一种沙苑子乙醇提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药领域，尤其涉及一种沙苑子乙醇提取物及其制备方法和应用

背景技术：

目前心血管疾病成为世界各地的主要杀手之一。世界卫生组织估计，到2020年世界各地将有近2500万的人因心血管病死亡。大量研究表明，心脑血管疾病的主要病理基础是动脉粥样硬化，而高胆固醇血症是常见而多发的代谢与内分泌疾病之一，是导致动脉粥样硬化及心脑血管疾病的重要危险因素之一，如发生在冠状动脉和脑动脉就会引起心脏和大脑供血、供氧不足，引发心绞痛、心肌梗死或脑中风。而且与糖尿病、脂肪肝和肾病等关系十分密切，严重威胁人们的健康和生命。临床和实验研究已证明高胆固醇饮食消费是导致由动脉粥样硬化、高脂血症，以及脂质代谢紊乱的发展形成的心血管疾病的主要因素之一。

近年来，对于高胆固醇血症的治疗及预防愈来愈受到人们的重视，目前的治疗以药物治疗为主。临床上可供选用以降低血浆胆固醇为主的调脂药物有：胆汁酸鳌合剂，烟酸及其衍生物、HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)等。但是这些西药长期服用可出现停药反跳、消化道症状、肝肾功能损害、横纹肌溶解症等不良反应。而中药具有调脂作用温和、疗效较持久、不良反应较少和药物食品化等一系列优点，而日益受到广泛关注。

沙苑子为补益肝肾的传统中药，主要含有黄酮类、三萜苷类、有机酸、氨基酸、多肽、蛋白质、鞣质、甾醇等成分，具有抗肝损伤、调节血脂、降低血压、抑制血小板聚集、改善血液流变学指标、增强免疫功能、抗肿瘤、抗炎及 镇痛等作用。目前，对于沙苑子相关的研究主要集中在将沙苑子黄酮类部位或者和其它中药组成的复方制剂方面，并没有针对单味沙苑子乙醇提取物作为研究对象。

此外，中药作为传统药物，其质量控制一直成为制约其推广应用的瓶颈。有效的获得质量可控的沙苑子乙醇提取物，对中药的推进更是具有深入的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种沙苑子乙醇提取物，旨在提供一种能够用于预防或治疗高血脂和脂肪肝的沙苑子乙醇提取物。

本发明的另一目的在于提供一种沙苑子乙醇提取物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供沙苑子乙醇提取物的应用。

本发明是这样实现的，一种沙苑子乙醇提取物，所述沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为65-75％的乙醇中的提取物。

以及，一种沙苑子乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：

采集沙苑子，依次进行除杂处理、粉碎处理后得到粉碎物料；

使用体积百分浓度为65-75％的乙醇对所述粉碎物料进行加热回流提取，获得乙醇提取液；

将所述乙醇提取液进行浓缩除去溶剂。

以及，沙苑子乙醇提取物在制备防治或治疗高血脂疾病药物中的应用。

沙苑子乙醇提取物在制备防治或治疗脂肪肝疾病药物中的应用。

本发明提供的沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为65-75％的乙醇中的提取物，具有降低高胆固醇水平、舒张血管、减少脂肪肝脂质含量、减少脂肪肝脂滴的作用。

本发明提供的沙苑子乙醇提取物的制备方法，工艺简单可控，提取效率高，且条件温和、活性成分不易被破坏，易于实现产业化。

本发明提供的苑子乙醇提取物在制备防治或治疗高血脂以及脂肪肝疾病药 物中的应用，为高血脂以及脂肪肝疾病的预防治疗指明了新的方向。

附图说明

图1是本发明实施例提供的沙苑子乙醇提取物对DPPH自由基清除百分率(SR％)；

图2是本发明实施例提供的沙苑子乙醇提取物各化学成分的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱图；

图3是本发明实施例4提供的沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的肝组织抗氧化酶活性和MDA的作用图；

图4是本发明实施例5提供的沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的大鼠肝脏外观及其病理切片染色后的显微图片；

图5是本发明实施例5提供的沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠肝脏的PEPCK、LDLR、PPAR-α蛋白水平变化的作用图；

图6是本发明实施例6提供的沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的血管舒张作用图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种沙苑子乙醇提取物，所述沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为65-75％的乙醇中的提取物。

本发明实施例中，为了获得活性成分更集中、防治或治疗高血脂以及脂肪肝活性更好的沙苑子乙醇提取物，作为优选实施例，所述沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为70％的乙醇中的提取物。

具体的，本发明实施例所述沙苑子乙醇提取物中，包括酚类化合物和沙苑 子苷。本发明实施例沙苑子乙醇提取物作为唯一活性成分，具有降低高胆固醇水平、舒张血管、减少脂肪肝脂质含量、减少脂肪肝脂滴的作用。

为了有效保证所述沙苑子乙醇提取物在防治或治疗高血脂以及脂肪肝疾病中的应用，作为一个优选实施例，以所述沙苑子乙醇提取物的重量百分含量为100％计，所述酚类化合物的重量百分含量≥30％。作为另一个优选实施例，以所述沙苑子乙醇提取物的重量百分含量为100％计，所述沙苑子苷的重量百分含量为≥1.5％。

作为优选实施例，所述沙苑子乙醇提取物中总多酚含量为33.909±0.693mg GAE/g。所述总多酚的含量可通过Folin-Ciocalteu比色法测得，其结果如附图1所示。

作为具体实施例，所述沙苑子乙醇提取物中，含有如下化学组分，精氨酸(L-arginine)、谷氨酸(L-glutamic acid)、天门冬氨酸(L-aspartic acid)；苑子苷(rhamnocitrin-3,4'-O-diglucoside)、沙苑子苷A(myricetin 3,4'-diglucoside)、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷(calycosin-7-O-glucopyranoside)、异槲皮苷(quercetin 3-O-glucopyranoside)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-O-rutinoside)、杨梅素-3/3'-O-葡萄糖苷(myricetin-3/3’-O-glucopyranoside)、鼠李柠檬素-3-O-葡萄糖苷(rhamnocitrin-3-O-glucopyranoside)、沙苑子新苷(neocomplanoside)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、芒柄花素(formononetin)等。对所述沙苑子乙醇提取物进行化学成分鉴定可采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-QTOF/MS)实现，所述各化学成分的保留时间、质谱数据如表1所示，其中“*”标示的样品采用标准品鉴定。所述各化学成分的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱图如附图2所示。

表1

*经标准品核对

本发明实施例提供的沙苑子乙醇提取物，为沙苑子在体积百分浓度为65-75％、特别优选为体积百分浓度为70％的乙醇中的提取物，所述沙苑子乙醇提取物中含有防治或治疗高血脂以及脂肪肝的活性成分，且该部分提取物作为唯一活性成分，具有降低高胆固醇水平、舒张血管、减少脂肪肝脂质含量、减少脂肪肝脂滴的作用。此外，本发明实施例将所述沙苑子乙醇提取物作为唯一活性成分，与常规的含有沙苑子的复方中药相比，用于制备药物时，所述沙苑 子乙醇提取物的质量更溶液控制，从而便于中药现代化的推广应用。

本发明实施例所述沙苑子乙醇提取物优选通过下述制备方法获得，当然，应当理解，也可以通过其他方法获得。

相应地，本发明实施例提供了一种沙苑子乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：

S01.采集沙苑子，依次进行除杂处理、粉碎处理后得到粉碎物料；

S02.使用体积百分浓度为65-75％的乙醇对所述粉碎物料进行加热回流提取，获得乙醇提取液；

S03.将所述乙醇提取液进行浓缩除去溶剂。

具体的，上述步骤S01中，对所述沙苑子进行除杂处理，可通过常规方法实现，只要使得所述沙苑子洁净度不影响所述沙苑子进行后续活性成分的提取即可。

作为优选实施例，为了充分提取所述沙苑子乙醇提纯的活性成分，并有效提高提取效率，所述粉碎处理后的沙苑子具有一定的粒度要求，具体的，所述粉碎处理后的沙苑子的粒度大小能过20目筛。因此，作为具体实施例，所述沙苑子乙醇提取物的制备方法，还包括将经过所述粉碎处理获得的粉碎物料过20目筛处理。

上述步骤S02中，采用乙醇对所述沙苑子进行提取，所述乙醇的用量为所述沙苑子重量的2.5-3.5倍，更优选为，所述乙醇的用量为所述沙苑子重量的4倍。为了进一步集中提取活性组分，并提高活性组分的提取率，所述乙醇的体积百分浓度进一步优选为70％。

为了提高提取效率，可以进一步对粉碎的所述沙苑子进行室温浸泡处理。作为优选实施例，所述浸泡时间为30-60分钟。

本发明实施例所述沙苑子乙醇提取物的制备方法中，所述加热回流提取是关键步骤，所述加热回流处理直接关系着所述沙苑子化学成分的溶出，更重要的是，关系到其中的活性成分是否在不被破坏的前提下溶出。因此，为了获得 活性组分不被破坏且活性组分提取率高的效果，所述加热回流处理的加热温度为70-85℃，加热时间为50-70分钟。进一步的，所述加热回流处理的加热温度为80℃，加热时间为60分钟。

为了进一步提高所述沙苑子乙醇提取物的提取率，可以视情况将提取后的沙苑子滤渣采用上述条件再行提取1-3次，并将提取后的滤液进行合并。

上述步骤S03中，将所述乙醇提取液进行浓缩除去溶剂，可以采用减压蒸馏的方式实现。作为优选实施例，所述减压蒸馏采用在温度为50-70℃的条件下水浴实现。

作为另一个优选实施例，将去除溶剂后的沙苑子乙醇提取物进行冻干处理后可以获得所述沙苑子乙醇提取物的粉末，便于保存。所述冻干处理的温度为≤-20℃。

本发明实施例提供的沙苑子乙醇提取物的制备方法，工艺简单可控，提取效率高，可以使得所述沙苑子乙醇提取物的提取率在15％以上，且条件温和、活性成分不易被破坏，易于实现产业化。

以及，本发明实施例提供了所述沙苑子乙醇提取物在医药领域的应用。

具体的，所述沙苑子乙醇提取物在制备防治或治疗高血脂疾病药物中的应用。

以及，所述沙苑子乙醇提取物在制备防治或治疗脂肪肝疾病药物中的应用。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种沙苑子乙醇提取物，所述沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为65-75％的乙醇中的提取物。

所述沙苑子乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：

S11.采集沙苑子，依次进行除杂处理、粉碎处理后，过20目筛得到粉碎物料；

S12.使用3倍体积百分浓度为65-75％的乙醇对所述粉碎物料进行加热回 流提取，加热回流温度为80℃，加热时间1小时，获得乙醇提取液；

S13.将所述乙醇提取液进行减压浓缩除去溶剂、冻干处理。

实施例2

一种沙苑子乙醇提取物，所述沙苑子乙醇提取物为沙苑子在体积百分浓度为70％的乙醇中的提取物。以所述沙苑子乙醇提取物的重量百分含量为100％计，所述酚类化合物的重量百分含量≥30％，所述沙苑子苷的重量百分含量为≥1.5％。

所述沙苑子乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：

S21.采集沙苑子，依次进行除杂处理、粉碎处理后，过20目筛得到粉碎物料；

S22.使用3倍体积百分浓度为70％的乙醇对所述粉碎物料进行加热回流提取，加热回流温度为75-85℃，加热时间1小时，获得乙醇提取液；

S23.将所述乙醇提取液进行减压浓缩除去溶剂、冻干处理。

实施例3沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的降血脂作用

建立大鼠高脂血症模型：正常组用标准鼠料(含14％蛋白质、10％脂肪和76％碳水化合物)；采用改良配方的高脂饲料(标准鼠料添加1％胆酸、2％胆固醇和5.5％花生油)诱导大鼠高脂血症。

沙苑子乙醇提取物给药：期间给予灌服本发明实施例制备的沙苑子乙醇提取物低剂量组(SAC-L，200mg·kg^-1)、高剂量组(SAC-H，600mg·kg^-1)，设辛伐他汀组(SIM，3mg·kg^-1)作对照。动物模型与药物处理SD雄性大鼠，随机分成5组，设正常对照组(p.o.生理盐水)、模型对照组(p.o生理盐水)、阳性对照组(辛伐他汀SIM，3mg·kg^-1，p.o.)、沙苑子乙醇提取物低剂量组(SAC-L，200mg·kg^-1，p.o.)、沙苑子乙醇提取物高剂量组(SAC-H，600mg·kg^-1，p.o.)。除正常组喂饲标准饲料外，其余4组喂饲高脂饲料造模。开始造模当日 起，各组每天分别p.o.给药(1ml·100g^-1体重)，正常组、模型组p.o.等体积蒸馏水。连续给药28天后，各组小鼠均禁食12小时，颈椎脱臼处死，打开胸腔，心脏取血，制备血清，-80℃保存待检。给药28天后，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

本发明实施例采用血脂检测氧化酶法测总胆固醇，甘油磷酸氧化酶法测甘油三酯，直接法测高、低密度脂蛋白胆固醇；以上指标均按试剂盒说明测定。数据处理实验数据表示，实验统计采用SPSS12.0统计程序进行单因素方差分析，组间采用Post hoc方法比较，具体结果见下表2所示。

表2(n＝6–8)

其中，“###”表示与正常组比较p＜0.001；“*”表示与模型组比较p＜0.05。实验数据表明沙苑子乙醇提取物低剂量组、沙苑子乙醇提取物高剂量组均显著降低高脂血症大鼠血清TC、LDL-C含量(p＜0.05)。

沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠各组动脉粥样硬化指数的影响如下表3所示。

表3(n＝6–8)

其中，“###”表示与正常组比较p＜0.001；“*”表示与模型组比较，p＜0.05。

由本发明实施例可知，沙苑子乙醇提取物可以降低高脂血症大鼠血清中的TC和LDL-C，降低大鼠的动脉粥样硬化指数。

本发明实施例中，药品及试剂沙苑子产地陕西省渭南市，经香港理工大学深圳市中药药学及分子药理学研究重点实验室陈四保教授鉴定为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus Bunge的成熟种子(批号：syz-026-10)；辛伐他汀，石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，批号：178120201。国药准字：H19990366；总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)。

本发明实施例中，所述大鼠采用动物Sprague-Dawley大鼠，雄性，体重160～180g，SPF级，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(粵)2008-0002；实验动物质量合格证明号：0116188。

仪器：全自动生化仪HITACHI7100(日本，日立)。

实施例4沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的肝组织抗氧化酶活性和MDA的影响

本发明通过检测肝脏中多组抗氧化酶的活性，来研究沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的肝组织抗氧化酶活性和MDA的影响。

实验方法：采用实施例3相同的方法建立大鼠高脂血症模型、采用沙苑子乙醇提取物给药、处死大鼠。称取大鼠肝脏(约1g)储存于-80℃,加生理盐水(1/9，w/v)匀浆(10次，10秒/次，每次间隔15秒)冷冻的肝脏样品，匀浆后的样品离心(150×g,5min，4℃)，取上清后-20℃储存，使用试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的表达，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量。高脂血症大鼠的肝组织抗氧化酶活性和MDA(丙二醛)的作用见附图3所示。其中，与正常组比较，“#”表示p＜0.05；“##”表示p＜0.01；“###”表示p＜0.001。 与模型组比较,“*”表示p＜0.05,“*”表示p＜0.05，“***”表示p＜0.001。其中，control、HCD、SIM、SAC-L、SAC-H分别表示正常组、模型组、辛伐他丁组、沙苑子乙醇提取物低剂量组、沙苑子乙醇提取物高剂量组，后述附图中，上述英文释义相同。

实验数据表明与正常组相比，模型组(HCD组)中抗氧化酶SOD,GSH-PX,CAT的含量显著降低(p＜0.05，p＜0.05，p＜0.001)。辛伐他汀组能显著逆转由HCD引起的抗氧化酶SOD,CAT含量的下降(p＜0.001，p＜0.001)。与HCD组相比，沙苑子乙醇提取物低剂量组能增加抗氧化酶GSH-PX的表达，但不具有统计学意义(p＞0.05)。

与正常组相比，模型组(HCD组)测得丙二醛(MDA)的含量显著增高(p＜0.01)。辛伐他汀组、沙苑子乙醇提取物低剂量组能显著降低HCD引起的丙二醛含量的升高(p＜0.001，p＜0.05)。

由本发明实施例可知，沙苑子提取物可以降低高脂血症大鼠血清中的丙二醛的含量。

仪器与试剂:ulteraturax T-25匀化器、酶活测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)。

实施例5沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠抗脂肪肝的作用

5.1采用实施例3相同的方法建立大鼠高脂血症模型、采用沙苑子乙醇提取物给药、处死大鼠。取大鼠肝脏，采用肝脏的组织病理学切片直观地检视各实验组大鼠肝脏情况的差异性。将大鼠处死后，取各实验组大鼠的肝脏的同一部位的肝脏，立即用生理盐水清洗并用10％福尔马林液固定。固定后，肝脏组织被埋藏进石蜡中，随后肝脏组织被切成5μm的切片，用苏木精和曙红染色，并用400倍光学显微镜拍照，大鼠肝脏外观及其切片染色后的显微图片结果见图4所示。其中，a、b、c、d、e分别表示：正常组、模型组、辛伐他汀组、沙苑子乙醇提取物低剂量组、沙苑子乙醇提取物高剂量组。

5.2采用蛋白免疫印迹法定量检测大鼠肝脏的PEPCK,LDLR,PPAR-α蛋白水平。

采用实施例3相同的方法建立大鼠高脂血症模型、采用沙苑子乙醇提取物给药、处死大鼠。取大鼠肝脏，大鼠肝脏提取物用8％和10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完毕转移至PVDF膜上，PVDF膜用不含脂肪的牛奶4℃封闭过夜。将PVDF膜用适当的一抗4℃孵育过夜，二抗anti-rabbit,anti-mouse和goat(1：4000)室温孵育1小时。ECL发光液(Rockford,USA)与免疫反应条带结合发出化学荧光，用胶片捕获荧光。所得的实验数据是任一条带与β-actin(β-肌动蛋白)条带荧光强度的比值。实验结果见附图5所示。

实验数据表明，与正常组相比，模型组(HCD组)大鼠的肝脏在PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)和LDLR(低密度脂蛋白受体)的蛋白表达中被显著抑制。辛伐他汀组、沙苑子乙醇提取物低剂量组、沙苑子乙醇提取物高剂量组能显著增强由HCD诱导的PEPCK和LDLR的蛋白表达的降低。另外，与正常组相比，HCD能显著上调大鼠肝脏的PPAR-α(过氧化物酶体增殖物活化受体)的蛋白表达而辛伐他汀组、沙苑子乙醇提取物低剂量组、沙苑子乙醇提取物高剂量组均能显著抑制由HCD诱导的PPAR-α的上调。

实施例6沙苑子乙醇提取物对高脂血症大鼠的血管舒张作用

采用实施例3相同的方法建立大鼠高脂血症模型、采用沙苑子乙醇提取物给药。给药阶段完成后，将大鼠处死并将其胸主动脉血管立即置于4℃Tyrode's台式液中(氯化钠118mM,氯化钾4.7mM,磷酸二氢钾1.2mM,碳酸氢钠25mM,葡萄糖11mM,氯化钙2.5mM,硫酸镁1.2mM)，剥除脂肪和结缔组织后将胸主动脉切成2个主动脉环瓣。一部分胸主动脉环瓣(3mm)用于内皮依赖性血管舒张性实验，一部分胸主动脉环瓣(15mm)用于测定NO产生引起的血管平滑肌舒张。

6.1内皮依赖性血管舒张性实验

一部分胸主动脉环瓣置于离体器官浴槽中加入5ml台式液(37℃，供气95％氧气和5％二氧化碳)，在1.2g的最佳负载下持续60分钟。环瓣舒张收缩力度的变化会被等距位移传感器记录并与Powerlab数据收集系统连接，记录频率设定为每分钟40次，血管需在静息张力下平衡1小时。在平衡期间，每20分钟用未加药的台式液润洗胸主动脉环瓣，并在必要时再调整静息张力。在平衡结束后，用60mM KCL测试两次以确保适当的收缩力。通过对等距收缩张力的检测，观察乙酰胆碱对于胸主动脉的舒张效果。胸主动脉环瓣预先给药1μM苯肾上腺素，随后加入1μM消炎痛(非选择性的环加氧酶抑制剂)和1μM新斯的明(抗胆碱酯酶)。在进入稳定的收缩阶段后，乙酰胆碱以累计浓度10nM–10μM加入离体器官浴槽，诱导血管舒张。浓度响应曲线将通过乙酰胆碱累计浓度对数与对苯肾上腺素引起的胸主动脉环瓣引起的收缩的相对舒张百分比体现。

6.2测定NO产生引起的血管平滑肌舒张

另一部分胸主动脉环瓣，由SNP通过影响血管平滑肌从而诱导血管舒张。SNP浓度响应曲线将通过SNP累计对数浓度对苯肾上腺素引起的环瓣引起的收缩的相对舒张百分比体现。

内皮依赖性血管舒张性实验和测定NO产生引起的血管平滑肌舒张的实验结果分别如附图6A、6B所示。

实验数据表明乙酰胆碱对于血管的舒张能力成浓度依耐性，当乙酰胆碱浓度达到10μM，对于不同组的大鼠所分离的血管相对舒张程度28-75％。

与正常组相比，模型组(HCD组)的血管相对舒张百分比明显低于正常组，具有统计学意义(p＜0.001)。与模型组相比，辛伐他汀组(3mg/kg/day)、沙苑子乙醇提取物低剂量组(200mg/kg/day)能显著提高血管的舒张能力，具有统计学意义(p＜0.001)，沙苑子乙醇提取物高剂量组(600mg/kg/day)也能促进对乙酰胆碱引起的血管舒张的响应(p＜0.05)，但沙苑子对于提高血管舒张能并不存在浓度依赖性。

另外，由SNP产生NO通过血管平滑肌舒张引起的血管舒张，然而在该实验中个实验组未体现出显著性差异(p＞0.05)。

本实施例可知，沙苑子提取物非浓度依赖性地提高高脂血症大鼠的内皮细胞依赖性的血管舒张性，并对HCD大鼠血管平滑肌舒张性无影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。