一种含自体基质细胞的生物美容制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种含自体基质细胞的生物美容制剂的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取自体血浆和培养获得自体基质细胞，将自体基质细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂，同时提供了由自体基质细胞和自体血浆制备成生物美容制剂，并添加生长因子和抗氧化因子，可用于皮肤除皱，粉刺瘢痕修复，烧伤、外伤和挛缩疤痕以及抗衰老等修复改善。
【专利说明】一种含自体基质细胞的生物美容制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备自体生物美容制剂的方法以及通过所述方法获得的自体生物美容制剂。特别地，本发明涉及采用自体外周血来源的血清和基质细胞，同时可添加生长因子和抗氧化分子，以及通过所述方法获得的生物美容制剂。本发明的生物美容制剂可用于对皮肤具有除皱，粉刺瘢痕修复，烧伤、外伤和挛缩疤痕以及抗衰老等修复改善。
【背景技术】
[0002]目前，市场上生物美容产品各式各样，已经形成人们普遍接受的大众产品。绝大多数生物美容产品使用的主要为化学试剂制备成的乳胶、乳霜、乳液等的美容产品，其中可能会添加各种营养成分，如深海鱼子、酢液竹炭、蛇毒、蜂毒、胎盘素和激素等，对皮肤具有修护、控油、抗氧化和储水及保水等能力，形成各种的生物美容产品。
[0003]目前市场上生物美容制剂对皮肤美容的作用是非常有限，一些化学试剂的存在对皮肤可能产生损伤和过敏作用，尽管其加入了一些营养成分，但因存放条件都是使得这些营养成分都已经部分或完全失效了。另外生物美容产品使用方法也大大影响其功效。
[0004]本发明利用分子生物学和细胞生物学技术，配合皮肤自我更新功能，有效令肌底细胞间产生相互作用并进行结合。本发明的自体生物美容制剂是利用自体血浆和基质细胞，添加各类生长因子以及抗氧化因子制备成的自体美容制剂。在生长因子激活之下，促使细胞苏醒及分裂，并以标靶方式修复病变和衰老细胞，从而形成保护膜，即时提升综合御肌能力，令肌肤恢复最佳状态，恢复年轻活力。
[0005]综上，为了对皮肤产生更好地修复、再生、抗氧化及祛皱等作用，本发明利用自体来源血清和基质细胞的生物学作用，生物学有效期内及时使用，将对皮肤产生最佳的美容作用。
【发明内容】
[0006]为了对皮肤产生更好地修复、再生、抗氧化及祛皱等作用，本发明利用自体来源血浆和基质细胞的生物学作用，可以高效产生皮肤美容作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过采集抗凝外周血获得自体血浆，抗凝外周血来源单个核细胞培养获得基质细胞。自体血浆富含血小板和富含各种生长因子，即血小板衍生生长因子(platelet-derived groth factor,F1DGF)、转化生长因子-β I, β 2 (transforming growthfactor- β I, β 2, TGF-β I, β 2)、类膜岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、上皮细胞生长因子(epithelial cell growth factor,ECGF)等。自体血浆进入真皮浅层后，可刺激大量胶原蛋白、弹性纤维、胶质等的产生，将促使组织再生，对凹陷性疤痕、组织缺失有特殊功效，达到强力祛皱抗衰目的。
[0007]本发明中基质细胞是器官中结缔组织细胞，起到为器官中实质细胞提供支持和营养的作用，成纤维细胞、炎症细胞、免疫细胞以及周皮细胞都是常见的基质细胞类型。基质细胞像是器官发育的“土壤”，辅助重建造血和调节免疫功能的作用。基质细胞中富含的基质细胞衍生因子_1 (stromal cell derived factorl, SDF-1)是CXC亚家族的一种趋化因子，在干/祖细胞归巢等方面发挥了重要的作用，主要促使内皮祖细胞沿SDF-1的浓度梯度发生黏附、增殖、迁移并抑制其凋亡，从而改善内皮祖细胞功能。基质细胞将在皮肤美容中发挥调节免疫作用，促使皮肤内干细胞增殖分化，修复受损真皮细胞或表皮细胞等，改善皮肤供血延缓衰老。
[0008]本发明提供了一种自体生物美容制剂的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取自体血浆和自体基质细胞,制备成自体的生物美容制剂。
[0009]本发明提供了的自体血浆由抽取人自体抗凝外周血，经离心去除红细胞和部分白细胞后获得的富含血小板血浆，将用于制备自体生物美容制剂。
[0010]优选地，自体抗凝外周血使用EDTA作为抗凝剂。
[0011]本发明提供了的自体基质细胞由离心获取自体血浆后的血细胞，经淋巴分离液密度梯度离心获得单个核细胞，体外培养获得基质细胞，将添加到自体生物美容制剂中。获得自体基质细胞经流式细胞仪检测基质细胞高表达SDF1，阳性率大于80%以上。
[0012]本发明还提供了一种自体生物美容制剂，所述自体生物美容制剂包括含有自体血浆和自体基质细胞，制备成自体的生物美容制剂，其中，自体生物美容制剂可加入生长因子和/或抗氧化分子，即生长因子为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和角蛋白18等；抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等。
[0013]本发明还提供了一种自体生物美容的制剂，其中，该制剂主要由如下成分组成:
[0014]I) 5ml自体血衆；
[0015]2) lml6 X 16自体基质细胞；
[0016]3) 200ng/ml生长因子和/或抗氧化分子；
[0017]装入1ml无菌的塑料针管中，共6ml，可用盖子密封包装，形成生物美容制剂。
[0018]该生物美容制剂保存在4°C条件下，保质期为48小时。
[0019]根据本发明所述的自体生物美容制剂，其特征在于，所述自体生物美容制剂，优选地生长因子，即生长因子为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和角蛋白18等，含有一种或一种以上。
[0020]所述自体生物美容制剂，优选地抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等，含有一种或一种以上。
[0021]通过本发明的方法，通过获取的自体血浆和自体基质细胞，并含有一种或多种生长因子，制备成的自体生物美容制剂。由本发明提供的方法得到含有自体血浆和自体基质细胞或生长因子的美容制剂，能够对皮肤除皱，粉刺瘢痕修复，烧伤、外伤和挛缩疤痕以及抗衰老等修复改善。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1表示由实施例1所制备的基质细胞检测SDFl表型的细胞流式图。
[0023]图2表示I名女性经由实施例3所制备生物美容制剂I个疗程美容前后脸部粉刺瘢痕改善的图片。
【具体实施方式】
[0024]本发明提供了一种自体生物美容制剂的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取自体血浆和自体基质细胞,制备成美容制剂。自体血浆由抽取人自体抗凝外周血,经离心去除红细胞和部分白细胞后获得的富含血小板血浆；自体基质细胞由抽取人自体抗凝外周血，经淋巴分离液密度梯度离心获得单个核细胞，体外培养获得基质细胞，两者将添加到自体生物美容制剂中。
[0025]自体血浆获取是由抽取人自体60ml EDTA抗凝外周血，经1500转每分钟速度离心
10分钟，获得的25-30ml自体血浆，放置冰箱4°C存放备用。
[0026]自体基质细胞由离心获取自体血浆后的30_35ml血细胞，用I倍体积的lXPBS(pH值7.4)稀释后经淋巴分离液密度梯度离心获得单个核细胞，用基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，按每1-3X 16/细胞加入到75cm2培养瓶中15ml，于37°C，5% CO2培养箱中生长48小时。
[0027]48小时后对培养基质细胞换液，用1ml移液管吸弃培养液，加入1ml新鲜的基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，75cm2培养瓶继续放置37°C，5% CO2培养箱中生长72小时。
[0028]72小时后基质细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用1ml移液管吸弃培养液，取5mlI XPBS (pH值为7.4)洗涤I次培养瓶底，加入2ml0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01 % EDTA)到培养瓶中，放置37°C，5% CO2培养箱中消化2_3分钟。消化后加入200微升胎牛血清终止消化，再加入5ml生理盐水，用1ml移液管吹打，吸至50ml离心管中，用5ml的生理盐水洗涤一次，同样加入到50ml离心管中，1200转每分钟离心5分钟收集基质细胞。
[0029]离心后用Iml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20mg/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，可进行细胞传代培养，即I瓶75cm2培养瓶的细胞扩至2瓶75cm2培养瓶中进行培养，每瓶加入15ml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，于37°C，5%CO2培养箱中生长48小时后换液，继续培养72小时后基质细胞生长融合达到80%以上，可以继续传代培养3代。
[0030]传代培养3代后用胰酶进行消化并用生理盐水洗涤2次，计数后即获得基质细胞，放置冰箱4°C存放备用。另外部分基质细胞将加入冻存液，将lml6X 106/ml基质细胞放入冻存管中冻存。
[0031]获得IX 16基质细胞分两组，分别加入鼠抗人SDFl单克隆抗体和兔抗鼠IgGl-PE (美国B1Legend公司)，避光染色30分钟，用Imll XPBS (pH值为7.4)洗涤2次后，用流式细胞仪(美国BD公司FACSAria)检测获得的基质细胞表型变化。原代培养和传代培养获得的自体基质细胞经流式细胞仪检测基质细胞均高表达SDF1，阳性率大于80%以上。
[0032]作为本发明制造方法中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、225cm2细胞培养瓶等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养瓶。
[0033]本发明的制造方法中对基质细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50%胎牛血清、40%细胞培养液和10% 二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为基质细胞培养液。复苏后培养的基质细胞仍高表达SDF-1。
[0034]在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至10容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5% (体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血衆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0035]优选地，本发明可加入生长因子和抗氧化分子，即生长因子为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和角蛋白18等；抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等。自体生物美容制剂中添加这些营养因子还具有保护基质细胞活率或生物学功能的作用，能使得自体生物美容制剂保质期增长。
[0036]本发明还提供了一种自体生物美容制剂，其中，该制剂主要由如下成分组成:
[0037]l)5ml自体血浆；
[0038]2) lml6 X 16自体基质细胞；
[0039]3) 200ng/ml生长因子和/或抗氧化分子；
[0040]装入1ml无菌的塑料针管中，共6ml，可用盖子密封包装，形成生物美容制剂。
[0041]该生物美容制剂保存在4°C条件下，保质期为48小时。
[0042]根据本发明所述的自体生物美容制剂，其特征在于，所述自体生物美容制剂，优选地生长因子，即生长因子为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和角蛋白18等，含有一种或一种以上。
[0043]根据本发明所述的自体生物美容制剂，其特征在于，所述自体生物美容制剂，优选地抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等，含有一种或一种以上。
[0044]本发明提供了含有自体血浆和自体基质细胞或营养因子的美容制剂，能够对皮肤具有祛皱、抗氧化、皮肤修复、除斑和抗衰老。本发明还提供了该美容制剂使用方法，即美容针局部注射，选择人皱纹、瘢痕、色斑等部位皮肤真皮层注射，为皮肤产生填充、祛皱、抗氧化、除斑等功效。具体方法如下:美容者使用洁面乳清洗面部皮肤，晾干后脸部涂上皮肤外用麻醉剂，根据麻醉剂使用要求，一般约15分钟麻醉剂起效。将装有本发明生物美容制剂的塑料注射器安装上20G有侧开口的美容针，取面部皱纹和瘢痕等部位进行真皮层注射，缓慢撤出美容针后用无菌棉棒轻轻压住2-5分钟，鱼尾纹、鼻背纹、眼周细纹和嘴角皱纹等小皱纹注射0.2-0.5ml该生物美容制剂，额头纹、川字纹、法令纹和颈纹等大皱纹注射
0.5-lml该生物美容制剂，注射完毕后冰覆20-40分钟。
[0045]美容者本发明生物美容制剂处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，一般需间隔15天后连续使用4次，可达到更佳的医学美容效果，对皮肤可以出去微小皱纹、粉刺瘢痕减少、美白换肤以及抗氧化的作用。
[0046]以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
[0047]制备例I人自体血浆的制备
[0048]用1mlEDTA抗凝采血管(美国BD公司)，抽取人10ml抗凝经脉血，10只1ml抗凝管经1500转每分钟速度离心5分钟，用Iml枪头吸取离心后上层血浆置50ml离心管中，获得40ml自体血浆，放置冰箱4°C存放备用。
[0049]制备例2人自体基质细胞获取
[0050]取制备例I中离心获取自体血浆后的60ml血细胞，用60ml I XPBS (pH值为7.4)稀释，加入到淋巴分离液中经1500rpm密度梯度离心25min，获得单个核细胞，用a -MEM培养基(含10%自体血浆和20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，按3X 16细胞/ml，加入到75cm2培养瓶中15ml，于37°C，5% CO2培养箱中生长48小时。
[0051]48小时后对培养基质细胞换液，用1ml移液管吸弃培养液，加入1ml新鲜的a -MEM培养基(含10%自体血浆和20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，75cm2培养瓶继续放置37°C，5% CO2培养箱中生长72小时。
[0052]72小时后基质细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用1ml移液管吸弃培养液，取5mlI XPBS (pH值为7.4)洗涤I次培养瓶底，加入2ml0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01% EDTA)到培养瓶中，放置37°C，5% CO2培养箱中消化2_3分钟。消化后加入200微升胎牛血清终止消化，再加入5ml生理盐水，用1ml移液管吹打，吸至50ml离心管中，用5ml的生理盐水洗涤I次，同样加入到50ml离心管中，1200转每分钟离心5分钟收集基质细胞。
[0053]离心后用Iml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，可进行细胞传代培养，即I瓶75cm2培养瓶的细胞扩至2瓶75cm2培养瓶中进行培养，每瓶加入15ml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，于37°C，5%CO2培养箱中生长48小时后换液，继续培养72小时后基质细胞生长融合达到80%以上，可以继续传代培养3代。
[0054]传代培养3代后用胰酶进行消化并用生理盐水洗涤2次，计数后即获得基质细胞，放置冰箱4°C存放备用。另外部分基质细胞将加入冻存液，将lml6X 106/ml基质细胞放入冻存管中冻存。
[0055]传代培养3代获得的I X 16基质细胞分两组，分别加入鼠抗人SDFl单克隆抗体和兔抗鼠IgGl-PE (美国B1Legend公司)，避光染色30分钟，用Imll XPBS (pH值为7.4)洗涤2次后，用流式细胞仪(美国BD公司FACSAria)检测获得的基质细胞表型变化。图1检测结果显示所制备的基质细胞表型为SDFl阳性率为81.5%，表明基质细胞高表达SDF-1。
[0056]实施例3自体基质细胞生物美容制剂的制备
[0057]取制备好的自体血衆5ml,加入制备好的Iml基质细胞液,可添加200ng/ml生长因子即表皮生长因子、碱性成纤维生长因子或角蛋白18等中的一种，以及200ng/ml抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等中的一种，形成自体美容制剂，装入1ml无菌可密封的针管中，放置冰箱4°C冷藏中存放。
[0058]实施例4自体生物美容制剂美容
[0059]医学美容者躺卧在手术台上，使用洁面乳进行面部清洁，清水擦洗干净；先用皮肤麻醉剂-达克罗宁乳膏对面部进行处理，包括眼皮、鼻梁和上嘴唇等部位，进行局部麻醉，大约15分钟左右起效，即可进行美容针真皮层注射。
[0060]选择医学美容者小皱纹(如鱼尾纹、鼻背纹、眼周细纹和嘴角皱纹等)和大皱纹(如额头纹、川字纹、法令纹和颈纹等)等部位，使用有侧开口的20G美容针进行皮下真皮层注射，小皱纹用长度38mm的美容针注射0.5ml以及大皱纹用长度60mm的美容针注射Iml的实施例3中制备的含自体基质细胞生物美容制剂。
[0061]注射完之后缓慢撤出美容针，用无菌棉棒轻轻压住2-5分钟，完毕后冰覆40分钟。美容者本发明生物美容制剂处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，间隔15天后连续使用4次，作为一个疗程。
[0062]图2中是一名45岁女性经生物美容制剂4次美容后脸部的图片，发现该女性美容一个疗程后脸部粉刺瘢痕得到很好的改善，粉刺瘢痕得到明显减少，皮肤变得光滑细腻。
【权利要求】
1.一种含自体基质细胞的生物美容制剂的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取自体血浆和自体基质细胞,将自体基质细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂，并添加了生长因子和抗氧化因子。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述自体血浆由抽取人自体60mlEDTA抗凝外周血，经1500转每分钟速度离心10分钟，获得的25-30ml自体血浆，放置冰箱4°C存放备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自体基质细胞由离心获取自体血浆后的30-35ml血细胞，经淋巴分离液密度梯度离心获得单个核细胞，用基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，按1-3X 16细胞/ml加入到75cm2培养瓶中15ml，于37°C,5% CO2培养箱中生长48小时。 48小时后对培养基质细胞换液，用1ml移液管吸弃培养液，加入1ml新鲜的基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，75cm2培养瓶继续放置37°C，5% CO2培养箱中生长72小时。 72小时后基质细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用1ml移液管吸弃培养液，取5mlI XPBS (pH值为7.4)洗涤I次培养瓶底，加入2ml0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01% EDTA)到培养瓶中，放置37°C，5% CO2培养箱中消化2_3分钟。消化后加入200微升胎牛血清终止消化，再加入5ml生理盐水，用1ml移液管吹打，吸至50ml离心管中，用5ml的生理盐水洗涤一次，同样加入到50ml离心管中，1200转每分钟离心5分钟收集基质细胞。 离心后用Iml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)重悬，可进行细胞传代培养，即I瓶75cm2培养瓶的细胞扩至2瓶75cm2培养瓶中进行培养，每瓶加入15ml基质细胞无血清完全培养基(含10%无血清营养添加物和10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，于37°C，5% CO2培养箱中生长48小时后换液，继续培养72小时后基质细胞生长融合达到80%以上，可以继续传代培养3代。 传代培养3代后用胰酶进行消化并用生理盐水洗涤2次，计数后即获得基质细胞，放置冰箱4°C存放备用。另外部分基质细胞将加入冻存液，将lml6 X 106/ml基质细胞放入冻存管中冻存。
4.根据权利要求1和3所述的方法，其特征在于，所述自体基质细胞加入鼠抗人SDFl单克隆抗体和兔抗鼠IgGl-PE，染色后经流式细胞仪检测基质细胞高表达，SDFl阳性率大于80%以上。
5.—种含自体基质细胞的生物美容制剂，其中，该制剂主要由如下成分组成: 1)5ml自体血衆； 2)lml6X106自体基质细胞； 3)200ng/ml生长因子和/或抗氧化分子； 装入1ml无菌的塑料针管中，共6ml,可用盖子密封包装,形成生物美容制剂。 该生物美容制剂保存在4°C条件下，保质期为48小时。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述自体生物美容制剂，优选地生长因子，即生长因子为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和角蛋白18等，含有一种或一种以上。 所述自体生物美容制剂，优选地抗氧化分子为超氧化歧化酶、胎盘提取精华素和银杏叶提取液等，含有一种或一种以上。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的生物美容制剂可用于皮肤除皱，粉刺瘢痕修复，烧伤、外伤和挛缩疤痕以及抗衰老等修复改善。
【文档编号】A61K8/97GK104173252SQ201410363877
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】蔡贤芬 申请人:蔡贤芬