番茄红素顺式异构体在制备卵巢癌治疗药物中的应用的制作方法

本发明涉及番茄红素异构体的一种新用途，具体涉及番茄红素顺式异构体在制备卵巢癌ho-8910细胞增殖和凋亡影响药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

番茄红素(lycopene，lyp)具有猝灭活性氧、消除人体自由基，预防心脏病、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症、抗老化、保护皮肤等生理功能。流行病学研究表明，血液中lyp浓度与前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胃肠癌、乳腺癌、皮肤癌、膀胱癌等的发生率呈负相关。许多体外细胞实验都证实了这一点，lyp对食管癌细胞系(eca9706)有抑制生长作用，对人前列腺癌pc-3细胞和乳腺癌mda-mb-231细胞均有抑制增殖和诱导凋亡作用，对宫颈癌hela细胞及小鼠前胃组织癌变也有一定抑制作用。但lyp对具高发病率的卵巢癌是否有抑制作用在本发明人研究论文见刊前尚未见报道。

lyp可降低乳腺癌细胞丝裂原的活性，抑制细胞周期停滞于g1期至s期，lyp可以增强细胞间隙连接通讯(gjic)功能，促进吞噬细胞、淋巴细胞间的相互作用，通过分泌细胞活化因子活化细胞，最终表现为对吞噬能力及淋巴细胞转化的促进，增强免疫功能进而诱导肿瘤细胞凋亡。2012年natuer发表的一份研究报告报道：乳腺癌遗传分析显示其致癌原因与卵巢癌相似。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供番茄红素顺式异构体在制备卵巢癌治疗药物中的应用。

番茄红素结构式

番茄红素，分子式c40h56，相对分子质量536.85，是膳食中一种重要的类胡萝卜素，主要存在于番茄及其制品、西瓜、石榴、秋橄榄和紫色葡萄柚中。天然来源的番茄红素主要以全反式形式存在，是最稳定的结构。在人类血浆中，番茄红素含量为0.2-1.0μmol/l，主要以顺式构型存在，反式构型只占41％。国外研究证明，顺式番茄红素更容易被人体吸收，也具有更高的生物活性。

国内外关于番茄红素与癌的关系文献中，对顺、反异构体的作用差异研究尚未见报道。由此，发明人首次提出假说：由反式番茄红素可异构化得到的顺式番茄红素，且二者对人卵巢癌ho-8910细胞抑制增殖与诱导凋亡作用存在差异性。本发明中，运用细胞实验证实了上述假说，初步研究结果提示，含高比例顺式的lyp体外抑制ho-8910细胞的作用比全反式lyp更强一些，且二者浓度在10μg·ml^-1和20μg·ml^-1时，抑制率和凋亡率比较有显著性差异。

顺式番茄红素采用由全反式番茄红素异构化制备，参照pierrelambelet等的方法进行顺式化处理：称取购自的番茄红素粉末适量，用经膜过滤的乙酸乙酯溶液溶解，制成1mg·ml^-1的溶液，避光100℃水浴回流5h，在4℃条件下放置12h，过滤，去除结晶(i号药，全反式番茄红素)，滤液减压蒸发至干，得到红色针状晶体(ii号药，顺式番茄红素粉末)。

番茄红素顺式异构体目前尚未用于制备药物，保健品的剂型为胶囊剂和片剂。

具体实施方式

1材料与方法

1.1实验材料

番茄红素粉末(纯度90％)(华北制药股份有限公司)

ho-8910细胞株(中南大学湘雅医院细胞中心)

四氮唑盐(sigma公司)

0.4％台盼蓝(gibco公司)

rpm-1640(gibco公司)

新生小牛血清(杭州四季青)

多西他赛注射液(doc，恒瑞医药)

二甲基亚砜(dmso)

乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)

1.2顺式番茄红素的合成与分离

参照pierrelambelet等的方法进行顺式化处理：称取购自华北制药公司的番茄红素粉末适量，用经膜过滤的乙酸乙酯溶液溶解，制成1mg·ml^-1的溶液，避光100℃水浴回流5h，在4℃条件下放置12h，过滤，去除结晶(i号药)，滤液减压蒸发至干，得到红色针状晶体(ii号药)。

番茄红素油溶液的制备与紫外光谱扫描：按文献^[5]方法，分别称取i、ii号药及番茄红素粉末各0.0200g置100ml量瓶中，各瓶先加入dmso0.5ml，再加入葵花籽油稀释至刻度，摇匀，制成储备液。精密量取储备液1ml加葵花籽油定容至100ml量瓶中，摇匀，于200～600nm处扫描紫外吸收光谱。

将i、ii号药油溶液通过hplc分离：按文献方法，将i、ii号药油溶液通过hplc分离检测纯度，色谱条件为色谱柱：cosmosilcholester柱(4.6mm×250mm，5um)，流动相为四氢呋喃∶乙腈＝15∶85(v/v)，进样量20ul，流速1ml·min^-1，柱温15℃，检测波长472nm。以番茄红素粉末和i号药作为对照品，ii号药作为供试品，均制成含番茄红素0.1mg·ml^-1的对照品和供试品溶液。

1.3ho-8910细胞的培养及分组

用含10％小牛血清的rpmi1640培养基于37℃、5％co2饱和湿度下培养。培养基中细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。实验设9个组(1)空白对照组：仅含培养液；(2)溶剂对照组：含0.5％dmso的培养液；(3)ii号药低剂量组：顺式番茄红素含量约5μg·ml^-1；(4)ii号药中剂量组：顺式番茄红素含量约10μg·ml^-1；(5)ii号药高剂量组：顺式番茄红素含量约20μg·ml^-1；(6)i号药低剂量组：反式番茄红素含量约5μg·ml^-1；(7)i号药中剂量组：反式番茄红素含量约10μg·ml^-1；(8)i号药高剂量组：反式番茄红素含量约20μg·ml^-1；(9)阳性药对照组：终浓度为0.2μg·ml^-1的doc溶液。

1.4ho-8910细胞生长曲线的测定

收集对数生长期ho-8910细胞5×10⁵/l接种于24孔培养板中，每孔1ml，然后每孔分别加入1.3项下各组溶液，置37℃、5％co2培养箱中培养，并在24、48、72、96、120h作细胞计数。计数时，用0.4％台盼蓝检查细胞存活率在95％以上。每组3个复孔，取其平均值绘制生长曲线。

1.5mtt法

取对数生长期ho-8910细胞制成1×10⁵个/l的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后每孔分别加入1.3项下各组溶液，总体积为每孔200ul，每一剂量设4个复孔，于48h后，每孔加入5mg/mlmtt20μl继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)100μl，充分混匀，酶标仪(ex-800)在570nm处测吸光度(a)值，实验重复3次。计算平均a值和抑制率：抑制率(inhibitory，ir)＝[(溶剂对照组a值-实验组a值)/溶剂对照组a值]×100％。

1.6流式细胞仪pi法检测顺、反异构番茄红素葵花籽油溶液对人卵巢癌ho-8910细胞凋亡率差异取对数生长期ho-8910细胞制成1×10⁶个/l的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，每孔分别加入1.3项下各组溶液，培养48h后，收集细胞，pbs洗涤，制成单细胞悬液，用70％的冰乙醇4℃固定12h，用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min，facsort流式细胞仪进行周期分析，低于g1期dna含量细胞为凋亡细胞。

1.7统计学分析

数据以表示，用spss11.0软件作统计分析，两样本均数比较采用t检验，以p＜0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1i、ii号药的定性鉴别：通过紫外光谱图的对比，i号药与番茄红素粉末可认定为全反式番茄红素，ii号药中出现了文献中报道的362nm处的顺式峰。

2.2i、ii号药的纯度测定：通过hplc法分离检测纯度，利用外标法定量计算，以番茄红素粉末作为对照品，求得i号药中全反式lyp含量为95.82％；以i号药作为对照品，求得ii号药中顺式lyp含量为79.53％。

2.3顺、反异构番茄红素葵花籽油溶液对人卵巢癌ho-8910细胞生长抑制曲线的比较

空白对照组与溶剂对照组细胞生长一致，表明0.5％dmso对细胞的生长无影响；i号药与ii号药各剂量组及阳性药对照组的细胞生长与空白对照组相比均明显受到抑制；各实验组于所设浓度范围内，随着剂量的增大其抑制作用增强；二个高剂量组对细胞的生长抑制作用均较阳性药对照组明显增强；i号药低剂量组对细胞的生长抑制作用与ii号药相比无明显差异，但中、高剂量i号药组较ii号药组抑制细胞生长作用弱。见图1。

2.4顺、反异构番茄红素葵花籽油溶液对人卵巢癌ho-8910细胞增殖抑制率比较

溶剂对照组与空白对照组的吸光度相比差异无显著性(p＞0.05)，说明0.5％dmso对细胞生长无影响。番茄红素各实验组及阳性药对照组与空白对照组相比差异有极显著性(p＜0.01)。ii号药与i号药中、高剂量组分别对应比较，结果具有显著性差异(p＜0.05)。二个高剂量组与与阳性药对照组相比有显著差异(p＜0.05)。ii号药低、中、高剂量组对ho-8910细胞增殖抑制率分别为17.25％、24.13％、62.03％；i号药低、中、高剂量组对ho-8910细胞增殖抑制率分别为16.86％、17.57％、54.05％；阳性药对照组对ho-8910细胞增殖抑制率为44.5％。见表1。

表1顺、反异构番茄红素对人卵巢癌ho-8910细胞生长的抑制作用

注：与空白对照组比较，^ap＜0.01；与i号药中剂量组比较，^bp＜0.05；与i号药高剂量组比较，^cp＜0.05；与doc0.2μg·ml^-1组比较，^dp＜0.05。

2.5顺、反异构番茄红素葵花籽油溶液对人卵巢癌ho-8910细胞凋亡影响的比较

溶剂对照组与空白对照组的细胞凋亡率相比差异无显著性(p＞0.05)。番茄红素各实验组及阳性药对照组与空白对照组相比差异有极显著性(p＜0.01)。ii号药与i号药中、高剂量组分别对应比较，结果具有显著性差异(p＜0.05)(p＜0.05)。高剂量组细胞凋亡率高于阳性药对照组，差异有显著性(p＜0.05)。ii号药低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为11.5％、29.9％、39.7％；i号药低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为11.8％、23.1％、32.4％；阳性药对照组细胞凋亡率为24.6％。见图2。pi检测凋亡细胞散点图见图3。

近年来研究发现，lyp分子从反式构型变为顺式构型时，颜色变浅，熔点降低，吸收峰发生偏移，热处理可使番茄汁中的cis-lyp显著增加。本实验异构过程与文献相符。该细胞实验结果显示，含高比例顺式lyp体外抑制ho-8910细胞的作用比全反式lyp更强一些，且二者浓度在10μg·ml^-1和20μg·ml^-1时，抑制率和凋亡率比较有显著性差异。

顺、反异构番茄红素葵花籽油溶液对人卵巢癌ho-8910细胞生长抑制曲线和凋亡影响的比较见说明书附图。图1是顺、反异构番茄红素抑制ho-8910细胞的生长曲线图，图2是顺、反异构番茄红素对人卵巢癌ho-8910细胞凋亡率影响的图，分组情况为：1.空白对照组，2.溶剂对照组，3.ii号药低剂量组，4.ii号药中剂量组，5.ii号药高剂量，6.i号药低剂量组，7.i号药中剂量组，8.i号药高剂量组，9.doc0.2μg·ml^-1组。分析比较情况为：与空白对照组比较，^ap＜0.01；与i号药中剂量组比较，^bp＜0.05；与i号药；高剂量组比较，^cp＜0.05；与doc0.2μg·ml^-1组比较，^dp＜0.05。图3是凋亡细胞散点图，分组情况为：1.空白对照组，2.溶剂对照组，3.ii号药低剂量组，4.ii号药中剂量组，5.ii号药高剂量，6.i号药低剂量组，7.i号药中剂量组，8.i号药高剂量组，9.doc0.2μg·ml^-1组。