壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球及其制备方法，通过微囊成型装置，以壳聚糖为有机基质，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的前驱体；利用壳聚糖中的羟基和氨基基团对羟基磷灰石的原位结晶诱导作用，调控无机矿物在有机基质上原位非均匀成核结晶；同时复合了对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷，原位仿生制备壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。该复合微球是一种骨填充材料，制备过程简易，方法温和，材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，很有希望作为骨组织缺损用修复材料在临床上得到广泛应用。
【专利说明】壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料【技术领域】，具体涉及一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着生态环境的恶化，骨病损患者人数显著增多。通常骨组织的修复方法有:自体骨移植修复，异体骨移植修复和金属合金、高分子聚合物等各种人工骨替代材料移植修复。自体骨是骨缺损修复的最佳种植体，然其供应来源有限，异体、异种骨存在免疫排斥反应和较高的制样及处理成本；应用最广泛的金属材料，虽具有较强的机械强度，然而其成分和自然骨差异甚远，金属材料与宿主骨不能发生化学键合作用，生理环境长期对金属材料的腐蚀会造成金属离子向周围组织扩散，对人体造成毒副作用。
[0003]随着现代科学技术的发展，骨缺损修复研究开始往骨材料的成分和结构仿生方面发展。仿生合成技术模仿有机物调控无机物形成的机理，合成过程中先形成有机物的自组装体，使无机先驱物于自组装聚集体和溶液的相界面发生化学反应，在自组装体的模板作用下，形成具有特殊结构和功能的无机-有机复合体。人体骨由有机基质和无机盐构成，胶原蛋白、蛋白多糖是其主要的有机基质组分；无机盐则主要是低结晶度的纳米羟基磷灰石。而人工合成的羟基磷灰石其理化性质、结构与天然的类似，具有良好的骨传导性，填入骨缺损部位后能为骨基质的沉积和维持提供一个良好的骨床，引导周围骨组织增生，加快成骨过程，促进缺损骨的愈合，被视为骨缺损修复的理想材料。壳聚糖是一种有机大分子，溶于醋酸时带正电荷，不与体液发生反应并可被机体的溶菌酶生物降解，并能促进伤口愈合和骨的形成，具有无免疫原性、无毒性等特性。近年来，已有多位学者将壳聚糖与纳米羟基磷灰石复合制成多孔支架材料。文献(Li J., Chen Y P., Yin Y, Yao E, Yao K.Modulationof nano—hydroxyapatite size via formation on chitosan—gelatin network filmin situ[J].Biomaterials 2007 ；28:78 1-790)采用原位复合的方法合成纳米羟基磷灰石-壳聚糖-明胶复合材料，`结果表明，有机基质能引导纳米羟基磷灰石在膜材基体上原位结晶形成均匀分散的纳米颗粒。文献(Yang D., Jin Y, Zhou Y, et al.1n SituMineralization of Hydroxyapatite on Electrospun Chitosan—Based NanofibrousScaffolds [J].Macromol Biosci 2008 ;8:239-246)将壳聚糖、聚乙烯醇通过静电纺丝的方法制备多孔支架，再把支架材料浸泡到含有PAA的氯化钙和磷酸二氢钾溶液中，实现了纳米羟基磷灰石在有机基体上的原位结晶。体外细胞复合培养表明，该复合材料具有较好的生物相容性。这种原位复合的方法，可降低有机与无机界面的界面能，利用有机基质上的氨基、羟基基团，对纳米羟基磷灰石的结晶起着电位互补、绑定和螯合作用，引导纳米羟基磷灰石在有机基质上原位结晶形成均匀分散的纳米颗粒，克服了机械混合导致的纳米羟基磷灰石聚集问题。
[0004]目前较多研究是将羟基磷灰石与壳聚糖复合做成块状支架材料，也有出现将二者机械混合做成微球形状的文献报道，但尚未有报道将二者通过原位复合的方法制备微球。有关研究表明，颗粒的形态和结构能影响颗粒在人体内的活性，形状不规则的颗粒植材入人体会产生炎症等不良反应，因此，形状较规则的球状载药颗粒是作为植入药物载体的优先选择。淫羊藿苷为传统中药淫羊藿的茎叶提取物，研究发现，淫羊藿苷可使成骨细胞的生长曲线上移，S期细胞百分率升高，Gl期细胞百分率减少以及BMP-2蛋白表达量增加，从而促进骨的再生。这里，我们采用原位复合的方法，仿生构建壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球，利用纳米羟基磷灰石的大比表面积和高表面活性装载传统中药，以及壳聚糖对药物的包埋功能起到缓释药物的作用，作为骨填充材料进行局部定向释药，通过体外细胞复合培养评价体系初步探讨其用于骨修复的可行性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球及其制备方法。该方法的制备工艺条件温和，操作简捷，成本较低，制备得到的复合微球粒径可控，性能优越。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，是通过微囊成型装置(装置详见专利CN00218100.2)，以壳聚糖为有机基质，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的前驱体；利用壳聚糖中的羟基和氨基基团对羟基磷灰石的原位结晶诱导作用，调控无机矿物在有机基质上原位非均匀成核结晶；同时复合了对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷，原位仿生制备壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。包括以下步骤:
(1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，淫羊藿苷溶解于无水乙醇中；
(2)缓慢往壳聚糖的乙酸溶液中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，再加入淫羊藿苷的醇溶液，搅拌均匀；
(3)通过微囊成型装置将步骤(2)的混合液滴入凝胶浴中成型；将成型的微球连同凝胶浴一并置于水浴锅中反应，然后用去离子水反复洗涤至中性，移至冰箱预冷冻，再转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即制得壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。
[0007]复合微球包括以下质量百分数的组分:
淫羊藿苷0.01~0.05%
壳聚糖1~3%
羟基磷灰石0.5~2%。
[0008]各步骤的工艺参数如下:步骤(1)中乙酸溶液的体积分数为I~2% ;步骤(2)中可溶性钙盐溶液的浓度为1.5~3mol/L，可溶性磷酸盐溶液的浓度为0.6~1.8mol/L，二者间隔30min加入；淫羊藿苷的醇溶液的加入体积为2mL，搅拌时间为Ih ;步骤(3)中以质量分数为3~5%的NaOH溶液为凝胶浴；水浴温度为37°C，反应时间为8~12h。
[0009]所述的可溶性钙盐是硝酸钙、氯化钙中的一种；可溶性磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种。
[0010]无机相纳米羟基磷灰石的前驱体中Ca/P的摩尔比为η (Ca2+): n (PO43O=L 67:1。
[0011]本发明的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法可以简单概括为以下几个过程:(I)有机基质与无机离子的界面识别，形成有效的成核位点；(2)药物分子在有机基质上的吸附；(3)复合微球的成型；(4)有机基质调控无机离子原位成核结晶自组装成纳米粒；(5)复合微球的后处理。
[0012]本发明的显著优点在于:壳聚糖是一种带正电荷的天然多糖，不与体液发生反应并可被机体的溶菌酶生物降解，并能促进伤口愈合和骨的形成，具有无免疫原性、无毒性等特性。加入无机相前驱体可溶性钙盐和可溶性磷酸盐后，壳聚糖分子上的氨基、羟基能与无机钙离子、磷酸根离子，通过离子配位、静电吸引以及氢键相互结合，为后续无机晶体的定位生长提供了有效的成核位点；最后，模仿骨组织形成过程中无机钙磷矿物在有机基质生物大分子调控下原位析晶过程，采用原位仿生法制备一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。
[0013]相对于其他骨修复材料有以下优点:
(O复合微球中的各组分具有较好的生物相容性；
(2)采用原位仿生法和纳米自组装技术，使得无机相在微球上实现了纳米级分散；
(3)复合微球独特的表面性能(比表面积大、表面能高、表面粗糙度及表面润湿性增加)有利于生长因子的吸附，促进细胞的粘附、增殖、分化；
(4)通过改变电压大小，可得到具有不同粒径的复合微球；
(5)体外微球细胞复合培养结果表明，该复合材料具有良好的生物相容性；
(6)该复合微球的制备工艺较简单,操作方便,成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是壳聚糖-羟基磷灰石微球的局部SEM扫描电子显微镜图。
`[0015]图2是壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的局部SEM扫描电子显微镜图。
[0016]图3是壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的SEM扫描电子显微镜图。
[0017]图4是壳壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的XRD图。
[0018]图5-6是壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球与成骨细胞复合培养第
3、5天倒置荧光显微镜图片。
[0019]图7是壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球与成骨细胞复合培养的Hoechst33258荧光染色图片。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
1)配制1.5mol/L的可溶性钙盐溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为2%、0.01% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌2 h，理论形成HAP的质量配比为1% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入3%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中8h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，_20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0021]实施例2
1)配制2mol/L的可溶性钙盐溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为1%、0.03% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌3 h，理论形成HAP的质量配比为0.5%。
[0022]4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入3% NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中10h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0023]实施例3
1)配制3mol/L的可溶性钙盐溶液，0.6mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为2%、0.05% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，`持续搅拌4 h,理论形成HAP的质量配比为0.8% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中8h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，_20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0024]实施例4
1)配制2mol/L的可溶性钙盐溶液，1.5mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为1%、0.05% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌3 h，理论形成HAP的质量配比为0.5% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中12h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0025]实施例5
1)配制3mol/L的可溶性钙盐溶液，0.9mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为3%、0.01% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌4 h，理论形成HAP的质量配比为2% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4% NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中8h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，_20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0026]实施例6
1)配制2mol/L的可溶性钙盐溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为3%、0.03% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌3.5 h，理论形成HAP的质量配比为1.5% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中9h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，_20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0027]实施例7
1)配制2.5mol/L的可溶性钙盐溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为2%、0.05% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；；` 3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌6 h，理论形成HAP的质量配比为1% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中10h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0028]实施例8
1)配制3mol/L的可溶性钙盐溶液，0.6mol/L的可溶性磷酸盐溶液；按质量百分比计壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为2%、0.04% ；
2)将所述配比的壳聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于无水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例将一定量的可溶性钙盐溶液，可溶性磷酸盐溶液分别加入到上述混合液中，持续搅拌5 h，理论形成HAP的质量配比为1.2% ；
4)将淫羊藿苷醇溶液缓慢地加入上述溶液中，搅拌使其充分混合均匀；
5)将上述混合液通过微囊成型装置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，连同凝胶浴一起置入37°C水浴锅中12h，进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-20°C预冷冻后进行冷冻干燥获得产品。
[0029]将所制备的一系列微球进行结构和性能表征，并采用乳鼠成骨细胞建立复合支架的体外评价模型，考察壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的细胞学特性。
[0030]结论:比较图1与图2，可以发现壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球除了短棒状的纳米羟基磷灰石外还有一些颗粒聚集成小堆状，可能是由于少量的淫羊藿苷晶体沉积在微球表面造成的。图3可看出微球形貌比较圆整；图4可以发现，(002)，(211)和(300)晶面的衍射峰为羟基磷灰石的主要衍射峰，说明复合微球中原位生成了纳米羟基磷灰石。从图5，6中可以看出，细胞在微球上长势良好。复合微球在加入细胞悬液数天后，细胞长满孔板底部并开始向微球攀爬生长，随着天数的增加，微球外层逐渐被成骨细胞包裹，微球表面上的细胞呈梭形、三角形或多角形，有伪足伸出，轮廓清晰，细胞胞质透明，表明在微球-细胞联合培养过程中，细胞保持着良好的生长状态。图7为微球上的活细胞在波长为46Inm处发出蓝靛色荧光图像。蓝靛色圆点即细胞，从图中可以看出，细胞在微球上长势良好。这些结果都表明了原位复合制备的复合微球具有良好的生物相容性，具有作为骨填充材料进行局部定向释药的潜力。
[0031]以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范`围。
【权利要求】
1.一种壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:通过微囊成型装置，以壳聚糖为有机基质，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的前驱体；利用壳聚糖中的羟基和氨基基团对羟基磷灰石的原位结晶诱导作用，调控无机矿物在有机基质上原位非均匀成核结晶；同时复合了对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷，原位仿生制备壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，淫羊藿苷溶解于无水乙醇中； (2)缓慢往壳聚糖的乙酸溶液中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，再加入淫羊藿苷的醇溶液，搅拌均匀； (3)通过微囊成型装置将步骤(2)的混合液滴入凝胶浴中成型；将成型的微球连同凝胶浴一并置于水浴锅中反应，然后用去离子水反复洗涤至中性，移至冰箱预冷冻，再转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即制得壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:复合微球包括以下质量百分数的组分: 淫羊藿苷0.01~0.05%壳聚糖I~3% 羟基磷灰石0.5~2%。
4.根据权利要求2所述的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:各步骤的工艺参数如下: 步骤(1)中乙酸溶液的体积分数为I~2% ； 步骤(2)中可溶性钙盐溶液的浓度为1.5~3!1101/1，可溶性磷酸盐溶液的浓度为0.6~1.8mol/L，二者间隔30min加入；淫羊藿苷的醇溶液的加入体积为2mL，搅拌时间为Ih ； 步骤(3)中以质量分数为3~5%的NaOH溶液为凝胶浴；水浴温度为37°C，反应时间为8 ~12h。
5.根据权利要求2所述的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:所述的可溶性钙盐是硝酸钙、氯化钙中的一种；可溶性磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球的制备方法，其特征在于:无机相纳米羟基磷灰石的前驱体中Ca/P的摩尔比为n (Ca2+): η (PO广)=1.67:1。
7.—种如权利要求1所述的方法制得的壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球。
【文档编号】A61L27/54GK103495210SQ201310442025
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】陈景帝, 张惠, 张玉珏, 王自豪, 张其清 申请人:福州大学