蛋白激酶mTOR的S2481位点磷酸化作为肿瘤用药的标志物的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及蛋白激酶mtor的s2481位点磷酸化作为肿瘤用药的标志物。
背景技术：
：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是世界范围内最为流行的恶性肿瘤之一。在欧美国家，原发性的肝癌患者较少，且多由其他类型肿瘤的转移到肝脏引发。而在东南亚地区和撒哈拉沙漠以南的地区，特别是在中国，肝癌患者则大多是原发性肝癌。肝癌发生发展的过程与多个基因的突变以及多条信号通路密切相关。针对这些分子机制，肝癌的靶向治疗逐步受到重视。sorafenib是一类小分子抑制剂，能够抑制多种蛋白激酶的活性，包括vegfr、pdgfr以及raf等。在2007年的asco会议上，josepm.llovet等人公布了sorafenib在肝癌中的临床试验治疗效果。对于肝癌患者，sorafenib相比对照药，其疗效提高了44％，病人的平均存活时间延长了3个月。在2007年11月，美国fda批准sorafenib作为晚期肝癌的一线用药。sorafenib的出现无疑给众多肝癌患者带来了希望，但是sorafenib的抗药性使得其对于肝癌的总体治疗效果仍然难以让人满意。有研究表明除了受sorafenib抑制的raf通路在肝癌发生发展中有重要功能之外，mtor信号通路与肝癌的发生发展也有密切的关系。josepm.llovet等人发现无论是在细胞水平还是动物模型的水平，联合使用raf通路的抑制剂sorafenib和mtor通路的抑制剂rapamycin可以展现出更强的抗肿瘤效应。mtorc1能够活化s6k，调控蛋白质的合成过程，促进细胞从g1期向s期转变，从而促进肝癌细胞的增殖。此外，有15-41％的肝癌病人中mtor通路是过度活化的。在肝癌的动物模型里，mtor的抑制剂也具有抗肿瘤效应。日本国立癌症研究院的masuda等人利用大量不同的磷酸化位点特异性抗体，对肝癌患者的标本进行了大规模筛查，发现高水平的p-rps6s235/236可能是sorafenib治疗无效的分子标记。并且发现在sorafenib抵抗的肝癌细胞里，mtor信号通路是活化的，mtor的抑制剂能够显著抑制sorafenib抵抗的肝癌细胞的增殖。首都医科大学附属佑安医院卢实春等人发现雷帕霉素(sirolimus，西罗莫司)能够降低早中期肝癌病人肝移植术后的远期肿瘤复发率，并提高其术后生存率。这些研究成果提示sorafenib和sirolimus都对肝癌患者有一定疗效，但是在什么情况下使用哪一种药物的个性化用药依据目前未知。胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。病因主要有地域环境及饮食生活 因素、幽门螺杆菌感染、癌前病变以及遗传和基因等几个因素。蛋白激酶mtor除了在肝癌组织中高表达以外，有证据表明mtor在胃癌组织中也有异常表达。技术实现要素：本发明的一个目的是提供mtor信号通路抑制剂的用途。本发明提供的mtor信号通路抑制剂在如下1)-3)中至少一种中的应用：1)制备抑制肿瘤细胞或肿瘤组织中mtors2481位点磷酸化水平的产品；2)制备抑制肿瘤细胞增值的产品；3)制备抑制器官移植后肿瘤患者复发的产品。上述应用中，所述肿瘤细胞或肿瘤组织为mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤细胞或肿瘤组织。所述肿瘤细胞为肝癌细胞或胃癌细胞；所述肿瘤组织为肝癌组织或胃癌组织。所述肿瘤细胞或肿瘤组织为mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤细胞或肿瘤组织；mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤细胞为hcclm6细胞；mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤组织为中期或晚期病人的肿瘤组织。mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤细胞或肿瘤组织为满足如下的样品：样品的质谱数据通过生物信息学的计算方法，符合如下1)-3)全部：1)、肿瘤细胞或肿瘤组织中mtor底物位点占磷酸化网络位点的比值，这个值>14％2)、肿瘤细胞或肿瘤组织中mtor底物位点数目与癌旁中比值，这个值>1.23)、做卡方检验的p值<0.05。反之，不符合1)-3)全部，则不为mtors2481位点磷酸化水平高。上述应用中，所述产品为药物。所述mtor信号通路抑制剂为rapamycin；本发明的另一个目的是提供检测mtors2481位点磷酸化水平的物质的用途。本发明提供的检测mtors2481位点磷酸化水平的物质在制备辅助检测待测组织是否为肿瘤组织的产品中的应用。上述应用中，所述检测mtors2481位点磷酸化水平的物质为免疫组织化学检测试剂或westernblot检测试剂；所述免疫组织化学检测试剂或westernblot检测试剂均包括mtors2481磷酸化抗体；所述检测mtors2481位点磷酸化水平的物质还包括抗igg抗体；具体为rabbitigghorseradishperoxidase-conjugatedantibody或mouseigghorseradishperoxidase-conjugatedantibody。检测待测肿瘤细胞或待测肿瘤患者中mtors2481位点磷酸化水平物质在制备用于筛选和/或确定rapamycin抑制该肿瘤用量的产品中的应用也是本发明保护的范围。检测待测肿瘤细胞或待测肿瘤患者中mtors2481位点磷酸化水平物质在制备指导肿瘤患者用药的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述指导肿瘤患者用药的应用中，肿瘤患者中mtors2481位点磷酸化水平越高的患者，给予rapamycin或者给予更高量的rapamycin。mtors2481位点作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述肿瘤为肝癌或胃癌。上述mtors2481位点为mtor氨基酸序列第2481位；上述mtor氨基酸序列为序列1。本发明的实验证明，rapamycin抑制肿瘤细胞或肿瘤组织中mtors2481位点磷酸化水平，尤其对mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤或肿瘤细胞抑制率高，且rapamycin抑制肝移植术后接受rapamycin药物治疗肝癌患者复发，其术后致死率和复发率与mtors2481位点磷酸化水平呈现一定的负相关性。因此，mtors2481位点磷酸化水平的高低可以作为肝癌或胃癌病人个性化用药的潜在依据，具有较大的社会意义和经济价值。附图说明图1为磷酸化蛋白质组数据显示相比正常肝脏组织在hcclm6细胞中活性显著升高的激酶。图2为免疫组化检测肝癌和癌旁组织芯片中mtor的表达染色图。图3为免疫组化检测肝癌和癌旁组织芯片中mtor的表达柱状图。图4为免疫组化检测肝癌和癌旁组织芯片中mtors2481位点磷酸化的表达染色图。图5为免疫组化检测肝癌和癌旁组织芯片中mtors2481位点磷酸化的表达柱状图。图6为westernblot检测hepg2和hcclm6细胞mtor及s2481位点磷酸化的表达。图7为mtt法检测hepg2和hcclm6细胞对于rapamycin的敏感程度。图8为westernblot检测hepg2和hcclm6细胞对于rapamycin的敏感程度。图9为小鼠肝脏原位接种hepg2和hcclm6细胞后的肿瘤生长曲线。图10为westernblot检测肝癌患者移植术后的肿瘤组织中mtors2481位点磷酸化的水平。图11为免疫组化检测胃癌和癌旁组织芯片中mtors2481位点磷酸化的表达。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明可以通过以下实例更容易地理解，但本发明并不仅限于这些实例。实施例1、mtors2481位点磷酸化的表达与肿瘤细胞生长的影响一、肿瘤细胞中mtors2481位点磷酸化的发现1、细胞培养和收集a)用含有10％胎牛血清(gibco，10270)的dmem培养基(hyclone，sh30022.01b)培养肝癌细胞hcclm6；b)当细胞长到80％融合后用预冷的磷酸盐缓冲液(hyclone，sh30256.01b)清洗四次；c)加入磷酸化蛋白质组学细胞裂解液并刮取细胞，超声1s，间歇5s，共80个循环。2、sds-page电泳后，灰度值进行定量3、蛋白质的胰蛋白酶消化和肽段制备a)用50mm碳酸氢铵对样品进行六倍稀释；b)按照胰酶(promega，9piv511)与蛋白质1：100的比例加入胰酶消化液，37℃消化过夜；c)样品冷却至室温，加入甲酸至终浓度为4％(体积比)，使ph<2；d)室温2,500g离心10分钟，弃掉沉淀并蒸干上清。4、肽段脱盐a)500mgreverse-phasec18sep-pak脱盐柱(waters，wat036815)先后用1ml的甲醇，3ml的乙腈进行平衡。b)用1ml肽段脱盐缓冲液c和1ml肽段缓冲液b清洗脱盐柱。c)用3ml肽段脱盐缓冲液a平衡脱盐柱。d)用1ml肽段脱盐缓冲液a重悬蒸干的样品，13,300rpm离心5min。取上清上样脱盐。e)用1ml肽段脱盐缓冲液a清洗脱盐柱，洗三次。f)分别用600μl肽段脱盐缓冲液b和肽段脱盐缓冲液c洗脱肽段并蒸干。5、肽段混合物的离线液相分离将上述肽段消化产物重悬于400μl流动相a中。以0.1ml/min的流速，100％的a相进样1.8min。进样完成后，以0.7ml/min的流速进行分离。梯度为65min八段线性梯度，如下表1所示。每分钟1个组分。前五分钟记作ft。将收集的60个组分，分 别按照1,13,25,37,49；2,14,26,38,50；3,15,27,39,51；4,16,28,40,52；5,17,29,41,53；6,18,30,42,54；7,19,31,43,55；8,20,32,44,56；9,21,33,45,57；10,22,34,46,58；11,23,35,47,59；12,24,36,48,60合并的方法，合并为12个组分并蒸干。用于液相分离a相溶液成分为5％乙腈，10mm甲酸氨，ph＝10；b相溶液成分为90％乙腈，10mm甲酸氨，ph＝10。表1为八段线性梯度6、imac富集磷酸化肽段a)取imac磷酸化肽亲和介质于1.5ml的离心管中。加入40μl超纯水，涡旋3min。洗三次；b)加入40μl100mm的edta，颠倒孵育1h。c)弃掉上清。加入40μl超纯水，颠倒3min，洗三次。d)加入40μl100mm的氯化铁，颠倒孵育1h。e)加入40μl超纯水，涡旋3min，洗三次。f)加入40μl磷酸化肽富集缓冲液a，涡旋3min，平衡三次。g)加入40μl磷酸化肽富集缓冲液b，涡旋3min，平衡三次。h)用40μlimac磷酸化肽富集缓冲液b溶解样品并加入上述活化的imac磷酸化肽亲和介质，涡旋孵育1h。i)2,000g离心，弃上清。j)加入40μl磷酸化肽富集缓冲液b，涡旋3min，洗五次。k)加入40μl磷酸化肽富集洗脱缓冲液，涡旋10min，将上清转移到用乙腈预处理20min的pcr管中，并加入40μl磷酸化肽富集中和缓冲液，洗脱两次并蒸干。7、质谱鉴定取1μg肽段样品用长20cm，内径75μm填充有3μm粒径dr.maischgmbh的反相reprosil-pur120c18-aq填料的色谱柱(sinoamericanproteomicsllc)进行分离。 样品采用10μl/min流速上样，上样1min后进行色谱分离。液相色谱为watersnanoacquitylc，梯度为60分钟二段线性梯度，前22分钟为3％to20％缓冲液b，第2段为38分钟的20％到80％缓冲液b。流速是300nl/min。洗脱的肽段通过ltq-orbitrapvelos(thermofisherscientific)进行检测。电喷雾电压为1.8kv，离子传输毛细管温度为250℃。质谱以数据依赖方式进行测序，质谱扫描离子质荷比范围为300～1600，分辨率为30,000，自动增益控制(agc)设置为106；随后进行top20的数据依赖扫描，离子解离方式是碰撞诱导解离(cid)，agc为30,000，最大离子注入时间为150ms。1价离子被自动排除扫描。动力学排除是+/-0.005m/z，30秒。8、搜库分析通过sorcerertm-(version4.0.4build,sage-nresearch,inc.)搜索引擎对质谱产出的数据文件(.raw)进行搜库分析，数据库采用从ncbi下载的人的蛋白序列数据库(version：20121203)。搜库参数采用固定修饰为半胱氨酸的烷基化修饰(+57.0215da)；可变修饰为甲硫氨酸上的氧化修饰(+15.9949da)；以及丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸上的磷酸化修饰(+79.9663da)；母离子质量误差20ppm，子离子质量误差0.5da，允许最大漏切位点数目为2个，肽段长度≥7个氨基酸，肽段最大修饰数目为4种。搜库结果采用target-decoy策略进行过滤，并设定肽段和蛋白质鉴定fdr均小于1％。9、激酶活性预测将搜库得到的磷酸化位点数据处理成elm格式并提交到igps软件(http://igps.biocuckoo.org/)进行计算，注释位点对应的激酶。对结果进行整理，得到每个激酶在该磷酸化组中磷酸化底物位点数目。同样，对正常肝脏的磷酸化蛋白质组(来自于文献songetal.molcellproteomics,2012,11(10):1070-1083.)进行分析，得到每个激酶在正常肝组织磷酸化组的底物位点数目情况。针对每个激酶，采用2×2列联表对每个激酶在不同磷酸化组中的底物位点数目进行统计比较。如表2所示：表2为每个激酶在不同磷酸化组中的底物位点数目某激酶底物位点数其他激酶的底物位点数总计hcclm6的磷酸化组aba+b正常肝的磷酸化组cdc+d总计a+cb+da+b+c+d利用某激酶底物位点数占所有被注释的底物位点数的百分比来表征激酶的活性水平。采用卡方检验分析激酶在不同不同磷酸化组中的底物位点数目差异的显著性，采 用p<0.01作为判断差异的阈值。差异最为显著的(p<0.0001)的部分激酶如图1所示。在该分析中，mtor激酶底物位点占磷酸化网络位点比率在癌和癌旁中即为mtor激酶的a/(a+b)和c/(c+d)。癌组织比癌旁组织位点数目比即为mtor激酶的a/c。从该结果看出，cdk家族激酶和mapk家族激酶在hcclm6细胞中活性高。除此之外，mtor激酶在hcclm6细胞中活性高，其底物位点占被注释的底物位点百分比为16.80％，而在正常肝组织中占11.14％。在此基础上，对胃癌的磷酸化组数据(来自于文献guoetal.cellmollifesci,2011,68(11):1983-2002.)进行同样的分析，发现在胃癌中，mtor同样具有显著差异的高活性(p<0.0001)，其底物位点占被注释的底物位点百分比为15.75％。因此，可以将激酶活性预测值的高低定义为mtors2481位点磷酸化水平的高低。mtors2481位点磷酸化水平高的肿瘤细胞或肿瘤组织为满足如下的样品：样品的质谱数据通过生物信息学的计算方法，符合如下1)-3)全部：1)、肿瘤细胞或肿瘤组织中mtor底物位点占磷酸化网络位点的比值，这个值>14％2)、肿瘤细胞或肿瘤组织中mtor底物位点数目与癌旁中比值，这个值>1.23)、做卡方检验的p值<0.05。反之，不符合1)-3)全部，则不为mtors2481位点磷酸化水平高。二、免疫组化检测肝癌和癌旁组织芯片中mtors2481位点磷酸化水平从上海芯超生物科技有限公司购入肝癌组织芯片(hliv-hcc180cs-01和hliv-hcc180cs-02)，共计56例(包括癌组织和癌旁组织)，其中i期病例12例，ii期病例29例(中期)，iii期病例15例(晚期)。按照常规的免疫组织化学的方法，使用购买自abcam公司的mtor抗体(abcam，ab2732)和mtors2481磷酸化抗体(abcam，ab45996)对芯片进行染色。结果如下:图2(a1、b1和c1为三例癌旁组织，a2、b2和c2为三例癌组织)展示的是mtor检测中具有代表性的三例阳性结果，表明肝癌组织相对癌旁组织，其mtor的表达水平显著提高；图3展示的是所有病例进行汇总的结果，同样说明肝癌组织相对癌旁组织，其mtor的表达水平显著提高。图4(a1、b1和c1为三例癌旁组织，a2、b2和c2为三例癌组织)展示的是mtors2481位点磷酸化检测中具有代表性的三例阳性结果，表明肝癌组织相对癌旁组织，其mtors2481位点磷酸化水平显著提高；图5展示的是将所有病例进行汇总的结果，同样说明肝癌组织相对癌旁组织，其mtors2481位点磷酸化水平显著提高。上述结果进一步证明，肝癌组织中的mtors2481 位点磷酸化水平高于癌旁组织。因此，mtors2481位点磷酸化水平可以作为辅助判断待测组织是否为肿瘤组织，检测待测组织中mtors2481位点磷酸化水平，若待测组织中mtors2481位点磷酸化水平高于非肿瘤组织中mtors2481位点磷酸化水平，则待测组织为或候选为肿瘤组织；若待测组织中mtors2481位点磷酸化水平不高于非肿瘤组织中mtors2481位点磷酸化水平，则待测组织不为或候选不为肿瘤组织。中期肝癌组织中mtor底物位点占磷酸化网络位点的比值为14.31％；中期肝癌组织中mtor底物位点数目与癌旁组织中mtor底物位点数目的比值为1.29。晚期肝癌组织中mtor底物位点占磷酸化网络位点的比值为16.80％；晚期肝癌组织中mtor底物位点数目与癌旁组织中mtor底物位点数目比值为1.51。实施例2、rapamycin抑制肿瘤细胞中mtors2481位点磷酸化水平westernblot检测肝癌细胞hepg2(国家实验细胞资源共享平台)和肝癌细胞hcclm6(记载在如下文献中：liy,tianb,yangjetal.stepwisemetastatichumanhepatocellularcarcinomacellmodelsystemwithmultiplemetastaticpotentialsestablishedthroughconsecutiveinvivoselectionandstudiesonmetastaticcharacteristics.jcancerresclinoncol2004；130:460–8)中mtor及mtors2481位点磷酸化的表达以及rapamycin(selleck，s1039)处理后mtors2481位点磷酸化水平的变化，具体如下：分别收集处于生长对数期的hepg2和hcclm6细胞，采用常规的westernblot步骤，使用购自abcam公司的mtor抗体以及mtors2481磷酸化抗体和购自santacruz公司的gapdh内参抗体(santacruz，sc-365062)作为一抗，使用购自r&d公司相应来源的抗体作为二抗(rabbitigghorseradishperoxidase-conjugatedantibody和mouseigghorseradishperoxidase-conjugatedantibody，r&d，haf008和haf009)。结果如图6所示，hcclm6细胞和hepg2细胞中均有mtors2481位点磷酸化；且在mtor表达水平无明显变化的情况下，hcclm6细胞中的mtors2481位点磷酸化水平高于hepg2细胞中的mtors2481位点磷酸化水平。收集处于生长对数期的hepg2和hcclm6细胞，分别加入不同终浓度(10μm、5μm、1μm和0μm)的rapamycin，48小时以后收集细胞，采用常规的westernblot步骤，使用购自abcam公司的mtors2481磷酸化抗体(abcam，ab45996)和购自santacruz公司的β-actin内参抗体(santacruz，sc-8432)作为一抗，使用购自r&d公司相应来源的抗体作为二抗。结果如图8所示，在rapamycin处理后，hepg2和hcclm6细胞中的mtors2481 位点磷酸化水平降低，且随着rapamycin浓度的增加，hepg2和hcclm6细胞中的mtors2481位点磷酸化水平逐渐降低，表明，rapamycin抑制肿瘤细胞中mtors2481位点磷酸化水平；相比mtors2481位点磷酸化水平高的hcclm6细胞，这种剂量依赖效应更为明显。这些结果说明，rapamycin可以抑制肿瘤细胞中mtors2481位点磷酸化水平，尤其对mtors2481磷酸化水平高的肿瘤细胞中mtors2481位点磷酸化水平抑制效果更为明显。因此，可以根据检测待测肿瘤细胞或待测肿瘤患者中mtors2481位点磷酸化水平来筛选和/或确定rapamycin抑制该肿瘤用量。实施例3、rapamycin抑制肿瘤细胞增值一、体外rapamycin抑制肿瘤细胞增值1、复苏hcclm6和hepg2细胞，37℃水浴，2min内完成，37℃5％co2培养箱中培养；2、取对数期生长细胞消化，1000rpm离心5min，计数，用培养基将lm6细胞调整到3×104个/ml，将hepg2细胞调整到105个/ml，每孔100μl接到96孔细胞培养板中，37℃5％co2培养箱中孵育；3、孵育24h后吸出上清弃去。用mem培养基将rapamycin从10μm开始梯度稀释，每孔100μl加入到96孔板中。37℃5％co2培养箱中培养；4、孵育48h后，每孔加入10μl显色剂，37℃5％co2培养箱孵育1h后490nm检测od值。结果如图7所示，随着rapamycin浓度的升高，hepg2和hcclm6细胞的增殖水平都受到不同程度的抑制，但是hcclm6细胞被抑制的程度明显要强于hepg2细胞被抑制的程度。上述结果表明，rapamycin抑制肿瘤细胞增值，尤其对mtors2481磷酸化水平高的肿瘤细胞抑制效果更明显。二、体内rapamycin抑制肿瘤1、模型的建立1)肿瘤细胞的准备先给hepg2细胞和hcclm6细胞分别构建带有绿色荧光蛋白(gfp)和红色荧光蛋白(rfp)稳定表达的稳定株细胞(plein-gfp质粒(clontechlaboratories,inc.(paloalto.ca))导入hepg2细胞，得到表达绿色荧光蛋白的细胞；将pdsred2-rfp质粒(clontechlaboratories,inc.(paloalto.ca))导入hcclm6细胞，得到表达红色荧光蛋白的细胞)，保证hepg2细胞或者hcclm6细胞稳定株正处于对数生长期，密 度最好不超过50％。弃掉培养基，用3ml胰酶轻轻冲洗培养瓶，弃掉。再加入3ml胰酶，轻轻摇晃培养瓶，使得细胞完全脱落，注意不要让细胞在胰酶里存在过长时间。加入3ml新鲜预冷的dmem培养基，用移液器混匀成单细胞悬液。将细胞转移到50ml离心管中，再加入40ml预冷的dmem培养基，完全中和胰酶，4℃500g离心10min。弃掉上清，在预冷的hbss中悬浮细胞，获得终浓度为1-5*106/ml。将细胞浓度调整到2*106/ml。2)、皮下接种小鼠将小鼠麻醉，按小鼠体重注射70mg/kg的戊巴比妥钠。小鼠昏迷之后，重悬1)制备的细胞，装满1ml注射器。用70％酒精湿润腹部皮肤，适量剪去毛发，将细胞缓慢皮下注射进去，每只小鼠100μl细胞(105个细胞)，注射完成之后，应该见到隆起的现象。3)、原位接种小鼠将小鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，无菌手术条件下，切开腹壁和腹膜，暴露出肝右叶。移植前，用手术刀片将肝叶切一2mm长小口，以8-0医用锦纶单丝线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)将1mm3大小的肿瘤组织块缝合到肝脏切口处，把肝脏放回腹腔内，并用6-0外科缝合线(ethicon.inc)分别间断缝合小鼠肌层及皮肤，建立表达红色荧光蛋白标记的小鼠肝癌原位模型。2、给药检测建模后第3天，以fluorvivomodel-100荧光成像仪对所有小鼠在进行全身成像。剔除瘤负荷离均值较大的荷瘤小鼠后，将挑选出的20只小鼠随机分为2组：对照组(control)：给药剂量按每只小鼠2mg/kg体重给药，给药频率为每天一次，给药29天(hepg2细胞)和39天(hcclm6细胞)，对照给的药是生理盐水。rapamycin给药组：给药剂量按每只小鼠2mg/kg体重给药，给药频率为每天一次，给药29天(hepg2细胞)和39天(hcclm6细胞)。3、检测给药第一天起用fluorvivomodel-100荧光成像仪观测小鼠肿瘤的大小。图9左图为hepg2细胞接种小鼠肿瘤大小：在第1、4、8、11、15、18、22、25、29天，hepg2细胞对照组小鼠的肿瘤体积分别为2.4±0.33、3.3±0.21、4.4±0.44、6.6±1.43、8.6±0.87、10.4±1.70、11.8±2.06、14.5±3.12、18.5±5.12(单位为mm2)；在第1、4、8、11、15、18、22、25、29天，hepg2细胞给药组小鼠的肿瘤体积分别为2.4±0.24、1.7±0.28、1.7±0.40、2.0±0.59、2.8±1.49、3.6±2.03、4.0±2.09、4.6±1.67、5.6±2.13(单位为mm2)；rapamycin能够有效抑制原位接种hepg2细胞小鼠肿瘤的生长。图9右图为hcclm6细胞接种小鼠肿瘤大小：在第1、4、8、11、15、18、22、25、29、32、36、39天，hcclm6细胞对照组小鼠的肿瘤体积分别为1.9±0.35、2.2±0.23、2.4±0.23、2.5±0.28、26±0.51、2.9±0.68、4.1±1.67、5.0±1.84、9.9±7.35、14.2±9.94、19.6±13.8、24.8±15.7(单位为mm2)；在第1、4、8、11、15、18、22、25、29、32、36、39天，hcclm6细胞给药组小鼠的肿瘤体积分别为2.0±0.21、1.6±0.34、1.6±0.31、1.4±0.31、1.4±0.22、1.6±0.37、2.1±0.96、2.5±1.79、3.5±3.40、4.0±3.87、4.5±4.47、5.3±5.3(单位为mm2)；同样，rapamycin能够有效抑制原位接种hcclm6细胞小鼠肿瘤的生长。接种hcclm6细胞的小鼠，其肿瘤体积在较早的时间内(18天以前)几乎没有生长，而且还有萎缩的趋势，而且在持续了更长的时间(39天相比29天)，才接近接种hepg2细胞小鼠的肿瘤体积。从上述可以看出，rapamycin抑制小鼠肿瘤生长，尤其对接种mtors2481磷酸化水平高的肿瘤细胞小鼠模型抑制效果更明显。实施例4、rapamycin抑制器官移植治疗后肿瘤患者复发7例肝移植术后接受rapamycin药物治疗肝癌患者，3例为无瘤生存不复发患者，4例为带瘤生存复发患者，收集无瘤生存不复发患者的肝组织和带瘤生存复发患者的肿瘤组织，将组织在液氮中将组织研碎，使用磷酸化蛋白质组裂解液将其充分裂解。采用常规的westernblot步骤，使用购自abcam公司的mtors2481磷酸化抗体和购自santacruz公司的β-actin内参抗体(santacruz，sc-8432)作为一抗，使用购自r&d公司相应来源的抗体作为二抗。结果如图10所示，无瘤生存不复发患者中mtors2481磷酸化水平显著高于带瘤生存复发患者，表明，rapamycin对mtors2481磷酸化水平高的无瘤生存不复发患者治疗效果更明显，抑制肝癌患者结合肝移植术后的肿瘤复发。实施例5、免疫组化检测胃癌和癌旁组织芯片中mtor及其s2481位点磷酸化的表达从上海芯超生物科技有限公司购入胃癌组织芯片(hstm-ade150cs-01)，共计75例(包括癌和癌旁组织)，其中i期病例4例，ii期病例47例，iii期病例24例。按照常规的免疫组织化学的方法，使用购买自abcam公司的mtors2481磷酸化抗体(abcam，ab45996)对芯片进行染色。结果如图11所示，展示的mtors2481位点磷酸化检测中具有代表性的四例阳性 结果，表明胃癌组织相对癌旁组织，其mtors2481位点磷酸化水平显著提高。当前第1页12