咖啡酸肉桂酯在制备预防或治疗脑缺血性损伤的药物、保健品或食品中的应用的制作方法

本发明涉及天然产物咖啡酸肉桂酯的应用，尤其涉及咖啡酸肉桂酯在制备预防或治疗脑缺血性损伤药物、食品或保健品中的新应用。

背景技术：

脑缺血性损伤是继癌症和心脏系统疾病的第三大类疾病，严重影响着人类的健康。大脑缺血后，最常用的救治方法就是尽快回复大脑的血流供应，这也是目前最有效的救治方法，因为这样能尽快使神经元恢复功能，但是有些时候，大脑缺血一定时间后，恢复血液的供应，大脑功能不但不恢复，还有可能出现更加严峻的损伤，我们将这样的现象叫做脑缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)。

脑缺血再灌注损伤的发病机制相当复杂，涵盖了很多的病理和生理过程，目前公认的发生机制主要有自由基学说、免疫炎症机制、NO学说、钙超载学说、兴奋性氨基酸学说、细胞凋亡等。复杂的发病机制限制了防治脑缺血再灌注损伤药物的开发。

咖啡酸肉桂酯(Caffeic Acid Cinnamyl Ester)，存在于我国蜂胶中，为白色针状结晶，分子式为C₁₈H₁₆O₄，分子量为296，结构如下：

蜂胶中咖啡酸苯乙酯活性成分作用机制的研究是目前研究的热点。咖啡酸酯类含有儿茶酚结构，均具有明显的生物活性；但是，蜂胶中比咖啡酸苯乙酯含量更高的咖啡酸肉桂酯的生物活性及在药物、保健食品或食品中的应用鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于保护咖啡酸肉桂酯在制备预防或治疗脑缺血性疾病药物、保健品或食品中的应用。

本发明所述咖啡酸肉桂酯为一种已知化合物，可从蜂胶中分离得到，具体的获取手段为现有技术，本发明对此不作特别限定。

本发明所述脑缺血性损伤包括：脑缺血再灌注损伤、氧糖剥夺再灌注损伤或两种损伤共同存在。

本发明所述的脑缺血再灌注损伤病生理过程是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应，涉及脑细胞能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤及神经细胞凋亡等。咖啡酸肉桂酯可以从拮抗炎性反应、减少氧化应激损引起的神经细胞损伤等环节预防或治疗缺血再灌注损伤。

本发明通过运用OGD/R致损小鼠神经母细胞(N2a细胞)模型模拟了脑缺血性损伤，该模型为经典的脑缺血再灌注体外细胞模型，可在离体细胞水平模拟整体缺血再灌注损伤。本发明通过实验数据确定了咖啡酸肉桂酯在氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤中对于受损神经的保护作用及其作用机制。

所述神经细胞损伤可能由细胞内超氧化物歧化酶1活性下降、细胞内过氧化氢酶活性下降、细胞内谷胱甘肽过氧化物酶1活性下降、细胞内一氧化氮含量上升、细胞内一氧化氮合酶活性上升中的一种或多种情况引起。

本发明通过大量实验表明：给予咖啡酸肉桂酯对OGD/R致损N2a细胞有理想的神经保护作用，可改善致损神经细胞的存活率，通过增加超氧化物歧化酶1(SOD1)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)的活性，并降低细胞内一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)活性使得一氧化氮(Nitric Oxide,NO)含量减少，实现抗脑缺血再灌注损伤的作用，且其活性随着剂量的增加而增强。所述实验中以川芎嗪为阳性对照用来比对咖啡酸肉桂酯的活性。川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，其化学结构为四甲基吡嗪(C₈H₁₂N₂)，是临床上治疗脑卒中等脑血管疾病的盐酸川芎嗪注射液和盐酸川芎嗪复方丹参注射液的主要成分，对大鼠脑缺血再灌注损伤起抑制作用，对急性缺血脑血管疾病有治疗效果。

基于大量的实验研究，本发明优选通过保护神经细胞实现对脑缺血性损伤的预防或治疗。其中，所述神经细胞优选为神经元和/或神经胶质细胞。咖啡酸肉桂酯通过增加细胞内超氧化物歧化酶1的活性、增加细胞内过氧化氢酶的活性、增加细胞内谷胱甘肽过氧化物酶1的活性、降低细胞内一氧化氮含量和/或降低细胞内一氧化氮合酶的活性实现对神经细胞的保护。

本发明所述药物的活性成分可以为单独的咖啡酸肉桂酯成分，也可以为包括咖啡酸肉桂酯的组合物。其中，所述组合物中除咖啡酸肉桂酯外，可包括其它对脑缺血疾病具有预防和治疗作用的成分，如川芎嗪、丹参等，多种成分以适当的比例配伍使用，发挥协同作用，可以进一步提高预防或治疗效果。

具体而言，所述药物可由活性成分单独制成，或由活性成分和药学上可接受的载体制成。所述药学上可接受的载体优选为药学领域常规的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

在实际应用中，所述药物为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、注射剂或冻干粉针。由于快速用药对脑缺血性损伤、尤其是急性脑血管疾病的治疗效果有显著影响，当咖啡酸肉桂酯用于治疗脑缺血性损伤时，所述药物的剂型优选为注射剂。

本发明所述的食品涵盖了多种可用形式，包括但并不局限于固态营养食品和液体饮品，具体咖啡酸肉桂酯的加入形式和食品的制备为本领域技术人员所掌握，本发明不做特殊限定。

本发明所述的保健品同样涵盖了多种可用形式，包括但并不局限于固态保健品和液体保健品，具体咖啡酸肉桂酯的加入形式和保健品的制备为本领域技术人员所掌握，本发明不做特殊限定。

本发明同时保护一种含有咖啡酸肉桂酯的脑缺血再灌注抑制剂。

本发明所述抑制剂的活性成分可以为单独的咖啡酸肉桂酯成分，也可以为包括咖啡酸肉桂酯的组合物。具体而言，所述抑制剂可由活性成分单独制成，或由活性成分和药学上可接受的载体制成。所述药学上可接受的载体优选为药学领域常规的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。在实际应用中，所述抑制剂可为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、注射剂或冻干粉针。

本发明还保护一种包含咖啡酸肉桂酯的神经细胞保护剂。优选地，所述神经细胞保护剂通过增加细胞内超氧化物歧化酶1的活性、增加细胞内过氧化氢酶的活性、增加细胞内谷胱甘肽过氧化物酶1的活性、降低细胞内一氧化氮含量和/或降低细胞内一氧化氮合酶的活性实现对神经细胞的保护。

本发明所述保护剂的活性成分可以为单独的咖啡酸肉桂酯成分，也可以为包括咖啡酸肉桂酯的组合物。具体而言，所述保护剂可由活性成分单独制成，或由活性成分和药学上可接受的载体制成。所述药学上可接受的载体优选为药学领域常规的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。在实际应用中，所述保护剂可为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、注射剂或冻干粉针。

本发明通过系统试验发现了咖啡酸肉桂酯对缺血性疾病的预防或治疗作用，为中国蜂胶在脑缺血性损伤预防方面的使用效果提供了单体活性化合物的理论依据，为咖啡酸肉桂酯在预防脑缺血性损伤方面的应用提供了具体的实验数据，具有极大的医学意义、社会意义和经济意义。

附图说明

图1为咖啡酸肉桂酯对OGD致损N2a细胞存活率的影响示意图(n＝3，纵坐标为存活率，单位为：％)；

图2为咖啡酸肉桂酯对OGD致损N2a细胞CAT活性的影响示意图(n＝3，纵坐标为CAT活性，单位为：U/mg)；

图3为咖啡酸肉桂酯对OGD致损N2a细胞SOD1活性的影响示意图(n＝3，纵坐标为SOD1活性，单位为：U/mg)；

图4为咖啡酸肉桂酯对致损N2a细胞GPx1活性的影响示意图(n＝3，纵坐标为GPx1活性，单位为U/mg)；

图5为咖啡酸肉桂酯对致损N2a细胞NO含量的影响示意图(n＝3，纵坐标为NO含量，单位为：μmol/L)；

图6为咖啡酸肉桂酯对致损N2a细胞NOS活性的影响示意图(n＝3，纵坐标为NOS活力,单位为：U/mg)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

N2a细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，以一传三的方式进行传代保证细胞的持续生长，取对数生长期N2a细胞，消化后调整细胞密度为1×10⁵个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL细胞悬液，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，使细胞生长达到最佳状态。将N2a细胞随机分为正常组、模型组、咖啡酸肉桂酯组和川芎嗪(用于闭塞性血管疾病、脑血栓形成、脉管炎、冠心病、心绞痛等的药物成分)组。

各组进行如下处理：川芎嗪组及咖啡酸肉桂酯组分别以5μM，10μM，15μM的工作液孵育24h后，与模型组(不加样品，用DMEM高糖培养基孵育24h)一起进行OGD致N2a细胞缺血损伤：用无糖Earle液更换原来的培养基，并通以95％N₂、5％CO₂的混合气体，缺氧培养4h，继而以PBS清洗三次，用DMEM高糖培养基更换无糖Earles液，复氧(5％CO₂，95％O₂)，并在5％CO₂培养箱中孵育24h。正常组进行常规培养，不进行缺氧缺糖和复氧复糖处理。

各组按下述CCK-8法测定细胞相对存活率：在96孔板中加入CCK-8液，每孔10μL，放入CO₂培养箱中继续孵育1h，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。每组实验设置3个复孔，根据如下公式计算细胞存活率。

式中：A1为各实验组吸光值；A2为正常对照组吸光值；A0为调零孔吸光值。

结果如图1所示，OGD致损N2a细胞经不同浓度咖啡酸肉桂酯处理后，细胞存活率均有大幅提高；咖啡酸肉桂酯在低浓度下与模型组显示有显著性差异(P<0.05)，在中高浓度下与模型组显示有极显著差异(P<0.01)，说明咖啡酸肉桂酯具有较好的抗缺血再灌注损伤的活性。

实施例2

一种包含咖啡酸肉桂酯的脑缺血再灌注抑制剂，所述抑制剂为注射剂，由咖啡酸肉桂酯和注射用水组成。

经检测，所述抑制剂对脑缺血再灌注具有良好的抑制作用。

实施例3

一种包含咖啡酸肉桂酯的神经细胞保护剂，所述抑制剂为片剂，以咖啡酸肉桂酯、淀粉、糊精和羧甲基纤维素钠为原料制备而成。

经检测，所述抑制剂对神经元具有良好的保护作用。

实验例

(1)N2a细胞中CAT活性检测

取对数期N2a细胞，以5×10⁴个/mL接种于24孔板，预孵育12h后用于实验。各组进行如下处理：川芎嗪组及咖啡酸肉桂酯组分别以7.5μM，15μM，30μM的工作液孵育24h后，与模型组(不加样品，用DMEM高糖培养基孵育24h)一起进行OGD致N2a细胞缺血损伤：用无糖Earle液更换原来的培养基，并通以95％N₂、5％CO₂的混合气体，缺氧培养4h，继而以PBS清洗三次，用DMEM高糖培养基更换无糖Earles液，复氧(5％CO₂，95％O₂)，并在5％CO₂培养箱中孵育24h。正常组进行常规培养，不进行缺氧缺糖和复氧复糖处理。孵育结束后，弃细胞培养上清液，向24孔板中每孔加入0.5mL 1％的triton×100裂解细胞，充分吹打均匀后收集，2500r/min离心10min，裂解液取上清用于测定实验。

按照过氧化氢酶(CAT)的检测试剂盒里面的说明书进行有关的检测：

各个标准样品及样本OD值减去空白的OD值后作出图来。用标准样品的浓度作为纵坐标，OD值作为横坐标，描绘出标准曲线，得到回归方程y＝1235.1x-113.53，相关系数R²＝0.9952。然后把样品的OD值代入到方程式当中，进而计算出样品的浓度，然后再乘以稀释的倍数，就能得到样品的原始浓度。

检测结果如图2所示。由图2所示结果可知，咖啡酸肉桂酯可提高OGD/R致损N2a细胞中CAT的活性。

(2)N2a细胞中SOD1活性检测

按照“(1)N2a细胞中CAT活性检测”所述方法收集完细胞上清液后，再按照超氧化物歧化酶1(SOD1)检测试剂盒里的说明书进行后续的检测：

将SOD1抗体包埋在于96孔板上，制作成为固相载体，向各个孔中分别加上标准样品，里面的SOD1与连接在固体载体上面的抗体进行结合，然后再加进去生物素化的SOD1抗体，洗净没有结合上去的生物素化抗体，再加上HRP标记着的亲和素，再一次彻底的清洗后再加上TMB底物显色剂。TMB在过氧化物酶的作用下变化成蓝色，同时在酸的作用下变化成最后的黄色。颜色的深浅变化和样品里面的SOD1含量呈现正相关。最后用酶标仪在450nm波长处检测吸光度(OD值)，最后计算样品的浓度。所得标准曲线为：y＝3.4662x-0.7475，相关系数是R²＝0.9745。

检测结果如图3所示。由图3所示结果可知，咖啡酸肉桂酯可提高OGD/R致损N2a细胞中SOD1的活性。

(3)N2a细胞中GPX1活性检测

按照“(1)N2a细胞中CAT活性检测”所述方法收集完细胞上清液后，然后按照谷胱甘肽过氧化酶1(GPX1)检测试剂盒的说明书进行下一步的检测：

将GPX1抗体制作成固相的载体，加入标准品，里面的GPX1与抗体结合，再加上生物素化了的GPX抗体，然后再将没有结合的生物素化抗体洗掉，再加入HRP标记的亲和素，再一次洗涤干净，再加上TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的作用下反应成蓝色，然后在酸性的作用下变化成最后的黄色。最后反应颜色的深浅度和样品里的GPX1活性呈现正相关性。最后要用酶标仪在450nm波长条件检测吸光度(OD值)，最后再计算样品的浓度。

绘制标准曲线：y＝7.0607x-1.7389，相关系数R²＝0.9649。将样品的OD数值代到方程式里面，得出样品的浓度，再乘以稀释倍数，就会得到样品的实际的浓度。

检测结果如图4所示。由图4所示结果可知，咖啡酸肉桂酯可提高OGD/R致损N2a细胞中GPX1的活性。

(4)细胞内NO含量检测

按照“(1)N2a细胞中CAT活性检测”所述方法收集完细胞上清液后，然后按照一氧化氮(NO)检测试剂盒里面的说明书进行下一步的检测，每个样品都重复3个。最后得到了回归方程：y＝248.93x+1.5823，相关系数R²＝0.9972。将检测到样品的OD值代入到方程式里面，得出样品的浓度，然后再乘稀释倍数，就是样品的浓度。

检测结果如图5所示。由图5所示结果可知，咖啡酸肉桂酯可降低OGD/R致损N2a细胞中NO的含量。

(5)细胞内NOS活性检测

按照“(1)N2a细胞中CAT活性检测”所述方法收集完细胞上清液后，严格按照一氧化氮合酶(NOS)检测试剂盒里面的说明书进行下一步的检测，每个样本都设置了3个重复孔。

取40ul的样品，加入双蒸水100ul，充分混合均匀后加到里面底物缓冲剂200ul、促进剂10ul和显色剂100ul，再一次充分的均匀混合后，在三十七摄氏度的条件下水浴十五分钟。将样品取出后再次加入透明剂100ul和终止剂2000ul，再次混合均匀，后530nm检测波长处检测吸光度。把得到的吸光度数值带入到公式里面计算NOS的活性。公式如下：

NOS活性(U/mL)＝[(测总NOS测定OD值-空白OD值)×反应液总体积]÷[呈色物纳摩尔消光系数×取样量×1000×比色光径×反应时间]。

检测结果如图6所示。由图6所示结果可知，咖啡酸肉桂酯可降低OGD致损N2a细胞中NOS的活性。

本领域中，SOD1和GPX1是细胞中清除ROS的重要的内源性抗氧化酶。CAT能够清除细胞中的过氧化氢，通过将过氧化氢分解成氧和水，从而保护细胞免受过氧化氢的侵害。NO是一氧化氮合酶(NOS)催化生成的一种自由基，广泛的存在神经组织当中。在大脑缺血的早期有着一定舒张血管的作用，改善脑组织中的血流，中断自由基的链式反应。然而若长时间缺血，NO则会抑制线粒体内超氧化物歧化酶的表达，也能诱导DNA的损伤，会使细胞最终走向死亡。

实验结果表明：咖啡酸肉桂酯对OGD/R致损的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞进行干预后，能够显著增强OGD/R致损小鼠神经母细胞瘤N2a细胞内CAT、SOD1和GPX1的活性，并能降低细胞内NO含量和NOS活性。说明咖啡酸肉桂酯抗脑缺血再灌注性损伤的作用，可能是通过保护CAT、SOD1和GPX1的活性和降低细胞内NO含量和NOS活性来实现的。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。