本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种丙型肝炎病毒三价亚单位疫苗的制备及应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus,hcv)是危害全球公共健康的严重问题。目前全球已经有超过1.7亿hcv慢性感染病例，每年还有3到4百万新发病例。据统计，80％的hcv感染者会转为慢性感染，其中25％可能发展为肝硬化，其中又有20％可能发展为肝癌。
丙型肝炎病毒是黄病毒科肝炎病毒属的单链正义rna病毒，基因组约9.6kbp。hcv基因组共编码10个病毒蛋白，包括核蛋白core、包膜糖蛋白e1和e2在内的结构蛋白，以及包括p7,ns2,ns3,ns4a,ns4b,ns5a和ns5b在内的非结构蛋白。
丙型肝炎的传统治疗手段主要为利巴韦林合并干扰素治疗，该方法副作用较大、持续病毒学应答(sustainedvirologicalresponse,svr)不高且存在显著的型间和人群间差异。2014年，随着多种针对hcv的新一代抗病毒药物(direct-actingantiviralagents,daa)在国外上市，丙型肝炎治疗方法发生了革命性的进步，新的daa疗法将丙型肝炎的svr提高到90％以上，让人们看到了根除hcv的希望。
但daa的上市并不意味着hcv的彻底根除。首先，昂贵的价格极大限制了这些daa在中低收入国家的使用、即使在发达国家的使用也可能被限制在特定人群中。其次，这些daa多作用于非结构蛋白ns3/4a和ns5a上的固定位点，考虑到hcv复制中的高突变率，存在出现耐药性突变病毒的可能性。第三，daa并不能排除治愈后再感染的可能性，对于高暴露、高危人群仍缺乏有效的长期保护手段。另外，这些daa的临床数据多来源特定群体(如无肝纤维化的中年白人男性)，在许多复杂情况下(如3型感染、纤维化等肝代偿性疾病、肝移植、肾衰竭等)的清除效果还不明确，对于儿童和孕妇的作用效果也缺乏报道；有报道甚至观察到采用无干扰素daa疗法的hcv相关肝癌手术病人存在较高的早期癌症复发率。最后，由于起病隐匿、发病症状不明显，丙型肝炎存在着“认知率低、就诊率低、治疗率低”的特点。据估计，在中国hcv的就诊率仅为1.6％-10％左右，相当部分的病人觉察到症状而就诊时已经发展到肝硬化甚至肝癌阶段。这意味着大量晚期阶段才被发现的hcv病例仍然无法治愈，hcv慢性感染及其所引发的肝硬化和肝癌等终身疾病仍是公共卫生领域的巨大负担。因此，尽快研制安全有效的hcv预防性疫苗对于控制和消除hcv感染，减轻hcv这一全球性的长期公共卫生负担具有不可忽视的意义。
由于该病毒存在基因序列的高度变异性、糖基化漂移等免疫逃逸特质，目前尚无针对hcv的有效疫苗。但临床数据显示在高慢性化率之外，仍有20-25％的病人可通过早期产生的中和抗体及t细胞免疫反应自发地清除hcv病毒；另一些证据显示在黑猩猩和人身上存在的保护性免疫记忆能大量降低二次感染的病毒载量以及肝脏炎症反应等病理现象。这表明，感染早期的中和抗体产生对于抵抗和消除hcv的感染至关重要，也为预防性hcv疫苗的研究提供了理论基础和依据。
国际上已有的hcv候选疫苗主要分为预防性与治疗性两种。预防性疫苗多在结构蛋白的基础上设计，以诱导高滴度的广谱中和抗体、中和入侵的hcv病毒为主要目的。而治疗性疫苗多在非结构蛋白的基础上设计，主要以诱导多功能t细胞反应、清除已存在的病毒感染为目的。目前已有多种hcv候选疫苗处于研发阶段，但进入临床试验的疫苗仅有少数，如预防性疫苗e1/e2重组蛋白联合mf59佐剂(cho细胞表达)，治疗性疫苗dna疫苗chronvac-c、人重组腺病毒疫苗ad6ns、黑猩猩重组腺病毒疫苗adch3ns和重组麻疹病毒mva-ns。
在预防性疫苗的研发中，疫苗保护的广谱性是一个极为重要问题。hcv现有7种基因型，型间序列存在31％－34％的差异，进一步可分为100个左右的亚型。据统计1、2型流行于亚洲，欧洲，拉丁美洲等世界大部分地区，3型主要流行于南亚、澳洲和欧洲，4型流行于中东和中北非地区，5流行于南非，6型流行于东南半岛。中国hcv流行型以1b，2a，2b及3a、6a等型较为常见，其中又以1b型为主，2a型次之。然而，目前绝大部分疫苗研究针对的都是北美主要流行的1a基因型，对于中国hcv流行株的保护性难以保证。中国hcv疫苗研发工作则开展较慢，至今尚未有疫苗开展临床试验。
因此，本领域迫切需要开发针对中国hcv流行株的hcv疫苗及其应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒三价亚单位疫苗的制备及应用。
在本发明的第一方面，提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：
第一组分，所述第一组分为hcv病毒1b型的se2蛋白或其衍生序列。
在另一优选例中，所述疫苗组合物还包括：
第二组分，所述第二组分为hcv病毒1a型的se2蛋白或其衍生序列。
在另一优选例中，所述疫苗组合物还包括：
第三组分，所述第三组分为hcv病毒3a型的se2蛋白或其衍生序列。
在另一优选例中，所述hcv病毒1b型为con1病毒株。
在另一优选例中，所述hcv病毒1a型为h77病毒株。
在另一优选例中，所述hcv病毒3a型为s52病毒株。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中，第一组分：第二组分：第三组分的重量比约为1～5：1～5：1～5。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中，第一组分：第二组分：第三组分的重量比约为1～3：1～3：1～3。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中，第一组分：第二组分：第三组分的重量比约为1～2：1～2：1～2。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中，第一组分：第二组分：第三组分的重量比约为1：1：1。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中还包括药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
在另一优选例中，所述第一组分选自下组：
(a)具有seqidno:1所示氨基酸序列的多肽；
(b)具有与seqidno:1所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体的能力；
(c)将seqidno:1中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体能力的衍生多肽。
在另一优选例中，所述第二组分选自下组：
(a)具有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；
(b)具有与seqidno:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体的能力；
(c)将seqidno:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体能力的衍生多肽。
在另一优选例中，所述第三组分选自下组：
(a)具有seqidno:3所示氨基酸序列的多肽；
(b)具有与seqidno:3所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体的能力；
(c)将seqidno:3中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留诱导机体产生抗hcvse2蛋白抗体能力的衍生多肽。
在另一优选例中，所述疫苗组合物中还包括佐剂。
在另一优选例中，所述的佐剂选自下组的一种或多种：氧化铝、皂苷、quila、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或deae葡聚糖、细胞因子(包括il-1、il-2、ifn-r、gm-csf、il-6、il-12、和cpg)。
本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的疫苗组合物的用途，用于制备针对hcv的抗体；和/或用于制备治疗或预防hcv感染的药物或疫苗。
在另一优选例中，所述hcv包括选自下组的嵌合病毒株型：h77(gt1a),con1(gt1b),jfh1(gt2a),j8(gt2b),s52(gt3a),ed43(gt4a),hk6a(gt6a)及临床适应株型pr52b6mt(gt1b),pr79l9(gt1b)及pr63(gt2a)。
本发明的第三方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括步骤给需要的对象施用本发明第一方面所述的疫苗组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.不同株型hcvse2在果蝇s2细胞中的表达与纯化。(a)表达hcv不同株型se2重组质粒pmt/bip/se2-v5-hisa的示意图。(b)将表达目的基因的重组质粒瞬时转染s2细胞，氯化铬诱导3天后，取细胞上清,经1c9特异性抗体的免疫印记检测后所得目的条带分别为1-3为pr79se2,pr26se2,con1se2；4-6为con1se2,h77se2,s52se2。(c)将表达目的基因的重组质粒与pcoblast筛选压质粒共转然s2细胞，所得稳转细胞系大量表达se2蛋白，经镍柱纯化，sds-page考马斯亮蓝染色所得目的蛋白如图1-4为con1se2,pr26se2,pr79se2,marker；5-6为marker,con1se2,h77se2,s52se2。
图2.不同株型hcvse2蛋白的特性分析。(a)con1,h77,s52的se2及多价苗与构象抗体ar3a及线性抗体ap33(mta见附件)(b)结合曲线。(c)con1,h77,s52的se2及多价苗与hcv受体cd81结合曲线，检测抗体分别为鼠抗his抗体及鼠抗hcv-e2抗体。
图3.con1se2免疫血清与同型pr26c6mtse2及pr79l9se2相比具有更好的广谱中和活性。(a)四免后免疫原产生的抗体滴度。(b)1b型免疫原第四次免疫后，血清1:40稀释度下中和水平。
图4.h77、con1、s52来源se2混合的三价苗免疫血清具有更好的广谱中和活性。(a)四免后免疫原产生的抗体滴度。(b)候选单价苗与候选多价苗第四次免疫后，血清1:40稀释度下的中和水平。
图5h77、con1、s52来源se2混合免疫的最佳方案。(a)四免后免疫原产生的抗体滴度。(b)不同免疫程序及剂量的候选多价苗第四次免疫后，血清1:40稀释度下的中和水平。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现，将分别来源于hcv病毒con1、h77、和s52病毒株的se2蛋白混合制备的三价疫苗(con1/h77/s52三价苗)，能够大幅提升小鼠对多种株型病毒的免疫能力，实验结果表明，与来源于con1、h77或s52病毒株的单价苗相比，con1/h77/s52三价苗极大地提升了针对hcv主要流行亚型病毒的中和水平。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
活性成分
本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括：
第一组分，所述第一组分为hcv病毒1b型的se2蛋白或其衍生序列；
第二组分，所述第二组分为hcv病毒1a型的se2蛋白或其衍生序列；
第三组分，所述第三组分为hcv病毒3a型的se2蛋白或其衍生序列。
上述组合物作为活性成分，可以用来制备药物或疫苗。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述hcv病毒1b型为con1病毒株。
con1病毒株为来自1b型的hcv慢性感染患者core-ns2第一个跨膜区与jfh1非结构蛋白基因形成的嵌合病毒con1/jfh1，con1病毒株的基因信息请见genbank基因登录号aj238799.1。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述hcv病毒1a型为h77病毒株。
h77病毒株为1a型的hcv慢性感染患者core-ns2第一个跨膜区与jfh1非结构蛋白基因形成的嵌合病毒h77/jfh1，h77病毒株的基因信息请见genbank基因登录号jf343780.2。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述hcv病毒3a型为s52病毒株。
s52病毒株为3a型的hcv慢性感染患者core-ns2第一个跨膜区与jfh1非结构蛋白基因形成的嵌合病毒s52/jfh1，s52病毒株的基因信息请见genbank基因登录号jf343784.2。
在本发明的一个优选地实施方式中，con1病毒株的se2蛋白序列如下：
con1se2(seqidno.1)
其编码多核苷酸序列如下：
ggcacatacgtgacaggcggcacaatggccaagaacaccctgggcatcaccagcctgttcagccccggcagcagccagaaaatccagctggtgaacaccaacggcagctggcacatcaaccggaccgccctgaactgcaacgactccctgaataccggcttcctggccgccctgttctacgtgcacaagttcaacagcagcggctgccccgagcggatggccagctgtagccctatcgatgccttcgcccagggctggggccctatcacctacaacgagagccacagcagcgaccagcggccctactgctggcactacgcccccagaccttgcggcattgtgcctgccgctcaggtctgcggccctgtgtactgcttcacccccagccccgtggtggtgggaaccaccgatagattcggcgtgccaacctacagctggggcgagaacgagacagacgtgctgctgctgaacaacaccagacccccccagggcaattggttcggctgcacctggatgaacagcaccggcttcaccaagacctgcggcggacccccctgcaacatcggcggcatcggcaacaagaccctgacatgccccaccgattgcttcagaaagcaccccgaggccacctacaccaagtgcggctctggcccctggctgacccccagatgcctggtgcactacccctaccggctgtggcactacccttgcaccgtgaacttcaccatcttcaaagtgcggatgtatgtgggcggagtggaacaccggctggaagccgcctgcaactggaccagaggcgagcggtgcaacctggaagatcgggacagaagcgag(seqidno.4)。
在本发明的一个优选地实施方式中，h77病毒株的se2蛋白序列如下：
h77se2(seqidno.2)
其编码多核苷酸序列如下：
gaaacccacgtcaccgggggaaatgccggccgcaccacggctgggcttgttggtctccttacaccaggcgccaagcagaacatccaactgatcaacaccaacggcagttggcacatcaatagcacggccttgaattgcaatgaaagccttaacaccggctggttagcagggctcttctatcaacacaaattcaactcttcaggctgtcctgagaggttggccagctgccgacgccttaccgattttgcccagggctggggtcctatcagttatgccaacggaagcggcctcgacgaacgcccctactgctggcactaccctccaagaccttgtggcattgtgcccgcaaagagcgtgtgtggcccggtatattgcttcactcccagccccgtggtggtgggaacgaccgacaggtcgggcgcgcctacctacagctggggtgcaaatgatacggatgtcttcgtccttaacaacaccaggccaccgctgggcaattggttcggttgtacctggatgaactcaactggattcaccaaagtgtgcggagcgcccccttgtgtcatcggaggggtgggcaacaacaccttgctctgccccactgattgcttccgcaaacatccggaagccacatactctcggtgcggctccggtccctggattacacccaggtgcatggtcgactacccgtataggctttggcactatccttgtaccatcaattacaccatattcaaagtcaggatgtacgtgggaggggtcgagcacaggctggaagcggcctgcaactggacgcggggcgaacgctgtgatctggaagacagggacaggtccgag(seqidno.5)
在本发明的一个优选地实施方式中，s52病毒株的se2蛋白序列如下：
s52se2(seqidno.3)
其编码多核苷酸序列如下：
gaaacatatgtcaccggtggcagtgtagctcatagtgccagagggttaactagcctttttagtatgggcgccaagcagaaactgcaattggtcaacaccaatggctcgtggcacatcaacagtactgccctgaactgcaatgagtccataaacaccgggttcatagctgggttgttttattaccataagttcaactctactggatgtcctcaaaggcttagcagctgcaagcccatcatttccttcaggcaggggtggggccccttgacagatgctaacatcaccggtccttctgatgatagaccgtattgctggcactacgcacctagaccttgtagtgttgtcccggcatcaagtgtctgcggccctgtgtactgcttcacaccatcgccagtggtcgtaggcactactgatatcaaaggcaagccgacctacaactggggtgagaatgagacagatgtgttcctgctggagtccctgcggcctcccagtggccggtggtttggatgcgcgtggatgaactccacggggttcctcaagacgtgtggagctcccccttgtaacatctatgggggtgagggggatcccgaaaatgagacagacctcttctgccccaccgactgcttcaggaaacatcctgaggccacatacagccggtgtggtgcggggccctggttgacacctcgctgcatggtcgactatccataccggctttggcattacccatgtacagtcaatttcacattgttcaaggtgaggatgtttgtgggcggatttgaacaccggtttaccgccgcttgtaactggaccaggggggagcgctgcaatatcgag(seqidno.6)
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)根据本发明的三价hcv疫苗，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包括有效量的根据本发明的活性成分。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的活性成分可以用来制备疫苗组合物，该疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)mf59(参见wo90/14837)，(b)saf，和(c)ribitm佐剂系统(ras)(ribiimmunochem，hamilton，mt)，(3)皂素佐剂；(4)freund完全佐剂(cfa)和freund不完全佐剂(ifa)；(5)细胞因子，如白介素(如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(m-cfs)、肿瘤坏死因子(tnf)等；(6)细菌adp-核糖基化毒素(如霍乱毒素ct，百日咳毒素pt或大肠杆菌热不稳定毒素lt)的脱毒变异体，参见例如wo93/13302和wo92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
(iii)给药途径和剂量
所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗hcv感染。
在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或vlp。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他亚型的hcv的免疫原(如病毒样颗粒)一起给予。
由于hcv不同型基因序列间的高度变异性和差异性，能够广泛抑制多型病毒传播的广谱疫苗研发也遇到了瓶颈。但越来越多的研究报道了抗hcv广谱性中和抗体的存在，除少数抗体表位位于包膜蛋白e1，大部分识别表位都位于其包膜蛋白e2上。因此设计一种能够诱导广谱性中和抗体产生的基于e2蛋白的hcv多价疫苗成为可能。基于以上背景，本发明人希望通过此项研究，开发针对中国主要流行毒株的具有广谱中和作用的多价疫苗，填补国内此项研究领域的空白。
本研究将hcv1b,1a及3a型截短包膜蛋白e2混合作为一种鸡尾酒免疫原免疫小鼠，在小鼠体内诱导出了高滴度的广谱中和抗体。与单价苗相比，多价苗弥补了单价苗对本型外其它毒株中和的不足，能够在小鼠体内诱导更有效的广谱性中和抗体。
丙型肝炎病毒(hcv)是世界范围内危害公共健康的重要问题，大量的慢性感染及以此为诱因的肝硬化和肝癌严重威胁了人类健康，然而目前并没有针对hcv的预防性疫苗。e2作为hcv病毒的包膜蛋白可与细胞表面受体cd81结合，从而介导病毒进入细胞。病毒的中和表位除少数位于e1，大部分位于e2上。本研究旨在开发一批高产量、易纯化，来源于多种株型且具有类似于病毒天然构象的hcve2蛋白，并通过合理的免疫程序将其配比为能够诱导广谱性中和抗体的hcv多价疫苗，成为预防hcv感染的有效手段。本发明人利用果蝇s2表达系统分别表达了来源于不同hcv株型的se2蛋白(solublee2,se2)，抗性筛选后获得转基因的稳定细胞株，每种细胞系产量均可达到50-100mg/l。将不同株型来源的se2分别分泌到上清中，纯化后分析。发现不同株型来源的se2均能与hcv受体cd81正确结合、并能被e2的构象抗体ar3a与线性抗体ap33所识别。由于1b为世界范围内流行最广泛的病毒型之一，本发明人首先以se2为免疫原、cpg和铝为佐剂免疫小鼠，根据四免后产生抗体的中和评价，从标准株con1、临床株pr26和pr79中选择con1株来源的se2作为1b型代表，与另两个重要感染型1a型h77株和3a型s52株来源的se2配比成三价苗。经不同的配比方式和免疫程序尝试，确定三株型来源se2平均配比、多次免疫的三价苗为最佳疫苗候选方案。
与来源于con1或h77或s52的单价苗相比，con1/h77/s52三价苗大幅提升了小鼠免疫血清对于囊括世界绝大多数地区最主要感染亚型的1a型h77病毒，1b型con1病毒，2a型jfh-1病毒和3a型s52病毒的半数中和倍数，其中前三种亚型ic50分别为1218，958.7及1250，后一种为445.6，同时对于其它亚型及临床适应株也具有较好的中和效果。该三价苗能在小鼠体内诱导出高效、广谱的中和抗体，极大提升了针对hcv主要流行亚型病毒的中和水平,作为世界上首个hcv多价疫苗研究，具有较大的开发潜力。
材料与方法
1细胞
果蝇schneider2(s2)细胞购于invitrogen公司，s2细胞置于添加10％胎牛血清(gibco)，1％双抗(gibco)的schneider’sdrosophilamedia(gibco)中或添加1％双抗(gibco)，1％l-谷氨酰胺(gibco)的express
2病毒
本研究所用到的所有hcv病毒如表1所示。hcv2a型病毒jfh-1按照现有方法制备(1)，简言之，10μgpuc-jfh1重组质粒通过xbai酶切线性化，回收线性dna产物后取1μg作为模版按megascriptt7kit(ambion)说明进行体外转录，纯化后溶于30μl无核酸酶超纯水，储存于-80℃冰箱备用。huh7细胞胰酶消化后以opti-mem重悬至细胞数1×107/ml，取400μl加入电转杯，加入10μg上述rna。将电击条件调至0.27kv,100ohms，950μf，进行电击，而后将细胞吸出加入完全dmem，37℃二氧化碳培养箱培养。传代至出现病变效应时开始收取细胞上清，收取的病毒上清测定滴度后分装储存于-80℃冰箱备用。突变株病毒jfh-1/d183按前述方法(2)。嵌合的hcv1b型病毒con1/jfh-1，1a型病毒h77/jfh-1，2a型病毒jc1，按前述方法制备(3,4)，嵌合病毒的core到ns2第一个跨膜区由相应病毒株的氨基酸序列构成，基因组其余部分来源于jfh-1。构建2-7型标准株嵌合病毒的重组质粒由universityofcopenhagen的dr.jensbukh馈赠，按上述方法电转扩增后收获，包括hcv2b型病毒j8/jfh1、3a型病毒s52/jfh1(i793s,k1404q)、4a型病毒ed43/jfh1(t827a,t977s)、5a型病毒sa13/jfh1(a1022g,k1119r)、6a型病毒hk6a/jfh1(f350s,n417t)以及7a型病毒qc69/jfh1。构建中国1b型临床株pr26c3mt、pr52b6mt、pr79l9和2a型临床株pr63嵌合病毒的重组质粒参考文献构建和保存(5,6)，并按上述方法电转扩增后收获。
表1.不同基因型hcvcc嵌合病毒标准株及临床适应株
3抗体
鼠抗hcvns5a单抗来源于abmart公司，人抗hcve2单抗ar3a(7)由thescrippsresearchinstitute的dr.denisburton提供。鼠抗hcve2单抗ap33由mrc-universityofglasgow的dr.arvindpatel惠赠(8)。鼠抗e2单抗1c9、1b4由本实验制备并保存，鼠抗his标签单抗购于abmarthrp标记山羊抗鼠igg，购于sigma，hrp标记山羊抗人igg二抗购于abcam.alexafluor-488标记山羊抗鼠igg二抗及alexafluor-555标记山羊抗鼠igg二抗购于invitrogen。
4质粒构建
昆虫细胞表达载体为pmt/bip/v5-hisa与筛选质粒pcoblast购自invitrogen公司。重组质粒pcdna3.1-ce1e2opti是由野生型的hcvcon1株结构蛋白core-e1-e2编码基因经密码子优化(geneart公司)后所构成。
经过优化的con1se2及野生型pr79se2,pr26se2,s52se2,h77se2基因序列分别以pcdna3.1-ce1e2opti及puc-s52,puc-h77,puc-pr79,puc-pr26为模版经特异性引物(见表2)的pcr扩增后,序列两端均带有ncoi和xbai两个酶切位点，将该序列插入昆虫表达载体pmt/bip/v5-hisa的ncoi和xbai酶切位点，得到携带目的基因的重组表达质粒。该质粒启动子为metallothioneinpromoter,后为bip信号肽序列有利于分泌型蛋白的表达，bip后连接目的基因序列，polyhistidine位于目的基因后，有助于蛋白的亲和纯化，此后为终止子序列。
表2.不同基因型se2基因序列扩增引物
5多价苗的表达与纯化
采用钙转方法在s2细胞中瞬时表达来自h77、con1、s52、pr79及pr26的se2。接种细胞3x106(1x106cells/ml)于六孔板中，28℃培养6～16个小时，当细胞密度达到2-4x106cells/ml时进行钙转。将36μl2mcacl2,19μg重组dna及水加至300μl配置成a液，300μl的2xhepes(50mmhepes,1.5mmna2hpo4,280mmnacl,ph7.1)配置成b液。将b液放置于震荡仪上，缓慢滴加a液于b液，并将此600μl混合液于室温下静置30～40min，均匀滴加混合液于细胞上。28℃培养16～24h后，将细胞800rpm，5min离心，完全培养基洗三遍以除去钙颗粒。将细胞放置于28℃培养72h至细胞密度2-4x106cells/ml，取部分细胞，加入5μm氯化铬诱导目的蛋白表达，并以蛋白质印迹等方法检测表达水平。若目的基因正常表达，则将1μgpcoblast筛选质粒与重组目的基因质粒按上述方法共转于s2细胞中，细胞密度至2-4x106cells/ml时，以25μg/ml杀稻瘟菌素筛选压筛选出阳性细胞并检测其目的基因表达。
将稳定表达se2的细胞系进行扩大培养。替换培养基为无血清的含1％双抗，1％l-谷氨酰胺和10μg/ml的杀稻瘟菌素的express
6多价苗的鉴定与分析
利用sds-page和westernblot对多价苗进行检测。待检蛋白样品与上样缓冲液混合均匀后，100℃煮沸10min，经12％sds-page电泳分析，考马斯亮蓝染色10min后，10％冰醋酸脱色。另一份样品经12％sds-page电泳后110v电压1.5h转到pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，1:1000稀释的鼠抗se2单抗1c9为一抗室温孵育2h，1:5000稀释的hrp标记的山羊抗鼠igg(sigma)为二抗室温作用1h，适量ecl化学发光试剂为底物，通过las4000扫描分析仪(fujifilm)获取westernblot结果。
7多价苗与中和抗体的结合
将h77、con1，s52se2及三种蛋白等质量混合而成的三价苗分别以起始总包被量200ng每孔进行2倍比稀释8个梯度后包被elisa96孔板，放置4℃冰箱包被过夜，5％脱脂奶粉37℃封闭1h，将ap33或ar3a两种中和抗体(mta见附件)分别按照1:1000稀释后每孔50μl与包被抗原37℃孵育3h，pbst洗4-5遍，晾干后分别加入稀释度为1:5000的hrp标记的抗鼠二抗以及稀释度为1:3000的hrp标记的抗人二抗，每孔为50μl，37℃孵育1h，pbst洗5遍，tmb显色，室温避光作用2分钟，1m磷酸终止反应后，thermoscientificvarioskanflash多功能读数仪测定样品在a450的吸光值。
8多价苗与受体结合试验
将人重组cd81蛋白(北京义翘神州有限公司)以起始包被量400ng进行2倍比稀释10个浓度梯度，将不同浓度梯度的cd81包被elisa96孔板，4℃冰箱过夜，5％脱脂奶粉37℃封闭1h后，以20μg/mlh77、con1、s52或三种蛋白等质量混合而成的三价se237℃孵育3h后，pbst洗涤5遍，以1c9(实验室制备hcve2特异性鼠单抗)或anti-his鼠单抗1:1000稀释与上述免疫原受体复合物37℃孵育3h后，pbst洗涤5遍，以hrp标记的羊抗鼠抗体1:5000稀释37℃孵育1h，pbst洗涤5遍，tmb显色，室温避光作用2分钟，1m磷酸终止反应后，thermoscientificvarioskanflash多功能读数仪测定样品在a450的吸光值。
9动物试验
分别以con1、pr26及pr79se250μg为免疫原，以铝500μg，cpg25μg为佐剂腹腔注射6-8周龄balb/c雌性小鼠，每组6只小鼠。第0周初次免疫，第2，4，12周加强免疫，共免疫四次。第三、四次免疫后两周分别从小鼠眼眶后静脉丛采血，将小鼠血液放置室温1h后，4℃静置过夜，待血清完全析出后，5000rpm，4℃离心30min后分离上层血清进行后续抗体效价测定。
分别以h77se230μg,con1se230μg,s52se230μg,及h77、con1、s52se2各10μg等质量混合为三价免疫原，以铝500μg，cpg25μg为佐剂腹腔注射6-8周龄balb/c雌性小鼠。每组6只小鼠，pbs组为对照组。免疫程序如前所述。
以h77、con1、s52se2按一定比例混合为多价免疫原并采取不同组合方式进行免疫，如表3所示。以铝500μg，cpg25μg为佐剂腹腔注射6-8周龄balb/c雌性小鼠。每组6只小鼠，pbs组为对照组。免疫程序如前所述。
表3.不同多价苗组合免疫程序
10血清抗体滴度检测
将小鼠血液放置室温1h后，4℃静置过夜，待血清完全析出后，5000rpm，4℃离心30min后分离上层血清，离心两遍后得到不含红细胞的血清。将h77、con1或s52se2蛋白以1μg/ml浓度、50μl/每孔包被elisa96孔板，4℃过夜，5％脱脂奶粉37℃封闭1h后，将补体灭活后的实验组血清以1:4000起始浓度进行2倍比稀释至1:8192000，pbs对照组则以起始浓度1:100进行2倍比稀释至204800，与包被抗原37℃孵育3h后，pbst洗涤5遍,1:5000稀释的hrp标记的山羊抗鼠igg为二抗室温作用1h后，pbst洗涤5遍，tmb显色，室温避光作用2分钟，1m磷酸终止反应后，以thermoscientificvarioskanflash多功能读数仪测定样品在a450的吸光值。取od值高于背景0.07-0.1左右值作为抗体的结合效价。经graphpadprism软件t-test检验统计各组之间的差异显著性。
11血清抗体的中和试验及ic50测定
将huh7细胞按每孔10000个细胞接种于96孔细胞培养板(nunc)中,37℃细胞培养箱培养12h。将小鼠血清1:40稀释于150μl细胞完全培养基并与hcvcc各型病毒株150μl(约50-200ffu)混匀后于37℃细胞培养箱孵育1h，将病毒血清复合物150μl加入huh7细胞上，37℃细胞培养箱培养孵育4-5h后，弃培养上清，换为细胞完全培养基。以pbs免疫组血清及不加血清组为对照。72h后，以4％多聚甲醛固定液固定细胞1h，pbs洗涤3遍，封闭液封闭1h后，加入1:1000稀释的抗hcvns5a鼠单抗30μl/孔，室温孵育1h，pbs洗涤4遍,加入1:5000hochest染核抗体和1:1000的alexafluor488荧光标记抗鼠二抗混合液50μl/孔，室温孵育1h，pbs洗涤4遍后，在荧光显微镜(leica)下对每孔的荧光斑点数进行计数。以不加血清组的荧光斑点数为基准，中和效果(％)＝(不加血清组的荧光斑点数-相应孔中的荧光斑点数)/不加血清组的荧光斑点数*100％。经graphpadprism软件t-test检验统计各组之间的中和差异显著性。
为测定半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,ic50)，将各组6只小鼠的血清样品等体积混合后以起始稀释浓度1:20进行2倍比稀释，按上述中和实验方法测定每组对不同病毒的半数抑制浓度。经graphpadprism软件xy拟合曲线后，统计其ic50值。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明开发了一批高产量、易纯化，来源于多种株型且具有类似于病毒天然构象的hcve2蛋白，并通过合理的免疫程序将其配比为能够更有效诱导广谱性中和抗体的hcv多价苗，为hcv预防性疫苗的开发提供更新更有效的策略；
(2)与三种单价苗相比，多价苗组免疫血清对于1a型h77病毒、1b型con1病毒、2a型jfh-1病毒、3a型s52病毒以及2a型临床适应株pr63cc的ic50都有了跨跃式的提升，提升倍数呈3-20倍不等。其中前三种ic50水平达到了稀释度1000左右，后两种也达到了约400。而据统计在中国90％以上的hcv感染都是这四种亚型造成的，这四种亚型也是除非洲外世界绝大多数地区最为主要的感染亚型。因此与单价苗con1se2、h77se2及s52se2相比，此三价苗极大提升了针对世界主要流行亚型hcv病毒的中和水平及中和广谱性，具有更为广阔的开发前景。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1不同株型hcvse2在果蝇s2细胞中的表达与纯化
用于在果蝇s2细胞中表达hcvse2蛋白的重组质粒pmt/bip/se2-v5-hisa如图1a所示，携带h77se2，s52se2，pr79se2和pr26se2野生型编码基因及con1se2密码子优化的基因，所编码的目标蛋白均为e2蛋白的胞外区(包括第384-661位氨基酸)。将携带目的基因的质粒分别瞬时转染果蝇s2细胞，转染后48h取出2×106细胞加入终浓度为5μm的氯化铬诱导表达，72h后收取上清，以实验室制备的hcv特异性抗体1c9进行westernblot检测,所得结果如图1b,特异性抗体检测到了目的条带且不同型se2的大小略有差异，可能为糖基化修饰不同所致。将pmt-bip/se2-v5-hisa与pcoblast共转果蝇s2细胞，经过杀稻瘟菌素筛选，获得稳定细胞株。将细胞株分别置于3l旋转摇瓶中扩大培养，当细胞密度达到4×106个/ml时加入终浓度为5μm的氯化铬诱导表达，第8天离心收获上清，经超滤浓缩、镍柱纯化后，通过12％sds-page胶考马斯亮蓝染色，结果如图1c显示，纯化的se2蛋白条带单一，纯度较高，分子量约为46-50kda。
实施例2不同株型hcvse2蛋白的特性分析
为了分析纯化后h77、con1及s52来源se2蛋白的相关特性，本发明人利用hcv中和抗体及hcv受体的结合实验对蛋白关键位点的结构和结合活性进行了分析。
首先以不同株型来源的se2蛋白包被elisa板，利用识别cd81结合位点的构象抗体ar3a和线性抗体ap33进行检测。如图2a-b，两种抗体对于h77、con1或s52来源的se2都能较好的识别，且此种识别呈现剂量正相关。该结果提示不同株型的se2蛋白都能正确折叠并形成类似构象。但仔细比较各型se2与抗体的结合情况可以发现，抗体对不同株型的识别效果之间仍存在一定差异，提示不同株型在相关位点附近的结构可能有所不同。其中ap33针对s52se2的结合率明显低于其它二株，提示s52se2在此位点附近结构可能存在其特异性，与其它两株相比存在明显差异。而将三种se2等量混合后进行实验，结合曲线处于三者中平均水平。
在受体结合功能方面，不同株型se2都能与cd81结合，结合曲线基本相似(图2c-d)。表明三种株型se2均接近病毒表面e2的天然构象
以上结果侧面佐证了不同型se2产生抗体针对的表位各有不同，提示着将不同株型se2结合起来设计免疫程序以应对不同株型病毒的潜在优势。
实施例3con1se2免疫血清与同型pr26c6mse2及pr79l9se2相比具有更好的广谱中和活性
1b型是世界范围内感染最为广泛和常见的hcv亚型，在中国56.8％的丙型肝炎感染来源于1b型，因此本发明人首先考虑采用来源于1b型的se2作为开发hcv疫苗的候选项。
以纯化的1b型标准株con1或临床株pr26c6m、pr79l9来源的se2蛋白为免疫原，铝加cpg为佐剂免疫小鼠。如图3a所示，相比对照组，无论con1、pr26c6m或pr79l9来源的se2均可在balb/c小鼠中诱导出水平相近的高滴度se2特异性抗体。通过体外中和实验，检测se2免疫血清对hcv病毒(hcvcc)的中和效果。如图3b所示，在1：40的稀释比例下，三组免疫血清对不同株型的hcv病毒具有不同程度中和效应。除对1b型的con1、pr26c6m及pr79l9病毒本身，对于2b型的j8病毒，3a型的s52病毒，4a型的ed43病毒及1b型的临床株pr52b6mt，con1来源se2免疫组血清与其他二株相比具有更好的中和效果。而对于1b型的三株病毒本身，con1和pr79l9来源的se2免疫血清均对其本身中和效果最佳；对于pr26c6m病毒，con1和pr26c6mse2免疫血清的中和效果优于pr79l9。总体而言，与同为1b型的pr26c6m和pr79l9相比，con1来源的se2能够在小鼠体内诱导出具有更好广谱中和活性的抗体，因此con1se2可用于进一步的hcv疫苗开发。
实施例4h77、con1、s52来源se2混合的三价苗免疫血清具有更好的广谱中和活性
从图3b中可以看出，con1来源se2免疫血清对于许多亚型病毒都有较好的中和效果，但对于1a型h77、3a型s52等株中和效果还存在一定的提升空间。由于1a和3a型均为世界范围内感染较为普遍的hcv亚型：其中1a型在整个北美洲、拉丁美洲、西欧、东南亚和澳洲都有较高的感染率，而3a型则是南亚地区主要感染亚型并在欧洲、澳洲、拉丁美洲、中亚和东南亚有着较高的感染率，因此在现有基础上提高免疫血清对于1a和3a两种亚型的中和率将使hcv的广谱疫苗更加完善、能够应对更为广泛的挑战。
为此，本发明人尝试将h77和s52来源的se2加入到已有的con1来源se2中作为免疫原，铝加cpg为佐剂，pbs组作为对照，共同免疫小鼠。由图4a可知，与pbs组相比，在相等的剂量下h77、con1、s52来源的se2无论分别作为单价疫苗，还是等量混合作为三价疫苗，均可在balb/c小鼠中诱导出高滴度的se2特异性抗体。但三价苗产生的抗体与con1se2及s52se2蛋白的结合能力显著高于非con1se2或s52se2本身来源的另外两种单价苗。这说明三种免疫原的构象可能存在各自特性，但三价苗弥补了每种免疫原的不足，产生的分别针对三种免疫原的抗体水平较为平衡。
第四次免疫后，通过体外中和实验，检测se2免疫血清对hcv病毒(hcvcc)的中和效果。图4b显示，在1：40的稀释比例下，与pbs组相比，三组免疫血清对不同株型的hcv病毒具有不同程度中和效应。对于1a型的h77病毒、1b型的con1病毒、2a型的jfh-1病毒和jc1病毒、3a型的s52病毒、4a型的ed43病毒、5a型的sa13病毒、6a型的hk6a病毒，三价苗免疫血清与其他三种单价苗单独免疫血清相比，均具有类似或更好的中和效果，尤其极大程度提升了中和血清对于1a型h77病毒的中和率。
为了更细致、深入地分析多价苗与三种单价苗相比在中和水平上存在的差异，本发明人对血清采用不同稀释度分别测定中和率以得到各组别的半数中和倍数ic50。表4显示，与三种单价苗相比，多价苗组免疫血清对于多种亚型标准株和临床株病毒均有不同程度的提升。值得注意的是，与三种单价苗相比，多价苗组免疫血清对于1a型h77病毒、1b型con1病毒、2a型jfh-1病毒、3a型s52病毒以及2a型临床适应株pr63cc的ic50都有了跨跃式的提升，提升倍数呈3-20倍不等。其中前三种ic50水平达到了1000倍左右，后两种也达到了约400倍。而据统计在中国90％以上的hcv感染都是这四种亚型造成的，这四种亚型也是除非洲外世界绝大多数地区最为主要的感染亚型。因此与单价苗con1se2、h77se2及s52se2相比，此三价苗极大提升了针对主要流行亚型hcv病毒的中和水平，具有更为广阔的开发前景。
表4
实施例5h77、con1、s52来源se2混合免疫的最佳方案
为了寻找将h77、con1、s52来源se2作为混合免疫原免疫小鼠的最佳方案，本发明人还尝试了不同的免疫剂量和程序。如表3所示，采用不同的免疫程序，以铝加cpg为佐剂，pbs组为对照，免疫小鼠。由图5a可知，与pbs组相比，四种不同的免疫程序均可在balb/c小鼠中诱导出高滴度的se2特异性抗体。
第四次免疫后，通过体外中和实验，检测se2免疫血清对hcv病毒(hcvcc)的中和效果。图5b显示，在1：40的稀释比例下，与pbs组相比，四组不同组合方式的免疫血清对不同株型的hcv病毒均具有不同程度的中和效应。对于1a型的h77、1b型的con1及2a型的jfh1等病毒株，con1、h77、s52来源se2等量混合组(group1)的免疫血清与其他三组免疫血清相比均具有类似或更好的中和效果。以上结果显示，con1、h77、s52来源se2等量混合组成的三价苗在免疫小鼠后能够产生高滴度的特异性抗体，与三种来源的se2单价苗相比，能够诱导产生更为有效和广谱的中和抗体，因此作为hcv的广谱性候选疫苗具有较大的开发潜力。
讨论
此项工作的主要目的在于开发一批高产量、易纯化，来源于多种株型且具有类似于病毒天然构象的hcve2蛋白，并通过合理的免疫程序将其配比为能够更有效诱导广谱性中和抗体的hcv多价苗，为hcv预防性疫苗的开发提供更新更有效的策略。
本发明人利用果蝇s2细胞作为生产不同株型hcvse2蛋白的工具系统。s2细胞是一种被广泛应用的重组外源蛋白表达系统，该系统具有生长速度快、易于高密度和大规模培养、产量高、无血清培养、分泌表达、易于纯化等特点(9)。本发明人在se2末端加入了6×his标签，通过对试验条件的优化及镍柱纯化，纯化后三种基因亚型的产量均可达到50-100mg/l细胞培养上清，是已报道的hek293t表达的se2产量的50倍。同时，s2细胞中的糖基化相对哺乳动物细胞而言较为简单。由于糖基化可以掩盖中和表位从而帮助hcv逃逸中和抗体的识别，糖基化位点突变的病毒对中和抗体更为敏感，因此得益于较为简单的糖基化，s2细胞来源的se2有可能暴露出更多的中和表位，作为免疫原时更有利于诱导出中和抗体。
据统计，1b型是世界范围内感染最为广泛和常见的hcv亚型，在中国56.8％的丙型肝炎感染来源于1b型。因此本发明人采用1b型标准株con1来源的se2作为首选免疫原，从广谱性看，con1来源的se2能够很好的中和1b型本身的病毒，对其他株型的病毒也存在一定程度的交叉保护，但1a、3a等型的交叉保护水平较低。由于1a型是目前北美主要流行亚型，3a型与脂肪肝相关、目前广泛流行于南亚、澳洲和欧洲等地，考虑到这两种亚型不可忽略的重要性，本发明人增加1a型h77和3a型s52来源的两种se2，与原有con1来源se2进行协同免疫。
比较不同的混合免疫程序本发明人发现，三种se2等量混合、重复免疫的三价苗能够获得最好的效果。与单价苗相比，此种三价苗大幅提升了小鼠免疫血清对于1a型h77病毒，1b型con1病毒，2a型jfh-1病毒和3a型s52病毒半数中和倍数，其中前三种亚型都达到了1000倍左右，后一种也达到了400余倍，同时对于其它亚型及临床适应株也具有较好的中和效果。而据统计，上述四种亚型囊括了除非洲外世界绝大多数地区最主要的感染亚型。因此将h77和s52来源se2加入con1来源se2中混合制成的多价苗能在小鼠体内诱导出更高效的广谱中和抗体，对其他亚型也因交叉保护产生了较好的中和效果。另外，如图5b所示，旨在诱导针对不同株型间单个保守表位抗体产生的group2效果明显不如平衡配比的con1/h77/s52三价苗(group1)，这意味着con1/h77/s52三价苗诱导产生的并非是单个保守表位，从而也规避了病毒点突变造成疫苗效果急剧减弱的可能性。总之，与来源于con1或h77或s52的单价苗相比，con1/h77/s52三价苗极大地提升了针对hcv主要流行亚型病毒的中和水平,作为世界上首个hcv多价疫苗，具有较大的开发潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献:
1.zhongj,gastaminzap,chengg,kapadias,katot,burtondr,wielandsf,uprichardsl,wakitat,chisarifv.2005.robusthepatitiscvirusinfectioninvitro.procnatlacadsciusa102:9294-9299.
2.zhongj,gastaminzap,chungj,stamatakiz,isogawam,chengg,mckeatingja,chisarifv.2006.persistenthepatitiscvirusinfectioninvitro:coevolutionofvirusandhost.jvirol80:11082-11093.
3.pietschmannt,kaula,koutsoudakisg,shavinskayaa,kalliss,steinmanne,abidk,negrof,dreuxm,cossetfl,bartenschlagerr.2006.constructionandcharacterizationofinfectiousintragenotypicandintergenotypichepatitiscviruschimeras.procnatlacadsciusa103:7408-7413.
4.may,yatesj,liangy,lemonsm,yim.2008.ns3helicasedomainsinvolvedininfectiousintracellularhepatitiscvirusparticleassembly.jvirol82:7624-7639.
5.luj,taow,lir,xiangy,zhangn,xiangx,xieq,zhongj.2013.constructionandcharacterizationofinfectioushepatitiscviruschimeracontainingstructuralproteinsdirectlyfromgenotype1bclinicalisolates.virology443:80-88.
6.luj,xiangy,taow,liq,wangn,gaoy,xiangx,xieq,zhongj.2014.anovelstrategytodeveloparobustinfectioushepatitiscviruscellculturesystemdirectlyfromaclinicalisolate.jvirol88:1484-1491.
7.lawm,maruyamat,lewisj,giange,tarraw,stamatakiz,gastaminzap,chisarifv,jonesim,foxri,balljk,mckeatingja,knetemannm,burtondr.2008.broadlyneutralizingantibodiesprotectagainsthepatitiscvirusquasispecieschallenge.natmed14:25-27.
8.owsiankaa,tarraw,juttlavs,lavilletted,bartoschb,cossetfl,balljk,patelah.2005.monoclonalantibodyap33definesabroadlyneutralizingepitopeonthehepatitiscviruse2envelopeglycoprotein.jvirol79:11095-11104.
9.moraesam,jorgesa,astrayrm,suazoca,calderonriquelmece,augustoef,tonsoa,pamboukianmm,piccolira,barralmf,pereiraca.2012.drosophilamelanogasters2cellsforexpressionofheterologousgenes:fromgenecloningtobioprocessdevelopment.biotechnoladv30:613-628.