增加的非活性(脂肪)骨髓百分比，从5岁的总骨髓的20%上升至35岁的大约50%，此时它保持稳定，直到65岁，并且随后到75岁上升至大约67%的非活性骨髓(Hartsock等，1965，Am J Clin Path43:326-331)。35岁男性的活性(红细胞)和非活性(脂肪)骨髓的总骨骼重量的国际参考值目前分别设定为1170g和2480g((Basic anatomical andphysiological data for use in radiological protection:The Skeleton in Annalsof the ICRP (用于放射防护的基础解剖和生理学数据:ICRP年报中的骨骼)，Vol.25 (ed.Smith, H.)58-68(放射防护国际委员会的委员会2的任务组的报告，牛津，1995))。35岁至65岁之间的成年男性具有占总体重5.0%、由1.6%的活性(红细胞)骨髓和3.4%的非活性(脂肪)骨髓组成的骨髓(Basic anatomical and physiological data for usein radiological protection:The Skeleton in Annals of the ICRP, Vol.25(ed.Smith，H.)58-68(放射防护国际委员会的委员会2的任务组的报告，牛津，1995))。基于骨髓活组织检查和吸取物标本，计算基线上三个患者的CLL细胞的重量,如表1所示。这些总CLL骨髓质量的估计值随后利用IKg=IO12个细胞转变成骨髓中的总CLL细胞数，并且所得数目显示在图10中。这些计算基于CLL在骨髓中具有均匀分布的假设。对于患者UPN01，显示对在苯达莫司汀化疗前获得的骨髓活组织检查，和在苯达莫司汀之后且CART19注入前获得的吸取物的计算。由于第-1天吸取物的技术限制，与第-14天活组织检查标本相比，第-1天吸取物的数目不太精确。患者UPN02具有单一治疗前活组织检查标本，其显示骨髓由CLL完全取代。该患者在CART19后的第30天具有未改变的标本。患者UPN03的骨髓负荷基于化疗后且CART19活组织检查前进行计算。
[0259]表1:骨髓质量
[0260]
1
【权利要求】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3(信号传导结构域，其中所述CD3(信号传导结构域包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包括SEQID NO: 12的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的分离的核酸序列,其包括SEQID NO:8的核酸序列。
4.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。
5.权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述抗原-结合片段为Fab或scFv。
6.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
7.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
8.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
9.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、R0R1、间皮素、CD33/IL3Ra、c_Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR 和其任何组合。
10.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA- 1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。
11.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述CD3(信号传导结构域由SEQIDNO: 18的核酸序列编码。
12.分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和⑶3 ζ信号传导结构域，其中所述⑶3 ζ信号传导结构域包括SEQID NO: 24的氨基酸序列。
13.权利要求12所述的分离的CAR，其中所述CAR包括SEQID NO: 12的氨基酸序列。
14.权利要求12所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。
15.权利要求14所述的分离的CAR，其中所述抗原结合片段为Fab或scFv。
16.权利要求12所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
17.权利要求16所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
18.权利要求16所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
19.权利要求16所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、R0R1、间皮素、CD33/IL3Ra、c_Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR 和其任何组合。
20.权利要求12所述的分离的CAR，其中所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD2S、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。
21.细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域。
22.权利要求21所述的细胞，其中所述CAR包括SEQID NO: 12的氨基酸序列。
23.权利要求21所述的细胞，其中所述核酸包括SEQID NO:8的核酸序列。
24.权利要求21所述的细胞，其中所述抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。
25.权利要求24所述的细胞，其中所述抗原-结合片段为Fab或scFv。
26.权利要求21所述的细胞，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
27.权利要求26所述的细胞，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
28.权利要求26所述的细胞，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
29.权利要求26所述的细胞，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ES0-lTCR、MAGE A3TCR 和其任何组八口 ο
30.权利要求21所述的细胞，其中所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LTGHT, NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。
31.权利要求21所述的细胞，其中所述⑶3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO: 18的核酸序列编码。
32.权利要求21所述的细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节T细胞。
33.权利要求21所述的细胞，其中当所述抗原结合结构域结合它相应的抗原时，所述细胞显示抗肿瘤免疫。
34.载体，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3(信号传导结构域，其中所述CD3(信号传导结构域包括SEQ ID NO ；24的氨基酸序列。
35.权利要求34所述的载体，其中所述CAR包括SEQID NO: 12的氨基酸序列。
36.权利要求34所述的载体，其中所述编码CAR的分离的核酸序列包括SEQID NO:8的核酸序列。
37.权利要求34所述的载体，其中所述抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。
38.权利要求37所述的载体，其中所述抗原-结合片段为Fab或scFv。
39.权利要求34所述的载体，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
40.权利要求39所述的载体，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
41.权利要求39所述的载体，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
42.权利要求39所述的载体，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ES0-lTCR、MAGE A3TCR 和其任何组八口 ο
43.权利要求34所述的载体，其中所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。
44.权利要求34所述的载体，其中所述⑶3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO: 18的核酸序列编码。
45.刺激对哺乳动物中靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，所述方法包括: 施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，其中选择所述抗原结合结构域，以特异性识别所述靶细胞群或组织。
46.提供哺乳动物中抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括施用给所述哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID Ν0:24的氨基酸序列的CD3 ζ信号传导结构域，由此提供所述哺乳动物中的抗肿瘤免疫。
47.治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括施用给所述哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，由此治疗所述哺乳动物。
48.权利要求47所述的方法，其中所述细胞为自体T细胞。
49.权利要求47所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ES0-lTCR、MAGE A3TCR 和其任何组口 ο
50.治疗具有慢性淋巴细胞白血病的人的方法，所述方法包括施用给所述人基因工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域。
51.权利要求50所述的方法，其中所述人对至少一种化疗剂具有抗性。
52.权利要求50所述的方法，其中所述慢性淋巴细胞白血病为难治疗的CD19+白血病和淋巴瘤。
53.在诊断患有癌症的人中产生基因工程改造的T细胞的持续群的方法，所述方法包括施用给所述人基因工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，其中所述基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在所述人中持续至少一个月。
54.权利要求53所述的方法，其中所述基因工程改造的T细胞的持续群包括至少一种选自以下的细胞:施用给所述人的T细胞、施用给所述人的T细胞的子代和其组合。`
55.权利要求53所述的方法，其中所述基因工程改造的T细胞的持续群包括记忆T细胞。
56.权利要求53所述的方法，其中所述癌症为慢性淋巴细胞白血病。
57.权利要求56所述的方法，其中所述慢性淋巴细胞白血病为难治疗的CD19+白血病和淋巴瘤。
58.权利要求53所述的方法，其中所述基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在所述人中持续至少三个月。
59.权利要求53所述的方法，其中所述基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
60.权利要求56所述的方法，其中所述慢性淋巴细胞白血病被治疗。
61.在诊断患有癌症的人中扩展基因工程改造的T细胞群的方法，所述方法包括施用给所述人基因工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的⑶3 ζ信号传导结构域，其中所施用的基因工程改造的T细胞在所述人中产生子代T细胞群。
62.权利要求61所述的方法，其中所述人中的所述子代T细胞包括记忆T细胞。
63.权利要求61所述的方法，其中所述T细胞为自体T细胞。
64.权利要求61所述的方法，其中所述人对至少一种化疗剂具有抗性。
65.权利要求61所述的方法，其中所述癌症为慢性淋巴细胞白血病。
66.权利要求65所述的方法，其中所述慢性淋巴细胞白血病为难治疗的CD19+白血病和淋巴瘤。
67.权利要求61所述的方法，其中所述子代T细胞群在施用后，在所述人中持续至少三个月。
68.权利要求61所述的方法，其中所述子代T细胞群在施用后，在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
69.权利要求61所述的`方法，其中所述癌症被治疗。
【文档编号】A61K39/00GK103492406SQ201180067173
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2011年12月9日 优先权日:2010年12月9日
【发明者】C·H·琼, B·L·莱文, D·L·普特, M·D·卡罗斯, M·C·米洛内 申请人:宾夕法尼亚大学董事会